Doelgerichte geneesmiddelen zoals cetuximab en panitumumab worden in de kliniek op grote schaal gebruikt als effectieve therapeutische geneesmiddelen voor colorectale kanker. Klinische gegevens tonen aan dat patiënten met KRAS-mutaties geen significant effect hebben op dit monoklonale antilichaamgeneesmiddel, en dat alleen wildtype-patiënten hiervan kunnen profiteren. Daarom wordt de KRAS-genmutatiestatus klinisch beschouwd als een belangrijke therapeutische marker, die een sterke correlatie heeft met de prognose en het behandelingseffect van colorectale kanker. De National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines uit 2009 bepalen dat alle patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker de KRAS-genmutatiestatus moeten detecteren, en alleen het wildtype KRAS wordt aanbevolen om op EGFR gerichte therapie te krijgen. In hetzelfde jaar bracht de American Society of Clinical Oncology (ASCO) ook dezelfde klinische behandelaanbevelingen uit als een moleculaire marker voor tumorgerichte therapie, wat de belangrijke richtinggevende betekenis ervan aantoont. Momenteel worden KRAS-genetische tests op grote schaal klinisch uitgevoerd. We evalueren voornamelijk de binnenlandse KRAS-genmutatiedetectiemethoden ter referentie bij klinische selectie.
1. Het positieve percentage van KRAS-genmutatie bij colorectale kanker
Bij colorectale kanker is de mutatiesnelheid van het KRAS-gen zo hoog als 35% tot 45%, en de risicovolle mutatieplaats is codons 12 en 13 op exon 2, en er zijn nog steeds zeldzame zoals 61 en 146. Mutatie site. Er zijn veel detectiemethoden voor KRAS-genmutaties, waaronder directe sequentiebepaling, smeltcurve-analyse met hoge resolutie (HRM), pyrosequentiebepaling, kwantitatieve PCR, mutatie-amplificatiebloksysteem (amplinc atio) refractorymutatiesysteem (ARMS), restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP), polymerasekettingreactie-enkelstrengs conformatie polymorfisme analyse (PCR-singlestrand confomatie polymorfisme (PCR-SSCP), co-amplificatie bij lagere denaturatietemperatuur PCR (COLD-PCR) en high-performance vloeistofchromatografie analyse, enz.
2. Evaluatie van KRAS-mutatiedetectiemethoden
1. Directe sequencing-methode: het is de meest klassieke methode voor het detecteren van KRAS-genmutaties, en het is ook de gouden standaard voor het detecteren van genmutaties. De directe sequencing-methode op basis van het principe van dideoxy-sequencing kan het meest intuïtief de verandering van gensequentie laten zien in de vorm van een basispiekkaart. Het detectietype is uitgebreider en het is ook de vroegst toegepaste mutatiedetectiemethode. Ondanks de opkomst van nieuwe generatie sequencing-platforms, gebruiken wetenschappers in binnen- en buitenland de resultaten van directe sequencing nog steeds als een schaal om de betrouwbaarheid van de nieuwe methode te meten en te bepalen. Gao Jing et al. Directe sequencing toegepast op de detectie van KRAS- en BRAF-genmutaties bij 966 patiënten met colorectale kanker. Dit is ook de analyse van de KRAS-genmutatie met het grootste binnenlandse monster dat in de literatuur wordt gerapporteerd. Ling Yun en anderen zijn van mening dat de directe sequentiemethode de meest directe en effectieve detectiemethode is om de mutatiestatus van elk gen te begrijpen, wat het type mutatie kan ophelderen, vooral voor de detectie van onbekende mutaties. Hoewel de gevoeligheid van deze methode relatief laag is, kan deze worden verbeterd door methoden zoals microdissectie om tumorcellen te verrijken. De directe sequencing-methode is ook toegepast op de KRAS-detectie van grotere steekproeven in andere binnenlandse onderzoeksgroepen. Een lagere gevoeligheid is echter het grootste nadeel van directe sequencing. Afgaande op de resultaten die in China zijn gerapporteerd, is het detectiepercentage van mutaties door middel van directe sequentiebepaling niet laag. Liu Xiaojing et al. Vergelijking van directe sequentiebepaling en peptidenucleïnezuurklem-PCR (PNA-PCR) en ontdekte dat 43 gevallen van KRAS-genmutaties werden gedetecteerd door directe sequentiebepaling. Naast deze mutaties werd PNA-PCR ook gedetecteerd door middel van directe sequentiebepaling. Er