セツキシマブやパニツムマブなどの標的薬は、結腸直腸がんの効果的な治療薬として臨床で広く使用されています。臨床データによると、KRAS 変異を持つ患者はこのモノクローナル抗体薬に有意な影響を及ぼさず、野生型患者のみがその恩恵を受けることができます。したがって、KRAS遺伝子変異の状態は、大腸癌の予後や治療効果と強い相関関係を持つ重要な治療マーカーとして臨床的に考えられている。 2009 年の全米がん総合ネットワーク (NCCN) 結腸直腸がん診療ガイドラインでは、転移性結腸直腸がん患者はすべて KRAS 遺伝子変異状態を検出する必要があり、EGFR 標的療法を受けるには KRAS 野生型のみが推奨されていると規定されています。同年、米国臨床腫瘍学会 (ASCO) も、腫瘍標的療法の分子マーカーとして同じ臨床治療推奨事項を発表しており、その重要な指針となる重要性が示されています。現在、KRAS遺伝子検査は臨床的に広く行われています。主に国内のKRAS遺伝子変異検出法を臨床選択の参考として評価しています。
1.結腸直腸癌におけるKRAS遺伝子変異の陽性率
結腸直腸癌では、KRAS遺伝子の変異率は35％から45％と高く、高リスクの変異部位はエクソン12のコドン13と2であり、61と146のようなまれなものがまだあります。変異地点。 KRAS遺伝子変異には、直接配列決定、高分解能融解曲線分析（HRM）、パイロシーケンシング、定量的PCR、変異増幅ブロックシステム（増幅）非難治性変異システム（ARMS）、制限断片長多型（RFLP）など、多くの検出方法があります。ポリメラーゼ連鎖反応-一本鎖コンフォメーション多型分析（PCR-一本鎖コンフォメーション多型（PCR-SSCP）、低変性温度PCR（COLD-PCR）での共増幅、高性能液体クロマトグラフィー分析など）。
2.KRAS変異検出法の評価
1. ダイレクトシーケンシング法：KRAS遺伝子変異を検出するための最も古典的な方法であり、遺伝子変異を検出するためのゴールドスタンダードでもあります。 ジデオキシシーケンシングの原理に基づく直接シーケンシング法は、ベースピークマップの形で遺伝子配列の変化を最も直感的に示すことができます。 検出タイプはより包括的であり、最も初期に適用された突然変異検出方法でもあります。 新世代のシーケンシングプラットフォームの出現にもかかわらず、国内外の学者は、新しい方法の信頼性を測定および決定するための尺度として、直接シーケンシングの結果を依然として使用しています。 Gao Jing etal。 結腸直腸癌の966人の患者におけるKRASおよびBRAF遺伝子変異の検出に直接配列決定を適用しました。 これは、文献で報告されている国内最大のサンプルを使用したKRAS遺伝子変異の分析でもあります。 Ling Yunらは、直接配列決定法が各遺伝子の突然変異状態を理解するための最も直接的で効果的な検出方法であり、特に未知の突然変異の検出において、突然変異のタイプを明らかにできると信じています。 この方法の感度は比較的低いですが、腫瘍細胞を濃縮するための顕微解剖などの方法によって改善することができます。 直接シーケンシング法は、他の国内研究グループのより大きなサンプルサイズのKRAS検出にも適用されています。 ただし、感度が低いことが直接シーケンスの最大の欠点です。 中国で報告された結果から判断すると、直接配列決定による変異検出率は低くありません。 Liu Xiaojing etal。 ダイレクトシーケンシングとペプチド核酸クランプPCR（PNA-PCR）を比較し、43例のKRAS遺伝子変異がダイレクトシーケンシングによって検出されたことを発見しました。 これらの変異に加えて、PNA-PCRも直接シーケンシングによって検出されました。 野生型でXNUMXの突然変異が発見され、PCRと突然変異患者を決定するための直接配列決定法によって野生型患者を決定するための提案がなされた。 Qiu Tian etal。 