Des médicaments ciblés tels que le cétuximab et le panitumumab ont été largement utilisés en clinique comme médicaments thérapeutiques efficaces contre le cancer colorectal. Les données cliniques montrent que les patients présentant des mutations KRAS n'ont aucun effet significatif sur cet anticorps monoclonal et que seuls les patients de type sauvage peuvent en bénéficier. Par conséquent, le statut de mutation du gène KRAS est cliniquement considéré comme un marqueur thérapeutique important, qui présente une forte corrélation avec le pronostic et l'effet du traitement du cancer colorectal. Les lignes directrices de pratique clinique du cancer colorectal du National Cancer Comprehensive Network (NCCN) de 2009 stipulent que tous les patients atteints d'un cancer colorectal métastatique doivent détecter le statut de mutation du gène KRAS, et seul le type sauvage KRAS est recommandé pour recevoir un traitement ciblé par l'EGFR. La même année, l'American Society of Clinical Oncology (ASCO) a également publié les mêmes recommandations de traitement clinique en tant que marqueur moléculaire pour la thérapie ciblée sur les tumeurs, ce qui montre son importance directrice. À l’heure actuelle, les tests génétiques KRAS ont été largement réalisés en clinique. Nous évaluons principalement les méthodes nationales de détection des mutations du gène KRAS à titre de référence dans la sélection clinique.
1. Le taux positif de mutation du gène KRAS dans le cancer colorectal
Dans le cancer colorectal, le taux de mutation du gène KRAS est aussi élevé que 35% à 45%, et le site de mutation à haut risque est les codons 12 et 13 sur l'exon 2, et il en existe encore de rares tels que 61 et 146. Mutation placer. Il existe de nombreuses méthodes de détection des mutations géniques KRAS, y compris le séquençage direct, l'analyse de la courbe de fusion à haute résolution (HRM), le pyroséquençage, la PCR quantitative, le système de mutation par blocs d'amplification (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP), analyse de polymorphisme de conformation par réaction en chaîne par polymérase simple brin (polymorphisme de confomation par PCR-monomère (PCR-SSCP), co-amplification à basse température de dénaturation PCR (COLD-PCR) et analyse par chromatographie liquide haute performance, etc.
2. Évaluation des méthodes de détection des mutations KRAS
1. Méthode de séquençage direct: C'est la méthode la plus classique pour détecter les mutations du gène KRAS, et c'est également l'étalon-or pour la détection des mutations géniques. La méthode de séquençage direct basée sur le principe du séquençage didésoxy peut montrer le plus intuitivement le changement de séquence génique sous la forme d'une carte des pics de base. Le type de détection est plus complet et il s'agit également de la première méthode de détection de mutation appliquée. Malgré l'émergence de plates-formes de séquençage de nouvelle génération, les chercheurs nationaux et étrangers utilisent toujours les résultats du séquençage direct comme échelle pour mesurer et déterminer la fiabilité de la nouvelle méthode. Gao Jing et coll. Séquençage direct appliqué à la détection des mutations des gènes KRAS et BRAF chez 966 patients atteints d'un cancer colorectal. Il s'agit également de l'analyse de la mutation du gène KRAS avec le plus grand échantillon national rapporté dans la littérature. Ling Yun et d'autres pensent que la méthode de séquençage direct est la méthode de détection la plus directe et la plus efficace pour comprendre l'état de mutation de chaque gène, ce qui peut clarifier le type de mutation, en particulier pour la détection de mutations inconnues. Bien que la sensibilité de cette méthode soit relativement faible, elle peut être améliorée par des méthodes telles que la microdissection pour enrichir les cellules tumorales. La méthode de séquençage direct a également été appliquée à la détection KRAS d'échantillons de plus grande taille dans d'autres groupes de recherche nationaux. Cependant, une sensibilité plus faible est le plus gros inconvénient du séquençage direct. À en juger par les résultats rapportés en Chine, le taux de détection des mutations par séquençage direct n'est pas faible. Liu Xiaojing et coll. Comparé le séquençage direct et la PCR peptidique par pince d'acide nucléique (PNA-PCR) et a constaté que 43 cas de mutations du gène KRAS ont été détectés par séquençage direct. En plus de ces mutations, la