Medicamentos direcionados como cetuximabe e panitumumabe têm sido amplamente utilizados na clínica como medicamentos terapêuticos eficazes para o câncer colorretal. Os dados clínicos mostram que os pacientes com mutações KRAS não têm efeito significativo sobre este medicamento de anticorpo monoclonal, e apenas os pacientes do tipo selvagem podem se beneficiar dele. Portanto, o status de mutação do gene KRAS é clinicamente considerado um importante marcador terapêutico, que tem forte correlação com o prognóstico e efeito do tratamento do câncer colorretal. As Diretrizes de Prática Clínica do Câncer Colorretal da National Cancer Comprehensive Network (NCCN) de 2009 estipulam que todos os pacientes com câncer colorretal metastático devem detectar o status de mutação do gene KRAS, e apenas o tipo selvagem do KRAS é recomendado para receber terapia direcionada ao EGFR. No mesmo ano, a Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) também emitiu as mesmas recomendações de tratamento clínico como marcador molecular para terapia direcionada a tumores, o que mostra seu importante significado orientador. Atualmente, os testes genéticos KRAS têm sido amplamente realizados clinicamente. Avaliamos principalmente os métodos domésticos de detecção de mutação do gene KRAS para referência na seleção clínica.
1. A taxa positiva de mutação do gene KRAS no câncer colorretal
No câncer colorretal, a taxa de mutação do gene KRAS é de 35% a 45%, e o local de mutação de alto risco são os códons 12 e 13 no exon 2, e ainda existem alguns raros, como 61 e 146. Mutação local. Existem muitos métodos de detecção para mutações do gene KRAS, incluindo sequenciamento direto, análise de curva de fusão de alta resolução (HRM), pirosequenciamento, PCR quantitativo, sistema de bloqueio de amplificação de mutação (amplinc atio) sistema de mutação nrefratária (ARMS), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), reação em cadeia da polimerase - análise de polimorfismo de conformação de fita simples (PCR-polimorfismo de confomação de cadeia simples (PCR-SSCP), co-amplificação em PCR de baixa temperatura de desnaturação (COLD-PCR) e análise de cromatografia líquida de alto desempenho, etc.
2. Avaliação dos métodos de detecção de mutação KRAS
1. Método de sequenciamento direto: é o método mais clássico para detectar mutações do gene KRAS e também é o padrão ouro para detectar mutações do gene. O método de sequenciação direta com base no princípio da sequenciação didesoxi pode mostrar de forma mais intuitiva a alteração da sequência do gene na forma de mapa de pico de base. O tipo de detecção é mais abrangente e também é o método de detecção de mutação aplicado mais cedo. Apesar do surgimento de plataformas de sequenciamento de nova geração, estudiosos em casa e no exterior ainda usam os resultados do sequenciamento direto como uma escala para medir e determinar a confiabilidade do novo método. Gao Jing et ai. Sequenciamento direto aplicado à detecção de mutações nos genes KRAS e BRAF em 966 pacientes com câncer colorretal. Esta é também a análise da mutação do gene KRAS com a maior amostra doméstica relatada na literatura. Ling Yun e outros acreditam que o método de sequenciamento direto é o método de detecção mais direto e eficaz para entender o estado de mutação de cada gene, o que pode esclarecer o tipo de mutação, especialmente para a detecção de mutações desconhecidas. Embora a sensibilidade desse método seja relativamente baixa, ele pode ser melhorado por métodos como a microdissecção para enriquecer as células tumorais. O método de sequenciamento direto também foi aplicado à detecção KRAS de tamanhos de amostra maiores em outros grupos de pesquisa nacionais. No entanto, menor sensibilidade é a maior desvantagem do sequenciamento direto. A julgar pelos resultados relatados na China, a taxa de detecção de mutação por sequenciamento direto não é baixa. Liu Xiaojing e outros. Comparou o sequenciamento direto e o peptídeo nucleic acid clamp PCR (PNA-PCR) e constatou que 43 casos de mutações no gene KRAS foram detectados por sequenciamento direto. Além dessas mutações, o PNA-PCR também foi detectado por sequenciamento direto. Dez mutações foram encontradas no tipo selvagem, e sugestões foram feitas para determinar os pacientes do tipo selvagem por PCR e o método de sequenciamento direto para determinar os pacientes mutantes. Qiu Tian et ai. Detectou 131 amostras de câncer colorretal pelo método de sonda oligonucleotídica otimizada por PCR fluorescente e método de sequenciamento direto, e as taxas positivas de mutações do gene KRAS foram de 41.2% (54/131) e 40.5% (53/131)). Bai Dongyu também discutiu a sensibilidade de detecção de diferentes métodos. Dos 200 pacientes com câncer colorretal, 63 foram detectados por mutações RT-qPCR, e a taxa de detecção de mutação foi de 31.5%; 169 amostras foram sequenciadas com sucesso por sequenciamento direto 50 casos de mutação, taxa de detecção de mutação de 29.6%. Embora o método de sequenciamento direto possa detectar com precisão, objetiva e especificamente o status de mutação do gene KRAS, suas deficiências, como altos requisitos técnicos, procedimentos de operação complicados, fácil de causar contaminação cruzada e interpretação demorada e trabalhosa dos resultados também são muito óbvio. Muitas vezes não existe um equipamento de sequenciamento, e o corpo de prova precisa ser enviado para a empresa correspondente para teste, o que é demorado e tem um custo alto, por isso tem grandes limitações.
