Obat-obatan yang menargetkan seperti cetuximab dan panitumumab telah banyak digunakan di klinik sebagai obat terapeutik yang efektif untuk kanker kolorektal. Data klinis menunjukkan bahwa pasien dengan mutasi KRAS tidak berpengaruh signifikan terhadap obat antibodi monoklonal ini, dan hanya pasien tipe liar yang dapat memanfaatkannya. Oleh karena itu, status mutasi gen KRAS secara klinis dianggap sebagai penanda terapeutik yang penting, yang memiliki korelasi kuat dengan prognosis dan efek pengobatan kanker kolorektal. Pedoman Praktik Klinik Kanker Kolorektal Jaringan Komprehensif Kanker Nasional (NCCN) 2009 menetapkan bahwa semua pasien dengan kanker kolorektal metastatik harus mendeteksi status mutasi gen KRAS, dan hanya tipe liar KRAS yang direkomendasikan untuk menerima terapi bertarget EGFR. Pada tahun yang sama, American Society of Clinical Oncology (ASCO) juga mengeluarkan rekomendasi pengobatan klinis yang sama sebagai penanda molekuler untuk terapi target tumor, yang menunjukkan signifikansi penuntunnya yang penting. Saat ini pengujian genetik KRAS telah banyak dilakukan secara klinis. Kami terutama mengevaluasi metode deteksi mutasi gen KRAS domestik untuk referensi dalam pemilihan klinis.
1. Tingkat positif mutasi gen KRAS pada kanker kolorektal
Pada kanker kolorektal laju mutasi gen KRAS setinggi 35% sampai 45%, dan lokasi mutasi yang berisiko tinggi adalah kodon 12 dan 13 pada ekson 2, dan masih terdapat yang langka seperti 61 dan 146. Mutasi situs. Ada banyak metode deteksi untuk mutasi gen KRAS, termasuk sekuensing langsung, analisis kurva lebur resolusi tinggi (HRM), pyrosequencing, PCR kuantitatif, sistem blok amplifikasi mutasi (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), restriksi panjang fragmen polimorfisme (RFLP), analisis polimorfisme konformasi untai-rantai polimerase (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), ko-amplifikasi pada suhu denaturasi rendah PCR (COLD-PCR) dan analisis kromatografi cair kinerja tinggi, dll.
2. Evaluasi metode deteksi mutasi KRAS
1. Metode sekuensing langsung: Ini adalah metode paling klasik untuk mendeteksi mutasi gen KRAS, dan juga merupakan standar emas untuk mendeteksi mutasi gen. Metode sekuensing langsung berdasarkan prinsip sekuensing dideoksi dapat secara intuitif menunjukkan perubahan sekuens gen dalam bentuk peta puncak dasar. Jenis deteksi lebih komprehensif, dan juga merupakan metode deteksi mutasi yang paling awal diterapkan. Meskipun munculnya platform sekuensing generasi baru, para sarjana di dalam dan luar negeri masih menggunakan hasil sekuensing langsung sebagai skala untuk mengukur dan menentukan keandalan metode baru. Gao Jing dkk. Menerapkan sekuensing langsung untuk mendeteksi mutasi gen KRAS dan BRAF pada 966 pasien dengan kanker kolorektal. Ini juga merupakan analisis mutasi gen KRAS dengan sampel domestik terbesar yang dilaporkan dalam literatur. Ling Yun dan yang lainnya percaya bahwa metode sekuensing langsung adalah metode deteksi yang paling langsung dan efektif untuk memahami status mutasi setiap gen, yang dapat memperjelas jenis mutasi, terutama untuk mendeteksi mutasi yang tidak diketahui. Meskipun sensitivitas metode ini relatif rendah, namun dapat ditingkatkan dengan metode seperti bedah mikro untuk memperkaya sel tumor. Metode pengurutan langsung juga telah diterapkan pada deteksi KRAS dari ukuran sampel yang lebih besar di kelompok penelitian domestik lainnya. Namun, sensitivitas yang lebih rendah adalah kerugian terbesar dari pengurutan langsung. Dilihat dari hasil yang dilaporkan di China, tingkat deteksi mutasi dengan pengurutan langsung tidak rendah. Liu Xiaojing dkk. Dibandingkan sekuensing langsung dan PCR penjepit asam nukleat peptida (PNA-PCR) dan ditemukan bahwa 43 kasus mutasi gen KRAS terdeteksi dengan sekuensing langsung. Selain mutasi ini, PNA-PCR juga terdeteksi dengan sekuensing