PNA-PCR a également été détectée par séquençage direct. Dix mutations ont été trouvées dans le type sauvage, et des suggestions ont été faites pour déterminer les patients de type sauvage par PCR et la méthode de séquençage direct pour déterminer les patients mutants. Qiu Tian et coll. Détecté 131 échantillons de cancer colorectal par la méthode de sonde oligonucléotidique fluorescente optimisée par PCR et la méthode de séquençage direct, et les taux positifs de mutations du gène KRAS étaient de 41.2% (54/131) et 40.5% (53/131)). Bai Dongyu a également discuté de la sensibilité de détection de différentes méthodes. Sur les 200 patients atteints de cancer colorectal, 63 ont été détectés par des mutations RT-qPCR et le taux de détection de mutations était de 31.5%; 169 échantillons ont été séquencés avec succès par séquençage direct de 50 cas de mutation, taux de détection de mutation 29.6%. Bien que la méthode de séquençage direct puisse détecter avec précision, objectivement et spécifiquement l'état de mutation du gène KRAS, ses lacunes telles que des exigences techniques élevées, des procédures opérationnelles complexes, une contamination croisée facile à provoquer et une interprétation longue et laborieuse des résultats sont également très évident. Souvent, il n'y a pas d'équipement de séquençage et l'échantillon doit être envoyé à la société correspondante pour les tests, ce qui prend beaucoup de temps et a un coût élevé, donc il a de grandes limites.
Méthode de pyroséquençage:
La méthode de pyroséquençage est également une méthode plus pratique pour la détection de la mutation du gène KRAS en termes de sensibilité de séquençage, de coût de détection et de temps de rapport. La répétabilité de cette méthode est meilleure. Selon la carte des pics obtenue L'étude quantitative de la fréquence de mutation d'un certain site et la comparaison entre les fréquences de mutation de différents sites sont claires en un coup d'œil. Ces dernières années, Ogino et al., Hutchins et al. Ont utilisé la technologie de pyroséquençage pour tester les mutations KRAS chez des patients présentant de grands échantillons de cancer colorectal. Les résultats indiquent que la technologie de pyroséquençage est un outil puissant pour le dépistage des patients en vue d'une thérapie ciblée. Le diagnostic moléculaire des tumeurs a de larges perspectives d'application. Les chercheurs nationaux ont également utilisé la technologie du pyroséquençage pour détecter cliniquement les mutations KRAS dans le cancer colorectal, avec une bonne précision et fiabilité. Cette méthode a une meilleure spécificité et une sensibilité plus élevée. SundstrÖm et coll. Comparé PCR et pyroséquençage spécifique allélique dans des applications cliniques et a constaté que dans 314 cas de mutations KRAS chez des patients atteints de cancer colorectal, la spécificité du pyroséquençage était supérieure à celle des allèles. PCR, et a une bonne sensibilité aux tissus à faible teneur en cellules tumorales. Diluer la proportion de cellules tumorales entre 1.25% et 2.5%. Le pyroséquençage peut encore détecter les signaux de mutation. Lorsque la teneur minimale en allèles mutants dans l'échantillon doit atteindre 20% pour être détectée par séquençage Sanger, elle peut être détectée par la méthode HRM lorsqu'elle atteint 10%, et pour le pyroséquençage, seules les mutations peuvent être détectées à 5%. Allèles. Nous avons utilisé le pyroséquençage pour détecter les mutations KRAS chez 717 patients atteints de cancer colorectal et avons constaté que la fréquence des mutations KRAS était de 40.9%. Le taux de mutation du codon 12 était de 30.1%, le taux de mutation du codon 13 était de 9.8% et le taux de mutation du codon 61 était de 1.0%. Nous avons enrichi les tissus avec un contenu tumoral plus élevé par microdissection manuelle avant les tests, rendant les résultats plus fiables. La méthode a une bonne sensibilité et spécificité, et est facile à développer dans la pratique clinique. L'inconvénient du pyroséquençage est le coût élevé de la détection et le processus de préparation d'ADN simple brin pour le séquençage d'échantillons est lourd. À l'avenir, le pyroséquençage pourra être consacré au développement d'une technologie de détection directe des produits de PCR double brin, ce qui simplifiera grandement l'opération. Et réduisez efficacement le coût du séquençage pour parvenir à une promotion complète des tests cliniques.
