Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Позитивна стопа мутације гена КРАС код колоректалног карцинома
Код колоректалног карцинома, стопа мутације гена КРАС износи чак 35% до 45%, а високо ризично место мутације су кодони 12 и 13 на ексону 2, а још увек има ретких попут 61 и 146. Мутација сајт. Постоје многе методе детекције за мутације гена КРАС, укључујући директно секвенцирање, анализу криве топљења високе резолуције (ХРМ), пиросеквенцирање, квантитативни ПЦР, систем блока појачавања мутација (амплинц атио) систем нерефрактормутације (АРМС), полиморфизам дужине рестрикционих фрагмената (РФЛП), анализа полимерзне ланчане реакције полимеразе - једноланчана конформациона полиморфизам (ПЦР - једноланчана полиморфизам конформације (ПЦР-ССЦП), ко-амплификација при нижој температури денатурације ПЦР (ЦОЛД-ПЦР) и анализа течне хроматографије високих перформанси итд.)
2. Процена метода откривања КРАС мутација
1. Метода директног секвенцирања: То је најкласичнији метод за откривање КРАС генских мутација, а такође је и златни стандард за откривање генских мутација. Метода директног секвенцирања заснована на принципу дидеокси секвенцирања може најинтуитивније приказати промену секвенце гена у облику мапе основног врха. Тип откривања је свеобухватнији и уједно је најраније примењена метода откривања мутација. Упркос настанку платформи за секвенцирање нове генерације, научници у земљи и иностранству и даље користе резултате директног секвенцирања као скалу за мерење и одређивање поузданости нове методе. Гао Јинг и сар. Примењено директно секвенцирање за откривање мутација гена КРАС и БРАФ код 966 пацијената са раком дебелог црева. Ово је такође анализа мутације гена КРАС са највећим домаћим узорком забележеним у литератури. Линг Иун и други верују да је метода директног секвенцирања најдиректнија и најефикаснија метода детекције за разумевање статуса мутације сваког гена, која може разјаснити врсту мутације, посебно за откривање непознатих мутација. Иако је осетљивост ове методе релативно ниска, она се може побољшати методама као што је микродисекција за обогаћивање туморских ћелија. Метода директног секвенцирања такође је примењена на КРАС детекцију већих величина узорака у другим домаћим истраживачким групама. Међутим, мања осетљивост је највећи недостатак директног секвенцирања. Судећи према резултатима забележеним у Кини, стопа откривања мутација директним секвенцирањем није мала. Лиу Ксиаојинг и сар. Упоредили су директно секвенцирање и пептидну ПЦР стезаљку нуклеинске киселине (ПНА-ПЦР) и открили да су директним секвенцирањем откривена 43 случаја мутације КРАС гена. Поред ових мутација, ПНА-ПЦР је такође откривен директним секвенцирањем. Пронађено је десет мутација дивљег типа и дати су предлози за одређивање пацијената дивљег типа ПЦР-ом и методом директног секвенцирања за одређивање мутираних пацијената. Киу Тиан и сар. Откривен је 131 узорак рака дебелог црева помоћу флуоресцентне методе ПЦР-оптимизоване олигонуклеотидне сонде и методе директног секвенцирања, а позитивне стопе мутација КРАС гена износиле су 41.2% (54/131) и 40.5% (53/131). Баи Донгиу је такође разговарао о осетљивости различитих метода на откривање. Од 200 пацијената са колоректалним карциномом, 63 су откривене мутацијама РТ-кПЦР, а стопа откривања мутација била је 31.5%; 169 узорака успешно је секвенцирано директним секвенцирањем 50 случајева мутације, стопа откривања мутација 29.6%. Иако метода директног секвенцирања може тачно, објективно и конкретно открити статус мутације гена КРАС, његови недостаци као што су високи технички захтеви, сложени оперативни поступци, лако изазвање унакрсне контаминације и дуготрајна и мукотрпна интерпретација резултата такође су веома очигледан. Често нема опреме за секвенцирање, а примерак је потребно послати одговарајућој компанији на испитивање, што траје дуго и има високу цену, тако да има велика ограничења.
