Cílené léky, jako je cetuximab a panitumumab, jsou široce používány v klinice jako účinná terapeutická léčiva pro kolorektální karcinom. Klinická data ukazují, že pacienti s mutacemi KRAS nemají na tento lék s monoklonální protilátkou žádný významný účinek a mohou z něj mít prospěch pouze pacienti divokého typu. Proto je stav mutace genu KRAS klinicky považován za důležitý terapeutický marker, který má silnou korelaci s prognózou a léčebným efektem kolorektálního karcinomu. Směrnice pro klinickou praxi týkající se kolorektálního karcinomu z roku 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) stanoví, že všichni pacienti s metastatickým kolorektálním karcinomem musí detekovat stav mutace genu KRAS a pro léčbu cílenou EGFR se doporučuje pouze divoký typ KRAS. Ve stejném roce vydala také Americká společnost klinické onkologie (ASCO) stejná doporučení pro klinickou léčbu jako molekulární marker pro nádorově cílenou terapii, což ukazuje jeho důležitý orientační význam. V současné době je genetické testování KRAS široce klinicky prováděno. Hodnotíme především domácí metody detekce mutací genu KRAS pro referenční účely v klinické selekci.
1. Pozitivní rychlost mutace genu KRAS u kolorektálního karcinomu
U kolorektálního karcinomu je rychlost mutace genu KRAS až 35% až 45% a vysoce rizikovým místem mutace jsou kodony 12 a 13 na exonu 2 a stále existují vzácné mutace, jako je 61 a 146. stránky. Existuje mnoho detekčních metod pro mutace genu KRAS, včetně přímého sekvenování, analýzy křivky tání s vysokým rozlišením (HRM), pyrosekvenování, kvantitativní PCR, blokového systému amplifikace (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP), analýza polymermatické řetězové reakce - jednořetězcová konformační polymorfismus (PCR-singlestrandový konfomační polymorfismus (PCR-SSCP), společná amplifikace při nižší denaturační teplotní PCR (COLD-PCR) a vysoce účinná kapalinová chromatografie atd.)
2. Hodnocení metod detekce mutací KRAS
1. Metoda přímého sekvenování: Je to nejklasičtější metoda pro detekci mutací genu KRAS a je také zlatým standardem pro detekci genových mutací. Metoda přímého sekvenování založená na principu dideoxy sekvenování může nejintuitivněji ukázat změnu genové sekvence ve formě mapy základního píku. Typ detekce je komplexnější a je to také nejdříve použitá metoda detekce mutací. Navzdory vzniku platforem pro sekvenování nové generace vědci doma i v zahraničí stále používají výsledky přímého sekvenování jako měřítko k měření a určování spolehlivosti nové metody. Gao Jing a kol. Aplikováno přímé sekvenování na detekci genových mutací KRAS a BRAF u 966 pacientů s kolorektálním karcinomem. Toto je také analýza mutace genu KRAS s největším domácím vzorkem uváděným v literatuře. Ling Yun a další se domnívají, že metoda přímého sekvenování je nejpřímější a nejúčinnější metodou detekce pro pochopení stavu mutace každého genu, což může objasnit typ mutace, zejména pro detekci neznámých mutací. I když je citlivost této metody relativně nízká, lze ji zlepšit metodami, jako je mikrodisekce k obohacení nádorových buněk. Metoda přímého sekvenování byla také použita pro detekci KRAS větších velikostí vzorků v jiných domácích výzkumných skupinách. Nižší citlivost je však největší nevýhodou přímého sekvenování. Soudě podle výsledků hlášených v Číně není míra detekce mutací přímým sekvenováním nízká. Liu Xiaojing a kol. Ve srovnání s přímým sekvenováním a peptidovou nukleovou kyselinou s upínací PCR (PNA-PCR) bylo zjištěno, že přímým sekvenováním bylo detekováno 43 případů mutací genu KRAS. Kromě těchto mutací byla PNA-PCR detekována také přímým sekvenováním. Deset mutací bylo nalezeno u divokého typu a byly navrženy návrhy k určení pacientů divokého typu pomocí PCR a metody přímého sekvenování k určení mutantních pacientů. Qiu Tian a kol. Detekováno 131 vzorků rakoviny tlustého střeva metodou fluorescenční PCR optimalizovanou oligonukleotidovou sondou a metodou přímého sekvenování a pozitivní rychlost mutací genu KRAS byla 41.2% (54/131) a 40.5% (53/131)). Bai Dongyu také diskutoval o citlivosti detekce různých metod. Z 200 pacientů s kolorektálním karcinomem bylo 63 detekováno mutacemi RT-qPCR a míra detekce mutací byla 31.5%; 169 vzorků bylo úspěšně sekvenováno přímým sekvenováním 50 případů mutace, rychlost detekce mutace 29.6%. Ačkoli metoda přímého sekvenování může přesně, objektivně a konkrétně detekovat stav mutace genu KRAS, její nedostatky, jako jsou vysoké technické požadavky, komplikované operační postupy, snadná křížová kontaminace a časově náročná a pracná interpretace výsledků, jsou také velmi zřejmé. Často není k dispozici žádné sekvenční zařízení a vzorek je třeba odeslat do příslušné společnosti k testování, což trvá dlouho a má vysoké náklady, takže má velká omezení.