langsung. Sepuluh mutasi ditemukan pada tipe liar, dan saran dibuat untuk menentukan pasien tipe liar dengan PCR dan metode sekuensing langsung untuk menentukan pasien mutan. Qiu Tian dkk. Terdeteksi 131 spesimen kanker kolorektal dengan metode probe oligonukleotida yang dioptimalkan dengan PCR fluoresen dan metode sekuensing langsung, dan tingkat positif mutasi gen KRAS adalah 41.2% (54/131) dan 40.5% (53/131)). Bai Dongyu juga membahas sensitivitas deteksi metode yang berbeda. Dari 200 pasien kanker kolorektal, 63 terdeteksi oleh mutasi RT-qPCR, dan tingkat deteksi mutasi adalah 31.5%; 169 sampel berhasil diurutkan dengan direct sequencing 50 kasus mutasi, tingkat deteksi mutasi 29.6%. Meskipun metode sekuensing langsung dapat secara akurat, obyektif dan spesifik mendeteksi status mutasi gen KRAS, kekurangannya seperti persyaratan teknis yang tinggi, prosedur operasi yang rumit, kontaminasi silang yang mudah menyebabkan, dan interpretasi hasil yang memakan waktu dan melelahkan juga sangat jelas. Seringkali tidak ada peralatan pengurutan, dan spesimen perlu dikirim ke perusahaan terkait untuk pengujian, yang membutuhkan waktu lama dan biaya tinggi, sehingga memiliki keterbatasan yang besar.
Metode pyrosequencing:
Metode pyrosequencing juga merupakan metode yang lebih nyaman untuk deteksi mutasi gen KRAS dalam hal sensitivitas sekuensing, biaya deteksi dan waktu pelaporan. Pengulangan metode ini lebih baik. Menurut peta puncak yang diperoleh, studi kuantitatif tentang frekuensi mutasi suatu situs dan perbandingan antara frekuensi mutasi dari situs yang berbeda sekilas terlihat jelas. Dalam beberapa tahun terakhir, Ogino et al., Hutchins et al. Telah menggunakan teknologi pyrosequencing untuk menguji mutasi KRAS pada pasien dengan sampel besar kanker kolorektal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa teknologi pyrosequencing adalah alat yang ampuh untuk skrining pasien untuk terapi yang ditargetkan. Diagnosis molekuler tumor memiliki prospek penerapan yang luas. Sarjana domestik juga telah menggunakan teknologi pyrosequencing untuk mendeteksi secara klinis mutasi KRAS pada kanker kolorektal, dengan akurasi dan reliabilitas yang baik. Metode ini memiliki spesifisitas yang lebih baik dan sensitivitas yang lebih tinggi. SundstrÖm dkk. Membandingkan PCR spesifik alel dan pyrosequencing dalam aplikasi klinis dan menemukan bahwa pada 314 kasus mutasi KRAS pada pasien kanker kolorektal, spesifisitas pyrosequencing lebih unggul daripada alel. PCR, dan memiliki kepekaan yang baik terhadap jaringan dengan kandungan sel tumor yang rendah. Encerkan proporsi sel tumor menjadi 1.25% hingga 2.5%. Pyrosequencing masih dapat mendeteksi sinyal mutasi. Ketika kandungan minimum alel mutan dalam sampel harus mencapai 20% untuk dideteksi dengan sekuensing Sanger, maka dapat dideteksi dengan metode HRM saat mencapai 10%, dan untuk pyrosequencing hanya dapat dideteksi mutasi sebesar 5%. Alel. Kami menggunakan pyrosequencing untuk mendeteksi mutasi KRAS pada 717 pasien kanker kolorektal dan menemukan bahwa frekuensi mutasi KRAS adalah 40.9%. Laju mutasi kodon 12 sebesar 30.1%, laju mutasi kodon 13 9.8%, dan laju mutasi kodon 61 1.0%. Kami memperkaya jaringan dengan kandungan tumor yang lebih tinggi melalui mikrodiseksi manual sebelum pengujian, sehingga hasilnya lebih dapat diandalkan. Metode ini memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang baik, serta mudah dikembangkan dalam praktik klinis. Kerugian dari pyrosequencing adalah tingginya biaya deteksi, dan proses persiapan DNA untai tunggal untuk sampel sekuensing tidak praktis. Di masa depan, pyrosequencing dapat dikhususkan untuk pengembangan teknologi untuk deteksi langsung produk PCR double-stranded, yang akan sangat menyederhanakan operasi. Dan secara efektif mengurangi biaya pengurutan untuk mencapai promosi pengujian klinis yang komprehensif.