werden tien mutaties gevonden in het wildtype en er werden suggesties gedaan om de wildtype-patiënten te bepalen door middel van PCR en de directe sequentiemethode om de mutante patiënten te bepalen. Qiu Tian et al. Detecteerde 131 colorectale kankermonsters met behulp van de fluorescerende PCR-geoptimaliseerde oligonucleotide-sondemethode en directe sequentiemethode, en de positieve percentages van KRAS-genmutaties waren 41.2% (54/131) en 40.5% (53/131)). Bai Dongyu besprak ook de detectiegevoeligheid van verschillende methoden. Van de 200 dikkedarmkankerpatiënten werden 63 gedetecteerd door RT-qPCR-mutaties en het detectiepercentage van mutaties was 31.5%; 169 monsters werden met succes gesequenced door directe sequencing van 50 gevallen van mutatie, mutatiedetectiepercentage 29.6%. Hoewel de directe sequentiemethode nauwkeurig, objectief en specifiek de mutatiestatus van het KRAS-gen kan detecteren, zijn de tekortkomingen, zoals hoge technische vereisten, gecompliceerde bedieningsprocedures, gemakkelijk te veroorzaken kruisbesmetting en tijdrovende en bewerkelijke interpretatie van de resultaten, ook erg voor de hand liggend. Vaak is er geen sequentieapparatuur en moet het monster voor testen naar het desbetreffende bedrijf worden gestuurd, wat lang duurt en hoge kosten met zich meebrengt, dus het heeft grote beperkingen.
Pyrosequencing-methode:
Pyrosequencing-methode is ook een handigere methode voor de detectie van KRAS-genmutaties in termen van sequentiegevoeligheid, detectiekosten en tijd om te rapporteren. De herhaalbaarheid van deze methode is beter. Volgens de verkregen piekkaart De kwantitatieve studie van de mutatiefrequentie van een bepaalde site en de vergelijking tussen de mutatiefrequenties van verschillende sites zijn in één oogopslag duidelijk. In de afgelopen jaren hebben Ogino et al., Hutchins et al. Pyrosequencing-technologie hebben gebruikt om KRAS-mutaties te testen bij patiënten met grote monsters van colorectale kanker. De resultaten geven aan dat pyrosequencing-technologie een krachtig hulpmiddel is om patiënten te screenen op gerichte therapie. Tumor moleculaire diagnose heeft brede toepassingsmogelijkheden. Binnenlandse wetenschappers hebben ook pyrosequencing-technologie gebruikt om KRAS-mutaties bij colorectale kanker klinisch te detecteren, met een goede nauwkeurigheid en betrouwbaarheid. Deze methode heeft een betere specificiteit en een hogere gevoeligheid. SundstrÖm et al. Vergelijking van allelspecifieke PCR en pyrosequencing in klinische toepassingen en ontdekte dat in 314 gevallen van KRAS-mutaties bij colorectale kankerpatiënten de specificiteit van pyrosequencing superieur was aan die van allelen. PCR, en heeft een goede gevoeligheid voor weefsels met een laag gehalte aan tumorcellen. Verdun het aandeel tumorcellen tot 1.25% tot 2.5%. Pyrosequencing kan nog steeds mutatiesignalen detecteren. Wanneer het minimumgehalte aan mutante allelen in het monster 20% moet bereiken om te worden gedetecteerd door Sanger-sequencing, kan het worden gedetecteerd door de HRM-methode wanneer het 10% bereikt, en voor pyrosequencing kunnen alleen mutaties worden gedetecteerd met 5%. Allelen. We gebruikten pyrosequencing om KRAS-mutaties te detecteren bij 717 patiënten met colorectale kanker en ontdekten dat de frequentie van KRAS-mutaties 40.9% was. De mutatiesnelheid van codon 12 was 30.1%, de mutatiesnelheid van codon 13 was 9.8% en de mutatiesnelheid van codon 61 was 1.0%. We verrijkten de weefsels met een hoger tumorgehalte door handmatige microdissectie vóór het testen, waardoor de resultaten betrouwbaarder werden. De methode heeft een goede sensitiviteit en specificiteit, en is gemakkelijk te ontwikkelen in de klinische praktijk. Het nadeel van pyrosequencing zijn de hoge detectiekosten, en het proces van het bereiden van enkelstrengs DNA voor het sequencen van monsters is omslachtig. In de toekomst kan pyrosequencing worden besteed aan de ontwikkeling van technologie voor directe detectie van dubbelstrengige PCR-producten, wat de operatie aanzienlijk zal vereenvoudigen. En verlaag effectief de kosten van sequencing om een uitgebreide promotie van klinische tests te bereiken.