Metoda pyrosekvenování:
Metoda pyrosekvenování je také pohodlnější metodou pro detekci genových mutací KRAS, pokud jde o citlivost sekvenování, náklady na detekci a čas do hlášení. Opakovatelnost této metody je lepší. Podle získané mapy píku Kvantitativní studie frekvence mutací určitého místa a srovnání frekvencí mutací různých míst jsou na první pohled jasné. V posledních letech Ogino et al., Hutchins et al. Použili technologii pyrosekvenování k testování mutací KRAS u pacientů s velkými vzorky kolorektálního karcinomu. Výsledky ukazují, že technologie pyrosekvenování je mocným nástrojem pro screening pacientů na cílenou terapii. Molekulární diagnostika nádoru má široké vyhlídky na uplatnění. Domácí vědci také použili technologii pyrosekvenování ke klinické detekci mutací KRAS u rakoviny tlustého střeva s dobrou přesností a spolehlivostí. Tato metoda má lepší specificitu a vyšší citlivost. SundstrÖm et al. Ve srovnání s alelicky specifickou PCR a pyrosekvenováním v klinických aplikacích bylo zjištěno, že ve 314 případech mutací KRAS u pacientů s kolorektálním karcinomem byla specificita pyrosekvenování lepší než u alel. PCR a má dobrou citlivost na tkáně s nízkým obsahem nádorových buněk. Zřeďte podíl nádorových buněk na 1.25% až 2.5%. Pyrosekvenování může stále detekovat mutační signály. Když minimální obsah mutantních alel ve vzorku potřebuje dosáhnout 20%, aby byl detekován Sangerovým sekvenováním, může být detekován metodou HRM, když dosáhne 10%, a pro pyrosekvenování lze detekovat pouze mutace o 5%. Alely. Pomocí pyrosekvenování jsme detekovali mutace KRAS u 717 pacientů s kolorektálním karcinomem a zjistili jsme, že frekvence mutací KRAS byla 40.9%. Rychlost mutace kodonu 12 byla 30.1%, rychlost mutace kodonu 13 byla 9.8% a rychlost mutace kodonu 61 byla 1.0%. Před testováním jsme tkáně obohatili o vyšší obsah tumoru manuální mikrodisekcí, čímž byly výsledky spolehlivější. Metoda má dobrou citlivost a specificitu a je snadno vyvinutá v klinické praxi. Nevýhodou pyrosekvenování jsou vysoké náklady na detekci a proces přípravy jednořetězcové DNA pro sekvenování vzorků je těžkopádný. V budoucnu lze pyrosekvenování věnovat vývoji technologie pro přímou detekci dvouřetězcových produktů PCR, což značně zjednoduší provoz. A efektivně snížit náklady na sekvenování, abyste dosáhli komplexní podpory klinického testování.