Метода пиросеквенцирања:
Метода пиросеквенцирања је такође погоднија метода за детекцију мутације гена КРАС у погледу осетљивости секвенцирања, трошкова детекције и времена за извештавање. Поновљивост ове методе је боља. Према добијеној мапи врхова Квантитативна студија учесталости мутација одређеног места и поређење између фреквенција мутација различитих места су јасни на први поглед. Последњих година, Огино и сар., Хутцхинс и сар. Користили су технологију пиросеквенцирања за тестирање КРАС мутација код пацијената са великим узорцима рака дебелог црева. Резултати указују да је технологија пиросеквенцирања моћно средство за преглед пацијената на циљану терапију. Молекуларна дијагноза тумора има широке изгледе за примену. Домаћи научници су такође користили технологију пиросеквенцирања да би клинички открили КРАС мутације у раку дебелог црева, са добром тачношћу и поузданошћу. Ова метода има бољу специфичност и већу осетљивост. Сундстром и др. Упоредили су ПЦР специфичне за алеле и пиросеквенцирање у клиничкој примени и открили да је у 314 случајева КРАС мутација код пацијената са колоректалним карциномом, специфичност пиросеквенцирања била боља од алела. ПЦР, и има добру осетљивост на ткива са малим садржајем туморских ћелија. Разредите удео туморских ћелија на 1.25% до 2.5%. Пиросеквенцирање и даље може открити сигнале мутације. Када минимални садржај мутираних алела у узорку треба да достигне 20% да би се могао детектовати Сангеровим секвенцирањем, може се открити ХРМ методом када достигне 10%, а за пиросеквенцирање само мутације могу да се открију за 5%. Алелес. Користили смо пиросеквенцирање за откривање КРАС мутација код 717 пацијената са колоректалним карциномом и открили да је учесталост КРАС мутација била 40.9%. Стопа мутације кодона 12 била је 30.1%, стопа мутације кодона 13 била је 9.8%, а стопа мутације кодона 61 1.0%. Обогатили смо ткива вишим садржајем тумора ручном микродисекцијом пре тестирања, чинећи резултате поузданијим. Метода има добру осетљивост и специфичност и лако се развија у клиничкој пракси. Недостатак пиросеквенцирања је висока цена детекције, а поступак припреме једноланчане ДНК за секвенцирање узорака је гломазан. У будућности се пиросеквенцирање може посветити развоју технологије за директно откривање дволанчаних ПЦР производа, што ће у великој мери поједноставити рад. И ефикасно смањити трошкове секвенцирања да би се постигла свеобухватна промоција клиничког испитивања.
3. АРМС метода:
Ова технологија користи прајмере за разликовање гена дивљег типа и мутаната, вх
о њима се извештава већ 1980-их. Највећа предност ове методе је што има осетљивост до 1.0% и може открити мутиране гене у узорцима од 1.0%. У дизајну, дужина циљног производа може се у највећој мери скратити, а проблем што се не могу добити тачни резултати детекције јер је већина ДНК извучене из узорка ткива уграђеног у парафин фрагментирана. Ова технологија комбинује ПЦР платформу у реалном времену како би се постигао рад затворене цеви током појачања. Операција је једноставна и не захтева накнадну обраду производа, што у највећој мери може избећи контаминацију појачаног производа. Тренутно се у свету чешће користи метода сцорпион-АРМС која комбинује систем мутације сонде и блока појачања. Комбинација две технологије може максимизирати осетљивост и специфичност обе стране. Гао Јие и сар. Овом методом је откривен статус мутације гена КРАС код 167 пацијената са колоректалним карциномом, што сугерише да је овај метод поуздан и тачан. Ванг Хуи и сар. Такође се користи АРМС за откривање КРАС мутација у 151 случају ткива утврђених формалдехидом и парафином уграђених. У Сједињеним Државама, комплет ЦОБАС (Роцхе) који је одобрила ФДА за клиничко испитивање КРАС-а и комплет Тхерасцреен РГК (Киаген), сертификовани од стране Европске уније за ин витро дијагностику (ЦЕ-ИВД), користе принцип АРМС. Међу уобичајеним методама метода АРМС је најосетљивија и цена је релативно разумна. Због тога се велики део клиничке детекције гена КРАС код куће и у иностранству користи АРМС методом, али зато што се метода заснива на ПЦР технологији, недостатак јој је што се могу открити само познате мутације места.