3. ARMS-methode:
Deze technologie maakt gebruik van primers om onderscheid te maken tussen wildtype en mutante genen, wh
ich is al in de jaren tachtig gerapporteerd. Het grootste voordeel van deze methode is dat het een gevoeligheid heeft tot 1980% en mutante genen kan detecteren in monsters van slechts 1.0%. In ontwerp kan de lengte van het doelproduct zo veel mogelijk worden verkort, en het probleem dat nauwkeurige detectieresultaten niet kunnen worden verkregen omdat het meeste DNA dat uit het in paraffine ingebedde weefselspecimen wordt geëxtraheerd, gefragmenteerd is. Deze technologie combineert het real-time PCR-platform om tijdens versterking een werking met een gesloten buis te bereiken. De bediening is eenvoudig en vereist geen nabewerking van het product, waardoor de besmetting van het geamplificeerde product zoveel mogelijk kan worden vermeden. Op dit moment wordt de scorpion-ARMS-methode, die scorpion-probe en amplificatieblokmutatiesysteem combineert, meer algemeen gebruikt in de wereld. De combinatie van de twee technologieën kan de gevoeligheid en specificiteit van beide kanten maximaliseren. Gao Jie et al. Gebruikte deze methode om de KRAS-genmutatiestatus te detecteren bij 1.0 patiënten met colorectale kanker, wat suggereert dat deze methode betrouwbaar en nauwkeurig is. Wang Hui et al. Gebruikt ook ARMS om KRAS-mutaties te detecteren in 167 gevallen van formaldehyde-gefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels. In de Verenigde Staten gebruiken de COBAS-kit (Roche) die is goedgekeurd door de FDA voor klinische tests van KRAS en de Therascreen RGQ-kit (Qiagen) die is gecertificeerd door de Europese Unie In Vitro Diagnostics (CE-IVD), allemaal het ARMS-principe. Van de gangbare methoden is de ARMS-methode de meest gevoelige en zijn de kosten relatief redelijk. Daarom maakt een groot deel van de klinische detectie van KRAS-genen in binnen- en buitenland gebruik van de ARMS-methode, maar omdat de methode gebaseerd is op PCR-technologie, is de tekortkoming dat er alleen Known site-mutaties kunnen worden gedetecteerd.