Método de pirosequenciamento:
O método de pirosequenciamento também é um método mais conveniente para a detecção de mutação do gene KRAS em termos de sensibilidade de sequenciamento, custo de detecção e tempo para relatar. A repetibilidade desse método é melhor. De acordo com o mapa de pico obtido O estudo quantitativo da frequência de mutação de um determinado local e a comparação entre as frequências de mutação de diferentes locais são claros à primeira vista. Nos últimos anos, Ogino et al., Hutchins et al. Usei a tecnologia de pirosequenciamento para testar as mutações do KRAS em pacientes com grandes amostras de câncer colorretal. Os resultados indicam que a tecnologia de pirosequenciamento é uma ferramenta poderosa para a triagem de pacientes para terapia direcionada. O diagnóstico molecular do tumor tem amplas perspectivas de aplicação. Estudiosos nacionais também usaram a tecnologia de pirosequenciamento para detectar clinicamente as mutações do KRAS no câncer colorretal, com boa precisão e confiabilidade. Este método tem melhor especificidade e maior sensibilidade. Sundström et al. Comparou PCR alélico-específico e pirosequenciamento em aplicações clínicas e descobriu que em 314 casos de mutações KRAS em pacientes com câncer colorretal, a especificidade do pirosequenciamento foi superior à dos alelos. PCR e tem boa sensibilidade a tecidos com baixo conteúdo de células tumorais. Diluir a proporção de células tumorais para 1.25% a 2.5%. A pirosequenciamento ainda pode detectar sinais de mutação. Quando o conteúdo mínimo de alelos mutantes na amostra precisa atingir 20% para ser detectado pelo sequenciamento Sanger, ele pode ser detectado pelo método HRM quando atinge 10%, e para o pirosequenciamento apenas mutações podem ser detectadas em 5%. Alelos. Usamos o pirosequenciamento para detectar mutações no KRAS em 717 pacientes com câncer colorretal e descobrimos que a frequência das mutações no KRAS foi de 40.9%. A taxa de mutação do códon 12 foi de 30.1%, a taxa de mutação do códon 13 foi de 9.8% e a taxa de mutação do códon 61 foi de 1.0%. Nós enriquecemos os tecidos com maior conteúdo tumoral por microdissecção manual antes do teste, tornando os resultados mais confiáveis. O método tem boa sensibilidade e especificidade e é fácil de desenvolver na prática clínica. A desvantagem do pirosequenciamento é o alto custo de detecção e o processo de preparação de DNA de fita simples para sequenciamento de amostras é complicado. No futuro, o pirosequenciamento pode ser dedicado ao desenvolvimento de tecnologia para detecção direta de produtos de PCR de fita dupla, o que simplificará muito a operação. E reduza efetivamente o custo do sequenciamento para obter uma promoção abrangente dos testes clínicos.