4. Флуоресцентна квантитативна ПЦР метода у реалном времену:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. ХРМ метода:
То је једна од најчешће коришћених метода детекције гена у последњих неколико година. Има предности једноставне, брзе, осетљиве и једноструке цеви како би се избегло загађење. Да би истражили изводљивост његове употребе у клиничким испитивањима, Лиу Ликин и други су користили методу ХРМ за откривање мутација КРАС гена код 64 пацијента са раком дебелог црева, а затим су користили директно секвенцирање за верификацију резултата. Резултати ХРМ и директног секвенцирања су доследни. У поређењу са директним секвенцирањем, откривање мутација гена КРАС помоћу ХРМ је једноставно и тачно, што сугерише да је то поуздана метода погодна за клиничко испитивање. Цхен Зхихонг и сар. Користила је ХРМ методу за испитивање низа мешаних узорака који садрже различите пропорције КРАС мутираних плазмида за процену њихове осетљивости. Утврђено је да је удео плазмидних мутација у мешаним узорцима био 10%, а осетљивост 10%. Потом је метода коришћена за откривање мутација гена КРАС у 60 узорака ткива карцинома дебелог црева. У поређењу са методом директног секвенцирања, осетљивост ХРМ методе била је 100%, а специфичност 96% (43/45). Недостатак ХРМ методе је што је немогуће прецизно обезбедити одређени тип мутације и који кодон је мутиран. Ако се на кривуљи топљења открије абнормалност, потребан је метод секвенцирања да би се одредио тип мутације. Истраживачка група Харле користила је 156 случајева ткива колоректалног карцинома за поређење флуоресцентних ПЦР, АРМС и ХРМ метода. Резултати сугеришу да иако су три методе погодне за клиничко испитивање, поузданост ХРМ-а није тако добра као остале две методе.
6. Остале методе:
Поред горе поменутих метода, друге методе детекције имају своје предности и недостатке у примени, као што су ПЦР-ССЦП, течна хроматографија високих перформанси, метода флуоросцентне олигонуклеотидне сонде оптимизоване за ПЦР, метода угнежђене ПЦР и АРМС комбинације, ХЛАДНО-ПЦР метода итд. Течна хроматографија високих перформанси има јаку специфичност, али је потражња за узорцима велика; ПЦР-ССЦП је јефтин и економичан, али је операција сложена; технологија откривања мутација заснована на флуоресцентном ПЦР-у има снажну специфичност, високу осетљивост и тачну квантитативну, лаку употребу, потпуно блокирану реакцију и друге предности, али сви требају дизајнирати прајмере и сонде у складу са познатим типом мутације, тако да могу бити одређена места детектује, а све могуће мутације не могу се открити.
КСНУМКС. Резиме
Укратко, јер места мутације и методе откривања у различитим лабораторијама нису уједначене, величина анализираних узорака тумора и квалитет екстракције ДНК су такође неуједначени, што резултира великим или малим експерименталним резултатима између лабораторија. Разлике, стандардизација откривања мутације гена КРАС постало је питање клиничког откривања које изазива забринутост у разним земљама. Тренутно постоји много метода за откривање мутација у гену КРАС. Осетљивост од високог ка ниском је АРМС, пиросеквенцирање, ХРМ, квантитативна ПЦР у реалном времену и директно секвенцирање. Из клиничке стварности, мала осетљивост није погодна за клинички третман, али сувише осетљиве методе ће довести до опадања специфичности откривања и могу се појавити непотребни лажно позитивни резултати и утицати на пацијентов следећи режим лечења. Узимајући у обзир горе наведене аспекте, у комбинацији са методом коју је одобрила ФДА, препоручује се АРМС метода. Наравно, из тржишне перспективе, молекуларна дијагностика не би требало да ме наглашава
методе, али се фокусирајте на коначне исправне резултате. Различите лабораторије могу усвојити одговарајуће методе испитивања у складу са стварном ситуацијом, али само ако имају добре квалификације оператера и интерне системе контроле квалитета. У актуелним условима домаће лабораторијске средине, неопходно је тестирање вршити у стандардизованој ПЦР лабораторији и учествовати у домаћим и међународним активностима контроле квалитета између просторија како би се обезбедио поуздан квалитет лабораторијског испитивања. Стандардизовано управљање је неопходан услов за обезбеђивање сталних резултата. У Кини постоји хитна потреба за обједињавањем и стандардизацијом клиничког тестирања КРАС гена и генерисањем стандардизованог и стандардизованог програма тестирања према различитим потребама, а овај програм се може проширити на детекцију БРАФ, ПИК23450_3ЦА, ЕГФР и други гени за промовисање клиничког тестирања молекуларне патологије.