4. Real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-methode:
Het is een op PCR gebaseerde detectiemethode om de mutatie te bepalen aan de hand van de Ct-waarde. Het heeft de voordelen van sterke specificiteit, hoge gevoeligheid, nauwkeurige kwantificering, eenvoudige bediening en volledig gesloten reactie. Veel experimentele groepen hebben deze methode overgenomen voor de detectie van KRAS-mutaties bij colorectale kanker. Vergeleken met de directe sequencing-methode heeft kwantitatieve PCR een groter voordeel wat betreft gevoeligheid. De meeste wetenschappers die de twee methoden vergelijken, zijn van mening dat kwantitatieve PCR gevoeliger is. Liu Wei et al. Gebruikte twee methoden om een gedetailleerde analyse te maken van de detectieresultaten van 280 gevallen van KRAS-genmutaties in colorectale kanker, 94 gevallen van KRAS-gensequencing-mutaties, het positieve percentage was 33.57% (94/280), waarvan realtime kwantitatieve fluorescentie PCR was positief. 91 gevallen hadden een gevoeligheid van 96.8% (91/94). Van de 186 wildtype gevallen van gensequencing waren er 184 negatief met realtime kwantitatieve PCR, met een specificiteit van 98.9% (184/186). Het toevalspercentage tussen de realtime fluorescentie-kwantitatieve PCR-methode en de directe gensequencing-methode was 98.2%. In de twee detectiemethoden waren de positieve en negatieve coïncidentiepercentages van elke mutatieplaats hoger dan 90%, en bereikte het coïncidentiepercentage van vier locaties 100%. De detectieresultaten van de twee methoden waren zeer consistent, wat erop wijst dat fluorescente kwantitatieve PCR een betrouwbaardere methode is voor mutatiedetectie. Op PCR gebaseerde methoden moeten echter primers en probes ontwerpen op basis van bekende mutatietypen, zodat niet alle mogelijke mutaties kunnen worden gedetecteerd en alleen specifieke plaatsen kunnen worden gedetecteerd. Als een bepaalde locatie niet binnen het detectiebereik van de kit valt, zelfs als er daadwerkelijk sprake is van een mutatie, is het kitresultaat nog steeds negatief. Hoewel de gevoeligheid van kwantitatieve PCR hoog is, moet bovendien nog worden geverifieerd of er sprake is van valse positieven door middel van DNA-sequencingtechnologie, of door retrospectieve en prospectieve klinische experimenten met grote steekproeven om de correlatie tussen de KRAS-mutatiestatus en de werkzaamheid van doelgerichte PCR-onderzoeken te bevestigen. drugs . Daarom mag de hoge gevoeligheid van mutatiedetectie niet blindelings worden nagestreefd, terwijl de specificiteit en nauwkeurigheid van detectie moeten worden genegeerd. Onder verschillende laboratoriumomstandigheden kan de optimale methode voor mutatiedetectie in monsters ook verschillen. Voor specimens met een groter aandeel mutaties heeft de Sanger-sequencing-methode een hogere nauwkeurigheid bij het detecteren van genmutaties, terwijl voor specimens met een lager percentage mutaties de Sanger-sequencing-methode fout-negatieven kan voorkomen, en de detectiemethode gebruikmaakt van fluorescente PCR als technisch platform kan worden gekenmerkt door een hoge gevoeligheid.
5. HRM-methode:
Het is een van de meest gebruikte gendetectiemethoden van de afgelopen jaren. Het heeft de voordelen van een eenvoudige, snelle, gevoelige en enkele buis om vervuiling te voorkomen. Om de haalbaarheid van het gebruik ervan bij klinische tests te onderzoeken, gebruikten Liu Liqin en anderen de HRM-methode om KRAS-genmutaties te detecteren bij 64 patiënten met colorectale kanker, en vervolgens gebruikten ze directe sequentiebepaling om de resultaten te verifiëren. De resultaten van HRM en directe sequencing blijken consistent te zijn. In vergelijking met directe sequencing is de detectie van KRAS-genmutaties door HRM eenvoudig en nauwkeurig, wat suggereert dat het een betrouwbare methode is die geschikt is voor klinische tests. Chen Zhihong et al. Gebruikte de HRM-methode om een reeks gemengde monsters te testen die verschillende verhoudingen van KRAS-mutante plasmiden bevatten om hun gevoeligheid te evalueren. Er werd gevonden dat het aandeel plasmide-mutaties in de gemengde monsters 10% was en dat de gevoeligheid 10% bedroeg. Vervolgens werd de methode gebruikt om KRAS-genmutaties op te sporen in 60 weefselmonsters van colorectale kanker. Vergeleken met de directe sequentiemethode was de gevoeligheid van de HRM-methode 100% en de specificiteit 96% (43/45). Het nadeel van de HRM-methode is dat het onmogelijk is om nauwkeurig het specifieke mutatietype en welk codon gemuteerd te geven. Als er een afwijking wordt gevonden op de smeltcurve, is een sequentiemethode nodig om het mutatietype te bepalen. De onderzoeksgroep van Harlé gebruikte 156 gevallen van colorectaal kankerweefsel om fluorescerende PCR-, ARMS- en HRM-methoden te vergelijken. De resultaten suggereren dat hoewel de drie methoden geschikt zijn voor klinische tests, de betrouwbaarheid van HRM niet zo goed is als de andere twee methoden.