3. ARMS metoda:
Tato technologie používá primery k rozlišení mezi divokými a mutovanými geny, wh
ich byly hlášeny již v 1980. letech. Největší výhodou této metody je, že má citlivost až 1.0% a dokáže detekovat mutantní geny ve vzorcích již od 1.0%. V konstrukci lze délku cílového produktu zkrátit na největší míru a problém, že nelze dosáhnout přesných výsledků detekce, protože většina DNA extrahované ze vzorku tkáně zalitého v parafinu je fragmentovaná. Tato technologie kombinuje real-time PCR platformu pro dosažení provozu uzavřené zkumavky během amplifikace. Operace je jednoduchá a nevyžaduje následné zpracování produktu, což může v největší míře zabránit kontaminaci zesíleného produktu. V současné době se ve světě běžněji používá metoda scorpion-ARMS kombinující systém scorpion sondy a systém mutace amplifikačního bloku. Kombinace těchto dvou technologií může maximalizovat citlivost a specifičnost obou stran. Gao Jie a kol. Tato metoda byla použita k detekci stavu mutace genu KRAS u 167 pacientů s kolorektálním karcinomem, což naznačuje, že tato metoda je spolehlivá a přesná. Wang Hui a kol. Používá se také ARMS k detekci mutací KRAS ve 151 případech tkání fixovaných formaldehydem a zalitých v parafinu. Ve Spojených státech používá souprava COBAS (Roche) schválená FDA pro klinické testování KRAS a souprava Therascreen RGQ (Qiagen) certifikovaná Evropskou unií pro diagnostiku in vitro (CE-IVD) princip ARMS. Mezi běžnými metodami je metoda ARMS nejcitlivější a náklady jsou relativně rozumné. Proto velká část klinické detekce genů KRAS doma i v zahraničí používá metodu ARMS, ale protože metoda je založena na technologii PCR, jejím nedostatkem je, že ji lze detekovat pouze mutacemi známých míst.
4. Metoda kvantitativní PCR fluorescence v reálném čase:
Jedná se o detekční metodu založenou na PCR k určení mutace podle hodnoty Ct. Má výhody silné specifičnosti, vysoké citlivosti, přesné kvantifikace, snadného ovládání a plně uzavřené reakce. Mnoho experimentálních skupin přijalo tuto metodu pro detekci mutací KRAS u kolorektálního karcinomu. Ve srovnání s metodou přímého sekvenování má kvantitativní PCR větší výhodu v citlivosti. Většina vědců srovnávajících tyto dvě metody věří, že kvantitativní PCR je citlivější. Liu Wei a kol. Použity dvě metody k provedení podrobné analýzy výsledků detekce 280 případů mutací genu KRAS kolorektálního karcinomu, 94 případů sekvenačních mutací genu KRAS, pozitivní míra byla 33.57 % (94/280), z toho kvantitativní fluorescence v reálném čase PCR byla pozitivní 91 případů mělo senzitivitu 96.8 % (91/94). Ze 186 případů divokého typu se sekvenováním genů bylo 184 negativních pomocí kvantitativní PCR v reálném čase se specificitou 98.9 % (184/186). Míra koincidence mezi metodou fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase a metodou přímého sekvenování genů byla 98.2 %. Ve dvou metodách detekce byla míra pozitivní a negativní koincidence každého místa mutace vyšší než 90 % a míra koincidence čtyř míst dosáhla 100 %. Výsledky detekce obou metod byly vysoce konzistentní, což ukazuje na fluorescenční kvantitativní PCR. Jedná se o spolehlivější metodu pro detekci mutací. Metody založené na PCR však potřebují navrhnout primery a sondy na základě známých typů mutací, takže nelze detekovat všechny možné mutace a lze detekovat pouze specifická místa. Pokud určité místo není zahrnuto v detekčním rozsahu soupravy, i když skutečně existuje mutace, je výsledek soupravy stále negativní. Kromě toho, i když je citlivost kvantitativní PCR vysoká, zda existují falešně pozitivní výsledky, je stále třeba ověřit technologií sekvenování DNA nebo retrospektivními a prospektivními klinickými experimenty s velkými velikostmi vzorků, aby se potvrdila korelace mezi stavem mutace KRAS a účinností cílených drogy . Proto by vysoká citlivost detekce mutací neměla být slepě sledována, zatímco specificita a přesnost detekce by měla být ignorována. V různých laboratorních podmínkách se může lišit i optimální metoda pro detekci mutací ve vzorcích. U vzorků s vyšším podílem mutací má Sangerova sekvenační metoda vyšší přesnost v detekci genových mutací, zatímco u vzorků s nižším podílem mutací se může vyskytovat Sangerova sekvenační metoda Falešně negativita a detekční metoda využívající fluorescenční PCR jako technickou platformu se může vyznačovat vysokou citlivostí.