蛍光PCRに最適化されたオリゴヌクレオチドプローブ法と直接配列決定法により131の結腸直腸癌検体が検出され、KRAS遺伝子変異の陽性率は41.2％（54/131）と40.5％（53/131）でした。 Bai Dongyuは、さまざまな方法の検出感度についても説明しました。 200人の結腸直腸癌患者のうち、63人がRT-qPCR変異によって検出され、変異検出率は31.5％でした。 169例の変異、変異検出率50％を直接シーケンスすることにより、29.6サンプルのシーケンスに成功しました。 ダイレクトシーケンシング法は、KRAS遺伝子の変異状態を正確、客観的、具体的に検出できますが、高い技術的要件、複雑な操作手順、相互汚染を引き起こしやすい、結果の時間と手間のかかる解釈などの欠点も非常にあります。明らかです。 多くの場合、シーケンシング装置がなく、試験のために対応する会社に検体を送る必要がありますが、これには時間がかかり、コストもかかるため、大きな制限があります。
パイロシーケンス法：
パイロシーケンシング法は、シーケンシング感度、検出コスト、および報告時間の観点から、KRAS遺伝子変異検出のより便利な方法でもあります。 この方法の再現性は優れています。 得られたピークマップによると、ある部位の変異頻度の定量的研究と、異なる部位の変異頻度の比較が一目でわかります。 近年、荻野ら、ハッチンスら。 パイロシーケンス技術を使用して、結腸直腸癌の大量のサンプルを持つ患者のKRAS変異をテストしました。 結果は、パイロシーケンス技術が標的療法のために患者をスクリーニングするための強力なツールであることを示しています。 腫瘍分子診断には幅広い応用の見通しがあります。 国内の学者はまた、パイロシーケンス技術を使用して、結腸直腸癌のKRAS変異を高い精度と信頼性で臨床的に検出しています。 この方法は、より優れた特異性とより高い感度を備えています。 SundstrÖmetal。 臨床応用における対立遺伝子特異的PCRとパイロシーケンスを比較し、結腸直腸癌患者のKRAS変異の314例において、パイロシーケンスの特異性が対立遺伝子の特異性よりも優れていることを発見しました。 PCRであり、腫瘍細胞の含有量が少ない組織に対して優れた感度を示します。 腫瘍細胞の割合を1.25％から2.5％に希釈します。 パイロシーケンスは、変異シグナルを検出できます。 サンガーシーケンシングで検出するためにサンプル中の変異対立遺伝子の最小含有量が20％に達する必要がある場合、10％に達するとHRM法で検出でき、パイロシーケンスでは変異のみが5％で検出できます。 対立遺伝子。 パイロシーケンスを使用して、結腸直腸癌の717人の患者のKRAS変異を検出し、KRAS変異の頻度が40.9％であることを発見しました。 コドン12の変異率は30.1％、コドン13の変異率は9.8％、コドン61の変異率は1.0％でした。 テストの前に手動の顕微解剖によって腫瘍含有量の高い組織を濃縮し、結果の信頼性を高めました。 この方法は、感度と特異性が高く、臨床現場での開発が容易です。 パイロシーケンスの欠点は、検出コストが高いことであり、サンプルをシーケンスするために一本鎖DNAを準備するプロセスは面倒です。 将来的には、パイロシーケンスは二本鎖PCR産物を直接検出する技術の開発に専念することができ、これにより操作が大幅に簡素化されます。 また、シーケンスのコストを効果的に削減して、臨床試験の包括的な推進を実現します。
3. ARMSメソッド：
この技術は、プライマーを使用して野生型遺伝子と変異型遺伝子を区別します。