6. Andere methoden:
Naast de bovengenoemde methoden hebben andere detectiemethoden hun eigen voor- en nadelen bij de toepassing, zoals PCR-SSCP, hoogwaardige vloeistofchromatografie, fluorescerende PCR-geoptimaliseerde oligonucleotide-sondemethode, methode van geneste PCR- en ARMS-combinatie, COLD-PCR methode, enz. Krachtige vloeistofchromatografie heeft een sterke specificiteit, maar de vraag naar monsters is groot; PCR-SSCP is goedkoop en economisch, maar de werking is gecompliceerd; de mutatiedetectietechnologie op basis van fluorescerende PCR heeft een sterke specificiteit, hoge gevoeligheid en nauwkeurige kwantitatieve, eenvoudige bediening, volledig geblokkeerde reactie en andere voordelen, maar ze moeten allemaal primers en probes ontwerpen volgens het bekende mutatietype, dus alleen specifieke locaties kunnen worden gedetecteerd, en alle mogelijke mutaties kunnen niet worden gedetecteerd.
3. Overzicht
Samenvattend, omdat de mutatieplaatsen en detectiemethoden in verschillende laboratoria niet uniform zijn, zijn de grootte van de geanalyseerde tumorspecimens en de kwaliteit van de DNA-extractie ook ongelijk, wat resulteert in het bestaan van grote of kleine experimentele resultaten tussen laboratoria. Verschillen, de standaardisatie van KRAS-genmutatiedetectie is in verschillende landen een probleem van klinische detectie geworden. Momenteel zijn er veel methoden om mutaties in het KRAS-gen te detecteren. De gevoeligheid van hoog naar laag is ARMS, pyrosequencing, HRM, real-time kwantitatieve PCR en directe sequencing. Vanuit de klinische realiteit is een lage gevoeligheid niet bevorderlijk voor klinische behandeling, maar te gevoelige methoden zullen de detectiespecificiteit doen afnemen, en onnodige vals-positieve resultaten kunnen optreden en het daaropvolgende medicatieregime van de patiënt beïnvloeden. Gezien bovenstaande aspecten, gecombineerd met de door de FDA goedgekeurde methode, wordt de ARMS-methode aanbevolen. Vanuit marktperspectief mag moleculaire diagnostiek mij natuurlijk niet benadrukken
methoden, maar concentreer u op de uiteindelijke juiste resultaten. Verschillende laboratoria kunnen passende testmethoden toepassen op basis van de werkelijke situatie, maar alleen als ze over goede operatorkwalificaties en interne kwaliteitscontrolesystemen beschikken. Onder de huidige omgevingsomstandigheden van het binnenlandse laboratorium is het noodzakelijk om tests uit te voeren in een gestandaardiseerd PCR-laboratorium en deel te nemen aan binnenlandse en internationale kwaliteitscontroleactiviteiten tussen kamers om een betrouwbare laboratoriumtestkwaliteit te garanderen. Gestandaardiseerd beheer is een noodzakelijke voorwaarde om constante resultaten te garanderen. In China is er een dringende behoefte om de klinische tests van het KRAS-gen te verenigen en te standaardiseren, en om een gestandaardiseerd en gestandaardiseerd testprogramma te genereren op basis van verschillende behoeften, en dit programma kan worden uitgebreid tot de detectie van BRAF, PIK23450_3CA, EGFR en andere genen om klinische moleculaire pathologietesten te bevorderen.