3. Metode ARMS:
Teknologi ini menggunakan primer untuk membedakan antara gen tipe liar dan mutan, wh
Ich telah dilaporkan sejak tahun 1980-an. Keuntungan terbesar dari metode ini adalah memiliki sensitivitas hingga 1.0% dan dapat mendeteksi gen mutan dalam sampel serendah 1.0%. Dalam desain, panjang produk target dapat diperpendek sampai batas maksimal, dan masalah bahwa hasil deteksi yang akurat tidak dapat diperoleh karena sebagian besar DNA yang diekstraksi dari spesimen jaringan yang tertanam parafin terfragmentasi. Teknologi ini menggabungkan platform PCR waktu nyata untuk mencapai operasi tabung tertutup selama amplifikasi. Pengoperasiannya sederhana dan tidak memerlukan pasca-pemrosesan produk, yang dapat menghindari kontaminasi produk yang diperkuat secara maksimal. Saat ini, metode scorpion-ARMS yang menggabungkan probe kalajengking dan sistem mutasi blok amplifikasi lebih umum digunakan di dunia. Kombinasi kedua teknologi tersebut dapat memaksimalkan sensitivitas dan spesifisitas kedua sisi. Gao Jie dkk. Metode ini digunakan untuk mendeteksi status mutasi gen KRAS pada 167 pasien kanker kolorektal, menunjukkan bahwa metode ini dapat diandalkan dan akurat. Wang Hui dkk. Juga menggunakan ARMS untuk mendeteksi mutasi KRAS pada 151 kasus jaringan yang difiksasi formaldehida dan tertanam parafin. Di Amerika Serikat, kit COBAS (Roche) yang disetujui oleh FDA untuk pengujian klinis KRAS dan kit Therascreen RGQ (Qiagen) yang disertifikasi oleh European Union In Vitro Diagnostics (CE-IVD) semuanya menggunakan prinsip ARMS. Di antara metode yang umum, metode ARMS adalah yang paling sensitif dan biayanya relatif masuk akal. Oleh karena itu, sebagian besar deteksi klinis gen KRAS di dalam dan luar negeri menggunakan metode ARMS, namun karena metode tersebut berbasis teknologi PCR, kekurangannya adalah hanya dapat dideteksi Mutasi situs yang diketahui.