3. Método ARMS:
Esta tecnologia usa primers para distinguir entre genes do tipo selvagem e mutantes, que
Isso foi relatado já na década de 1980. A maior vantagem desse método é que ele tem uma sensibilidade de até 1.0% e pode detectar genes mutantes em amostras tão baixas quanto 1.0%. No projeto, o comprimento do produto alvo pode ser reduzido ao máximo, e o problema de resultados de detecção precisos não podem ser obtidos porque a maior parte do DNA extraído da amostra de tecido embebido em parafina está fragmentado. Esta tecnologia combina a plataforma de PCR em tempo real para alcançar a operação de tubo fechado durante a amplificação. A operação é simples e não requer pós-processamento do produto, o que pode evitar ao máximo a contaminação do produto amplificado. Atualmente, o método scorpion-ARMS que combina a sonda scorpion e o sistema de mutação de bloco de amplificação é mais comumente usado no mundo. A combinação das duas tecnologias pode maximizar a sensibilidade e especificidade de ambos os lados. Gao Jie et al. Usou este método para detectar o status de mutação do gene KRAS em 167 pacientes com câncer colorretal, sugerindo que este método é confiável e preciso. Wang Hui et al. Também usou ARMS para detectar mutações KRAS em 151 casos de tecidos fixados com formaldeído e incluídos em parafina. Nos Estados Unidos, o kit COBAS (Roche) aprovado pelo FDA para testes clínicos de KRAS e o kit Therascreen RGQ (Qiagen) certificado pela União Europeia In Vitro Diagnostics (CE-IVD) usam o princípio ARMS. Entre os métodos comuns, o método ARMS é o mais sensível e o custo é relativamente razoável. Portanto, grande parte da detecção clínica de genes KRAS em casa e no exterior está usando o método ARMS, mas como o método é baseado na tecnologia de PCR, sua lacuna é que só podem ser detectadas mutações em locais conhecidos.
4. Método de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real:
É um método de detecção baseado em PCR para determinar a mutação pelo valor Ct. Tem as vantagens de forte especificidade, alta sensibilidade, quantificação precisa, fácil operação e reação totalmente fechada. Muitos grupos experimentais adotaram este método para a detecção de mutações KRAS no câncer colorretal. Comparado com o método de sequenciamento direto, o PCR quantitativo ocupa uma vantagem maior em sensibilidade. A maioria dos estudiosos que comparam os dois métodos acredita que a PCR quantitativa é mais sensível. Liu Wei et al. Utilizaram dois métodos para fazer uma análise detalhada dos resultados de detecção de 280 casos de mutações do gene KRAS de câncer colorretal, 94 casos de mutações de sequenciamento do gene KRAS, a taxa positiva foi de 33.57% (94/280), dos quais, fluorescência em tempo real quantitativa A PCR foi positiva em 91 casos com sensibilidade de 96.8% (91/94). Dos 186 casos de sequenciamento genético do tipo selvagem, 184 foram negativos por PCR quantitativa em tempo real, com especificidade de 98.9% (184/186). A taxa de coincidência entre o método de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real e o método de sequenciamento direto de genes foi de 98.2%. Nos dois métodos de detecção, as taxas de coincidência positiva e negativa de cada sítio de mutação foram superiores a 90%, e a taxa de coincidência de quatro sítios atingiu 100%. Os resultados de detecção dos dois métodos foram altamente consistentes, indicando que a PCR quantitativa fluorescente é um método mais confiável para detecção de mutações. No entanto, os métodos baseados em PCR necessitam de conceber iniciadores e sondas com base em tipos de mutação conhecidos, de modo que todas as mutações possíveis não possam ser detectadas e apenas locais específicos possam ser detectados. Se um determinado local não estiver incluído na faixa de detecção do kit, mesmo que haja realmente uma mutação, o resultado do kit ainda será negativo. Além disso, embora a sensibilidade da PCR quantitativa seja alta, se há falsos positivos ainda precisa ser verificado pela tecnologia de sequenciamento de DNA ou por experimentos clínicos retrospectivos e prospectivos com grandes tamanhos de amostra para confirmar a correlação entre o status da mutação KRAS e a eficácia do alvo. drogas . Portanto, a alta sensibilidade da detecção de mutações não deve ser perseguida cegamente, enquanto a especificidade e a precisão da detecção devem ser ignoradas. Sob diferentes condições laboratoriais, o método ideal para detecção de mutações em amostras também pode ser diferente. Para amostras com maior proporção de mutações, o método de sequenciamento Sanger tem maior precisão na detecção de mutações genéticas, enquanto para amostras com menor proporção de mutações, o método de sequenciamento Sanger podem ocorrer falsos negativos e o método de detecção usando PCR fluorescente como plataforma técnica pode ser caracterizado por alta sensibilidade.