ichは早くも1980年代に報告されています。 この方法の最大の利点は、最大1.0％の感度があり、1.0％という低いサンプルから変異遺伝子を検出できることです。 設計上、ターゲット製品の長さを最大限に短縮することができ、パラフィン包埋組織標本から抽出されたDNAのほとんどが断片化されているため、正確な検出結果が得られないという問題があります。 このテクノロジーは、リアルタイムPCRプラットフォームを組み合わせて、増幅中にクローズドチューブ操作を実現します。 操作は簡単で、製品の後処理を必要としないため、増幅された製品の汚染を最大限に回避できます。 現在、サソリプローブと増幅ブロック変異システムを組み合わせたサソリ-ARMS法が世界でより一般的に使用されています。 167つのテクノロジーの組み合わせにより、双方の感度と特異性を最大化できます。 Gao Jie etal。 この方法を使用して、結腸直腸癌の151人の患者のKRAS遺伝子変異状態を検出しました。これは、この方法が信頼性が高く正確であることを示唆しています。 Wang Hui etal。 また、ARMSを使用して、ホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋組織のXNUMX例のKRAS変異を検出しました。 米国では、KRASの臨床試験用にFDAによって承認されたCOBASキット（Roche）と欧州連合の体外診断（CE-IVD）によって認定されたTherascreen RGQキット（Qiagen）はすべてARMSの原則を使用しています。 一般的な方法の中で、ARMS法が最も感度が高く、コストは比較的合理的です。 したがって、国内外のKRAS遺伝子の臨床的検出の大部分はARMS法を使用していますが、この方法はPCR技術に基づいているため、既知の部位の変異しか検出できないという欠点があります。
4.リアルタイム蛍光定量PCR法：
Ct値により変異を判定するPCRベースの検出方法です。強い特異性、高感度、正確な定量、簡単な操作、完全クローズド反応という利点があります。多くの実験グループが、結腸直腸がんにおける KRAS 変異の検出にこの方法を採用しています。ダイレクトシークエンシング法と比較して、定量的 PCR は感度の点で大きな利点を占めます。 280 つの方法を比較するほとんどの学者は、定量的 PCR の方が感度が高いと考えています。劉偉ら。 94つの方法を使用して、33.57例の結腸直腸癌KRAS遺伝子変異、94例のKRAS遺伝子配列変異の検出結果を詳細に分析したところ、陽性率は280%(91/96.8)であり、そのうちリアルタイム蛍光定量PCR 陽性の 91 例の感度は 94% (186/184) でした。野生型の遺伝子配列を解析した 98.9 例のうち、184 例はリアルタイム定量 PCR で陰性であり、特異性は 186% (98.2/90) でした。リアルタイム蛍光定量PCR法とダイレクト遺伝子配列法との一致率は100%であった。 XNUMX つの検出方法において、各変異部位の陽性および陰性の一致率は XNUMX% 以上であり、XNUMX つの部位の一致率は XNUMX% に達しました。 XNUMX つの方法の検出結果は非常に一貫しており、蛍光定量 PCR が変異検出にとってより信頼性の高い方法であることを示しています。ただし、PCR ベースの方法では、既知の変異タイプに基づいてプライマーとプローブを設計する必要があるため、考えられるすべての変異を検出することはできず、特定の部位のみを検出できます。キットの検出範囲に特定の部位が含まれていない場合、実際に変異があってもキットの結果は陰性となります。さらに、定量的 PCR の感度は高いものの、偽陽性が存在するかどうかを DNA シークエンシング技術によって検証するか、KRAS 変異の状態と標的遺伝子の有効性との相関を確認するために大規模なサンプルサイズでの遡及的および前向きの臨床実験を行う必要があります。薬。したがって、突然変異検出の高感度をやみくもに追求すべきではなく、検出の特異性や精度を無視すべきではありません。研究室の条件が異なると、検体における突然変異検出に最適な方法も異なる場合があります。変異の割合が高い検体については、サンガーシーケンシング法による遺伝子変異の検出精度が高くなりますが、変異の割合が低い検体については、サンガーシーケンシング法による偽陰性が生じる可能性があり、蛍光PCRを技術基盤とした検出法が適しています。感度の高さが特徴と言えます。
5. HRMメソッド：