4. Metode PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata:
Ini adalah metode deteksi berbasis PCR untuk menentukan mutasi dengan nilai Ct. Ini memiliki keunggulan spesifisitas yang kuat, sensitivitas tinggi, kuantifikasi akurat, pengoperasian yang mudah, dan reaksi tertutup sepenuhnya. Banyak kelompok eksperimen telah mengadopsi metode ini untuk mendeteksi mutasi KRAS pada kanker kolorektal. Dibandingkan dengan metode pengurutan langsung, PCR kuantitatif menempati keunggulan yang lebih besar dalam sensitivitas. Kebanyakan ahli yang membandingkan kedua metode percaya bahwa PCR kuantitatif lebih sensitif. Liu Wei dkk. Menggunakan dua metode untuk membuat analisis rinci hasil deteksi 280 kasus mutasi gen KRAS kanker kolorektal, 94 kasus mutasi sekuensing gen KRAS, tingkat positif adalah 33.57% (94/280), di antaranya, fluoresensi kuantitatif real-time. PCR positif 91 kasus memiliki sensitivitas 96.8% (91/94). Dari 186 gen yang mengurutkan kasus tipe liar, 184 dinyatakan negatif oleh PCR kuantitatif waktu nyata, dengan spesifisitas 98.9% (184/186). Tingkat kebetulan antara metode PCR kuantitatif fluoresensi real-time dan metode sekuensing gen langsung adalah 98.2%. Dalam dua metode deteksi, tingkat kebetulan positif dan negatif dari setiap lokasi mutasi berada di atas 90%, dan tingkat kebetulan dari empat lokasi mencapai 100%. Hasil deteksi kedua metode sangat konsisten, menunjukkan PCR kuantitatif fluoresen. Ini adalah metode yang lebih andal untuk deteksi mutasi. Namun, metode berbasis PCR perlu merancang primer dan probe berdasarkan jenis mutasi yang diketahui, sehingga semua kemungkinan mutasi tidak dapat dideteksi, dan hanya situs tertentu yang dapat dideteksi. Jika situs tertentu tidak termasuk dalam jangkauan deteksi kit, meskipun sebenarnya ada mutasi, hasil kit tetap negatif. Selain itu, walaupun sensitivitas PCR kuantitatif tinggi, apakah terdapat false positive masih perlu diverifikasi dengan teknologi sekuensing DNA, atau percobaan klinis retrospektif dan prospektif dengan ukuran sampel yang besar untuk memastikan korelasi antara status mutasi KRAS dan efikasi target. obat-obatan. Oleh karena itu, sensitivitas tinggi deteksi mutasi tidak boleh dilakukan secara membabi buta, sedangkan spesifisitas dan akurasi deteksi harus diabaikan. Di bawah kondisi laboratorium yang berbeda, metode optimal untuk deteksi mutasi pada spesimen juga mungkin berbeda. Untuk spesimen dengan proporsi mutasi yang lebih tinggi, metode Sanger sequencing memiliki akurasi yang lebih tinggi dalam mendeteksi mutasi gen, sedangkan untuk spesimen dengan proporsi mutasi yang lebih rendah dapat terjadi metode Sanger sequencing False negatif, dan metode pendeteksian menggunakan fluorescent PCR sebagai platform teknisnya. dapat ditandai dengan sensitivitas tinggi.
5. Metode HRM:
Ini adalah salah satu metode deteksi gen yang lebih umum digunakan dalam beberapa tahun terakhir. Keunggulannya adalah simple, fast, sensitive, dan single tube terhindar dari polusi. Untuk mengeksplorasi kelayakan penggunaannya dalam pengujian klinis, Liu Liqin dan lainnya menggunakan metode HRM untuk mendeteksi mutasi gen KRAS pada 64 pasien kanker kolorektal, dan kemudian menggunakan pengurutan langsung untuk memverifikasi hasil. Hasil HRM dan pengurutan langsung ditemukan konsisten. Dibandingkan dengan pengurutan langsung, deteksi mutasi gen KRAS oleh HRM sederhana dan akurat, menunjukkan bahwa ini adalah metode yang andal dan cocok untuk pengujian klinis. Chen Zhihong dkk. Menggunakan metode HRM untuk menguji serangkaian sampel campuran yang mengandung proporsi berbeda dari plasmid mutan KRAS untuk mengevaluasi sensitivitasnya. Ditemukan proporsi mutasi plasmid pada sampel campuran adalah 10%, dan sensitivitas mencapai 10%. Selanjutnya metode tersebut digunakan untuk mendeteksi mutasi gen KRAS pada 60 sampel jaringan kanker kolorektal. Dibandingkan dengan metode sekuensing langsung, sensitivitas metode HRM adalah 100%, dan spesifisitas 96% (43/45). Kerugian dari metode HRM adalah tidak mungkin secara akurat memberikan tipe mutasi spesifik dan kodon mana yang bermutasi. Jika ditemukan kelainan pada kurva leleh, maka diperlukan metode sequencing untuk menentukan jenis mutasinya. Kelompok penelitian Harlé menggunakan 156 kasus jaringan kanker kolorektal untuk membandingkan metode fluoresen PCR, ARMS dan HRM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa meskipun ketiga metode tersebut cocok untuk pengujian klinis, keandalan HRM tidak sebaik dua metode lainnya.