3. Méthode ARMS:
Cette technologie utilise des amorces pour faire la distinction entre les gènes de type sauvage et mutant, wh
ich a été signalé dès les années 1980. Le plus grand avantage de cette méthode est qu'elle a une sensibilité allant jusqu'à 1.0% et peut détecter des gènes mutants dans des échantillons aussi bas que 1.0%. Dans la conception, la longueur du produit cible peut être raccourcie dans la plus grande mesure, et le problème que des résultats de détection précis ne peuvent pas être obtenus parce que la plupart de l'ADN extrait de l'échantillon de tissu inclus en paraffine est fragmenté. Cette technologie combine la plate-forme de PCR en temps réel pour réaliser un fonctionnement en tube fermé pendant l'amplification. L'opération est simple et ne nécessite pas de post-traitement du produit, ce qui permet d'éviter au maximum la contamination du produit amplifié. À l'heure actuelle, la méthode scorpion-ARMS combinant sonde scorpion et système de mutation par bloc d'amplification est plus couramment utilisée dans le monde. La combinaison des deux technologies peut maximiser la sensibilité et la spécificité des deux côtés. Gao Jie et coll. Utilisé cette méthode pour détecter le statut de mutation du gène KRAS chez 167 patients atteints de cancer colorectal, ce qui suggère que cette méthode est fiable et précise. Wang Hui et coll. Également utilisé ARMS pour détecter les mutations KRAS dans 151 cas de tissus fixés au formaldéhyde et inclus en paraffine. Aux États-Unis, le kit COBAS (Roche) approuvé par la FDA pour les tests cliniques du KRAS et le kit Therascreen RGQ (Qiagen) certifié par l'Union européenne In Vitro Diagnostics (CE-IVD) utilisent tous le principe ARMS. Parmi les méthodes courantes, la méthode ARMS est la plus sensible et le coût est relativement raisonnable. Par conséquent, une grande partie de la détection clinique des gènes KRAS dans le pays et à l'étranger utilise la méthode ARMS, mais comme la méthode est basée sur la technologie PCR, son inconvénient est qu'elle ne peut être détectée que des mutations connues.
4. Méthode PCR quantitative par fluorescence en temps réel:
Il s'agit d'une méthode de détection basée sur la PCR pour déterminer la mutation par valeur Ct. Il présente les avantages d'une forte spécificité, d'une sensibilité élevée, d'une quantification précise, d'une opération facile et d'une réaction entièrement fermée. De nombreux groupes expérimentaux ont adopté cette méthode pour la détection des mutations KRAS dans le cancer colorectal. Par rapport à la méthode de séquençage direct, la PCR quantitative occupe un plus grand avantage en termes de sensibilité. La plupart des chercheurs comparant les deux méthodes estiment que la PCR quantitative est plus sensible. Liu Wei et coll. Utilisation de deux méthodes pour effectuer une analyse détaillée des résultats de détection de 280 cas de mutations du gène KRAS du cancer colorectal, 94 cas de mutations de séquençage du gène KRAS, le taux positif était de 33.57 % (94/280), dont fluorescence quantitative en temps réel La PCR était positive, 91 cas avaient une sensibilité de 96.8% (91/94). Sur les 186 cas de type sauvage séquencés, 184 étaient négatifs par PCR quantitative en temps réel, avec une spécificité de 98.9 % (184/186). Le taux de coïncidence entre la méthode de PCR quantitative par fluorescence en temps réel et la méthode de séquençage direct des gènes était de 98.2 %. Dans les deux méthodes de détection, les taux de coïncidence positive et négative de chaque site de mutation étaient supérieurs à 90 % et le taux de coïncidence de quatre sites atteignait 100 %. Les résultats de détection des deux méthodes étaient très cohérents, indiquant une PCR quantitative fluorescente. Il s'agit d'une méthode plus fiable pour la détection des mutations. Cependant, les