5. Metoda HRM:
Je to jedna z nejčastěji používaných metod detekce genů v posledních letech. Má výhody jednoduché, rychlé, citlivé a jednoduché trubice, aby se zabránilo znečištění. Aby bylo možné prozkoumat proveditelnost jeho použití v klinických testech, Liu Liqin a další použili metodu HRM k detekci mutací genu KRAS u 64 pacientů s kolorektálním karcinomem a poté k ověření výsledků použili přímé sekvenování. Výsledky HRM a přímého sekvenování jsou shledány konzistentními. Ve srovnání s přímým sekvenováním je detekce mutací genu KRAS pomocí HRM jednoduchá a přesná, což naznačuje, že se jedná o spolehlivou metodu vhodnou pro klinické testování. Chen Zhihong et al. Metoda HRM byla použita k testování řady smíšených vzorků obsahujících různé podíly mutantních plazmidů KRAS k vyhodnocení jejich citlivosti. Bylo zjištěno, že podíl plazmidových mutací ve smíšených vzorcích byl 10% a citlivost dosáhla 10%. Následně byla metoda použita k detekci mutací genu KRAS v 60 vzorcích tkáně kolorektálního karcinomu. Ve srovnání s metodou přímého sekvenování byla citlivost metody HRM 100% a specificita 96% (43/45). Nevýhodou metody HRM je, že je nemožné přesně poskytnout konkrétní typ mutace a který kodon je mutován. Pokud je na křivce tání zjištěna abnormalita, je k určení typu mutace nutná metoda sekvenování. Výzkumná skupina Harlé použila k porovnání fluorescenčních metod PCR, ARMS a HRM 156 případů tkáně rakoviny tlustého střeva a konečníku. Výsledky naznačují, že ačkoli jsou tyto tři metody vhodné pro klinické testování, spolehlivost HRM není tak dobrá jako u ostatních dvou metod.
6. Jiné metody:
Kromě výše zmíněných metod mají jiné detekční metody v aplikaci své vlastní výhody a nevýhody, jako je PCR-SSCP, vysoce účinná kapalinová chromatografie, metoda fluorescenční PCR optimalizované oligonukleotidové sondy, metoda vnořené PCR a kombinace ARMS, COLD-PCR metoda atd. Vysoce účinná kapalinová chromatografie má silnou specificitu, ale poptávka po vzorcích je velká; PCR-SSCP je levný a ekonomický, ale operace je komplikovaná; technologie detekce mutací založená na fluorescenční PCR má silnou specificitu, vysokou citlivost a přesné kvantitativní, snadnou obsluhu, plně blokovanou reakci a další výhody, ale všechny je třeba navrhnout primery a sondy podle známého typu mutace, takže lze pouze specifická místa detekovány a nelze detekovat všechny možné mutace.
3. Shrnutí
Stručně řečeno, protože mutační místa a detekční metody v různých laboratořích nejsou jednotné, velikost analyzovaných vzorků nádorů a kvalita extrakce DNA jsou také nerovnoměrné, což vede k existenci velkých nebo malých experimentálních výsledků mezi laboratořemi Rozdíly, standardizace detekce genové mutace KRAS se stal problémem klinické detekce v různých zemích. V současné době existuje mnoho metod k detekci mutací v genu KRAS. Citlivost od nejvyšší po nejnižší je ARMS, pyrosekvenování, HRM, kvantitativní PCR v reálném čase a přímé sekvenování. Z klinické reality nízká citlivost nevede ke klinické léčbě, ale příliš citlivé metody způsobí pokles specificity detekce a mohou se objevit zbytečné falešně pozitivní výsledky a ovlivnit následný léčebný režim pacienta. Vzhledem k výše uvedeným aspektům se v kombinaci s metodou schválenou FDA doporučuje metoda ARMS. Z pohledu trhu by mě molekulární diagnostika samozřejmě neměla zdůrazňovat
thods, ale zaměřte se na konečné správné výsledky. Různé laboratoře mohou přijmout vhodné zkušební metody podle aktuální situace, ale pouze pokud mají dobrou kvalifikaci operátora a vnitřní systémy kontroly kvality. Za současných podmínek domácího laboratorního prostředí je nutné provádět testování ve standardizované laboratoři PCR a účastnit se domácích i mezinárodních aktivit mezipokojové kontroly kvality, aby byla zajištěna spolehlivá kvalita laboratorního testování. Standardizované řízení je nezbytnou podmínkou pro zajištění stálých výsledků. V Číně je naléhavá potřeba sjednotit a standardizovat klinické testování genu KRAS a vytvořit standardizovaný a standardizovaný testovací program podle různých potřeb a tento program lze rozšířit na detekci genů BRAF, PIK23450_3CA, EGFR a dalších, aby se podpořilo testování klinické molekulární patologie.