これは、近年最も一般的に使用されている遺伝子検出方法の64つです。 汚染を回避するために、シンプル、高速、高感度、単一チューブの利点があります。 臨床試験での使用の実現可能性を調査するために、Liu LiqinらはHRM法を使用して、結腸直腸癌の10人の患者のKRAS遺伝子変異を検出し、直接シーケンスを使用して結果を検証しました。 HRMと直接シーケンスの結果は一貫していることがわかります。 直接シーケンシングと比較して、HRMによるKRAS遺伝子変異の検出は簡単で正確であり、臨床試験に適した信頼できる方法であることを示唆しています。 Chen Zhihong etal。 HRM法を使用して、さまざまな比率のKRAS変異プラスミドを含む一連の混合サンプルをテストし、感度を評価しました。 混合サンプル中のプラスミド変異の割合は10％であり、感度は60％に達したことがわかりました。 その後、この方法を使用して、100の結腸直腸癌組織サンプルにおけるKRAS遺伝子変異を検出しました。 ダイレクトシーケンシング法と比較して、HRM法の感度は96％、特異性は43％（45/156）でした。 HRM法の欠点は、特定の変異タイプとどのコドンが変異しているかを正確に提供することが不可能なことです。 融解曲線に異常が見つかった場合は、変異の種類を決定するためのシーケンス方法が必要です。 Harlé研究グループは、XNUMX例の結腸直腸癌組織を使用して、蛍光PCR、ARMS、およびHRM法を比較しました。 結果は、XNUMXつの方法は臨床試験に適していますが、HRMの信頼性は他のXNUMXつの方法ほど良くないことを示唆しています。
6.その他の方法：
上記の方法に加えて、PCR-SSCP、高速液体クロマトグラフィー、蛍光PCRに最適化されたオリゴヌクレオチドプローブ法、ネステッドPCRとARMSの組み合わせの方法、COLD-PCRなど、他の検出方法にもアプリケーションでの長所と短所があります。方法など。高速液体クロマトグラフィーは強い特異性を持っていますが、サンプルの需要は大きいです。 PCR-SSCPは低コストで経済的ですが、操作は複雑です。 蛍光PCRに基づく変異検出技術は、強い特異性、高感度、正確な定量、簡単な操作、完全にブロックされた反応などの利点がありますが、すべて既知の変異タイプに従ってプライマーとプローブを設計する必要があるため、特定の部位のみが可能です。検出され、すべての可能な突然変異を検出することはできません。
3。 概要
要約すると、異なる検査室での変異部位と検出方法が均一ではないため、分析される腫瘍標本のサイズとDNA抽出の品質も不均一であり、その結果、検査室間で大小の実験結果が存在します。 KRAS遺伝子変異検出の問題は、さまざまな国で懸念される臨床検出の問題になっています。 現在、KRAS遺伝子の変異を検出する方法はたくさんあります。 高から低への感度は、ARMS、パイロシーケンス、HRM、リアルタイム定量PCR、および直接シーケンスです。 臨床の現実から、感度が低いと臨床治療に役立ちませんが、感度が高すぎると検出の特異性が低下し、不必要な偽陽性の結果が発生して、患者のその後の投薬計画に影響を与える可能性があります。 上記の側面を考慮し、FDAによって承認された方法と組み合わせて、ARMS方法をお勧めします。 もちろん、市場の観点から、分子診断は私を強調するべきではありません
ただし、最終的な正しい結果に焦点を当ててください。 さまざまな研究所が実際の状況に応じて適切な試験方法を採用できるのは、優れたオペレーター資格と内部品質管理システムがある場合に限られます。 現在の国内の検査室環境条件では、信頼できる検査品質を確保するには、標準化された PCR 検査室で検査を実施し、国内外の室内品質管理活動に参加する必要があります。 一定の成果を保証するには、標準化された管理が必要条件です。 中国では、KRAS遺伝子の臨床検査を統一して標準化し、さまざまなニーズに応じて標準化された検査プログラムを作成することが緊急の必要性があり、このプログラムはBRAF、PIK23450_3CA、EGFR、および臨床分子病理学検査を促進する他の遺伝子。