5. Método de HRM:
É um dos métodos de detecção de genes mais comumente usados nos últimos anos. Tem as vantagens de um tubo simples, rápido, sensível e único para evitar a poluição. A fim de explorar a viabilidade de seu uso em testes clínicos, Liu Liqin e outros usaram o método HRM para detectar mutações no gene KRAS em 64 pacientes com câncer colorretal e, em seguida, usaram o sequenciamento direto para verificar os resultados. Os resultados de HRM e sequenciamento direto são considerados consistentes. Em comparação com o sequenciamento direto, a detecção de mutações do gene KRAS por HRM é simples e precisa, sugerindo que é um método confiável adequado para testes clínicos. Chen Zhihong et al. Usou o método HRM para testar uma série de amostras misturadas contendo diferentes proporções de plasmídeos mutantes KRAS para avaliar sua sensibilidade. Verificou-se que a proporção de mutações plasmídicas nas amostras mistas foi de 10%, e a sensibilidade atingiu 10%. Posteriormente, o método foi usado para detectar mutações no gene KRAS em 60 amostras de tecido de câncer colorretal. Em comparação com o método de sequenciamento direto, a sensibilidade do método HRM foi de 100% e a especificidade foi de 96% (43/45). A desvantagem do método HRM é que é impossível fornecer com precisão o tipo de mutação específico e qual códon está mutado. Se uma anormalidade for encontrada na curva de fusão, o método de sequenciamento é necessário para determinar o tipo de mutação. O grupo de pesquisa Harlé usou 156 casos de tecido de câncer colorretal para comparar os métodos de PCR fluorescente, ARMS e HRM. Os resultados sugerem que, embora os três métodos sejam adequados para testes clínicos, a confiabilidade do HRM não é tão boa quanto os outros dois métodos.
6. Outros métodos:
Além dos métodos mencionados acima, outros métodos de detecção têm suas próprias vantagens e desvantagens na aplicação, tais como PCR-SSCP, cromatografia líquida de alto desempenho, método de sonda de oligonucleotídeo otimizado para PCR fluorescente, Método de PCR nested e combinação ARMS, COLD-PCR método, etc. A cromatografia líquida de alto desempenho tem forte especificidade, mas a demanda por amostras é grande; O PCR-SSCP é de baixo custo e econômico, mas a operação é complicada; a tecnologia de detecção de mutação baseada em PCR fluorescente tem forte especificidade, alta sensibilidade e quantitativo preciso, operação fácil, reação totalmente bloqueada e outras vantagens, mas todos precisam projetar primers e sondas de acordo com o tipo de mutação conhecido, portanto, apenas locais específicos podem ser detectados, e todas as mutações possíveis não podem ser detectadas.
3. Resumo
Em resumo, como os sítios de mutação e os métodos de detecção em diferentes laboratórios não são uniformes, o tamanho das amostras tumorais analisadas e a qualidade da extração de DNA também são desiguais, resultando na existência de grandes ou pequenos resultados experimentais entre laboratórios. Diferenças, a padronização de detecção de mutação do gene KRAS tornou-se um problema de detecção clínica de preocupação em vários países. Atualmente, existem muitos métodos para detectar mutações no gene KRAS. A sensibilidade de alta a baixa é ARMS, pirosequenciamento, HRM, PCR quantitativo em tempo real e sequenciamento direto. Pela realidade clínica, a baixa sensibilidade não conduz ao tratamento clínico, mas métodos muito sensíveis farão com que a especificidade da detecção diminua, e resultados falso-positivos desnecessários podem ocorrer e afetar o regime de medicação subsequente do paciente. Considerando os aspectos acima, aliados ao método aprovado pelo FDA, o método ARMS é recomendado. Claro, de uma perspectiva de mercado, o diagnóstico molecular não deve me enfatizar
métodos, mas concentre-se nos resultados finais corretos. Diferentes laboratórios podem adotar métodos de teste apropriados de acordo com a situação real, mas somente se tiverem boas qualificações de operador e sistemas internos de controle de qualidade. Sob as atuais condições ambientais de laboratório doméstico, é necessário realizar testes em um laboratório de PCR padronizado e participar de atividades de controle de qualidade domésticas e internacionais entre salas para garantir a qualidade confiável dos testes laboratoriais. A gestão padronizada é condição necessária para garantir resultados constantes. Na China, há uma necessidade urgente de unificar e padronizar os testes clínicos do gene KRAS, e gerar um programa de testes padronizados e padronizados de acordo com as diferentes necessidades, podendo este programa ser estendido para a detecção de BRAF, PIK23450_3CA, EGFR e outros genes para promover testes de patologia molecular clínica.