6. Metode lain:
Selain metode yang disebutkan di atas, metode deteksi lain memiliki kelebihan dan kekurangan dalam aplikasinya, seperti PCR-SSCP, kromatografi cair kinerja tinggi, metode probe oligonukleotida yang dioptimalkan dengan PCR fluoresen, Metode kombinasi PCR dan ARMS bersarang, COLD-PCR metode, dll. Kromatografi cair kinerja tinggi memiliki spesifisitas yang kuat, tetapi permintaan akan sampel besar; PCR-SSCP berbiaya rendah dan ekonomis, tetapi operasinya rumit; Teknologi deteksi mutasi berdasarkan fluorescent PCR memiliki spesifisitas yang kuat, sensitivitas tinggi, dan kuantitatif yang akurat, Pengoperasian yang mudah, reaksi yang terhalang sepenuhnya, dan keuntungan lainnya, tetapi semua perlu merancang primer dan probe sesuai dengan jenis mutasi yang diketahui, jadi hanya situs tertentu yang dapat terdeteksi, dan semua kemungkinan mutasi tidak dapat dideteksi.
3. Ringkasan
Kesimpulannya, karena lokasi mutasi dan metode pendeteksian di laboratorium yang berbeda tidak seragam, ukuran spesimen tumor yang dianalisis dan kualitas ekstraksi DNA juga tidak merata, mengakibatkan adanya hasil eksperimen besar atau kecil antar laboratorium Perbedaan, standarisasi Deteksi mutasi gen KRAS telah menjadi masalah deteksi klinis yang menjadi perhatian di berbagai negara. Saat ini banyak metode untuk mendeteksi mutasi pada gen KRAS. Sensitivitas dari tinggi ke rendah adalah ARMS, pyrosequencing, HRM, PCR kuantitatif real-time, dan direct sequencing. Dari kenyataan klinis, sensitivitas rendah tidak kondusif untuk pengobatan klinis, tetapi metode yang terlalu sensitif akan menyebabkan spesifisitas deteksi menurun, dan hasil positif palsu yang tidak perlu dapat terjadi dan mempengaruhi rejimen pengobatan pasien selanjutnya. Mempertimbangkan aspek-aspek di atas, dikombinasikan dengan metode yang disetujui oleh FDA, maka metode ARMS direkomendasikan. Tentu saja, dari perspektif pasar, diagnostik molekuler seharusnya tidak menekankan saya
thods, tapi fokus pada hasil akhir yang benar. Laboratorium yang berbeda dapat mengadopsi metode pengujian yang tepat sesuai dengan situasi aktual, tetapi hanya jika laboratorium tersebut memiliki kualifikasi operator yang baik dan sistem kendali mutu internal. Dengan kondisi lingkungan laboratorium dalam negeri saat ini, perlu dilakukan pengujian di laboratorium PCR yang terstandarisasi dan ikut serta dalam kegiatan pengendalian mutu antar ruang dalam dan luar negeri untuk menjamin mutu pengujian laboratorium yang handal. Manajemen standar adalah kondisi yang diperlukan untuk memastikan hasil yang konstan. Di Cina, ada kebutuhan mendesak untuk menyatukan dan membakukan pengujian klinis gen KRAS, dan untuk menghasilkan program pengujian standar dan standar sesuai dengan kebutuhan yang berbeda, dan program ini dapat diperluas untuk mendeteksi BRAF, PIK23450_3CA, EGFR dan gen lain untuk mempromosikan pengujian patologi molekuler klinis.