méthodes basées sur la PCR doivent concevoir des amorces et des sondes basées sur des types de mutations connus, de sorte que toutes les mutations possibles ne peuvent pas être détectées et que seuls des sites spécifiques peuvent être détectés. Si un certain site n'est pas inclus dans la plage de détection du kit, même s'il y a effectivement une mutation, le résultat du kit reste négatif. En outre, bien que la sensibilité de la PCR quantitative soit élevée, la présence de faux positifs doit encore être vérifiée par la technologie de séquençage de l'ADN ou par des expériences cliniques rétrospectives et prospectives avec des échantillons de grande taille pour confirmer la corrélation entre le statut de la mutation KRAS et l'efficacité des traitements ciblés. drogues . Par conséquent, la haute sensibilité de la détection des mutations ne doit pas être recherchée aveuglément, tandis que la spécificité et l’exactitude de la détection doivent être ignorées. Dans différentes conditions de laboratoire, la méthode optimale de détection des mutations dans les échantillons peut également être différente. Pour les échantillons présentant une proportion plus élevée de mutations, la méthode de séquençage Sanger a une plus grande précision dans la détection des mutations génétiques, tandis que pour les échantillons présentant une proportion plus faible de mutations, la méthode de séquençage Sanger peut produire des faux négatifs et la méthode de détection utilisant la PCR fluorescente comme plate-forme technique. peut être caractérisé par une sensibilité élevée.
5. Méthode HRM:
C'est l'une des méthodes de détection de gènes les plus couramment utilisées ces dernières années. Il présente les avantages d'un tube simple, rapide, sensible et unique pour éviter la pollution. Afin d'explorer la faisabilité de son utilisation dans les tests cliniques, Liu Liqin et d'autres ont utilisé la méthode HRM pour détecter les mutations du gène KRAS chez 64 patients atteints de cancer colorectal, puis ont utilisé le séquençage direct pour vérifier les résultats. Les résultats de la GRH et du séquençage direct sont cohérents. Par rapport au séquençage direct, la détection des mutations du gène KRAS par HRM est simple et précise, ce qui suggère qu'il s'agit d'une méthode fiable adaptée aux essais cliniques. Chen Zhihong et coll. Utilisé la méthode HRM pour tester une série d'échantillons mixtes contenant différentes proportions de plasmides mutants KRAS pour évaluer leur sensibilité. Il a été constaté que la proportion de mutations plasmidiques dans les échantillons mixtes était de 10% et que la sensibilité atteignait 10%. Par la suite, la méthode a été utilisée pour détecter les mutations du gène KRAS dans 60 échantillons de tissus de cancer colorectal. Par rapport à la méthode de séquençage direct, la sensibilité de la méthode HRM était de 100% et la spécificité de 96% (43/45). L'inconvénient de la méthode HRM est qu'il est impossible de fournir avec précision le type de mutation spécifique et quel codon est muté. Si une anomalie est trouvée sur la courbe de fusion, une méthode de séquençage est nécessaire pour déterminer le type de mutation. Le groupe de recherche Harlé a utilisé 156 cas de tissu de cancer colorectal pour comparer les méthodes fluorescentes PCR, ARMS et HRM. Les résultats suggèrent que bien que les trois méthodes conviennent aux essais cliniques, la fiabilité de la GRH n'est pas aussi bonne que les deux autres méthodes.
6. Autres méthodes:
En plus des méthodes mentionnées ci-dessus, d'autres méthodes de détection ont leurs propres avantages et inconvénients dans l'application, tels que la PCR-SSCP, la chromatographie liquide haute performance, la méthode de sonde oligonucléotidique fluorescente optimisée pour la PCR, la méthode de combinaison PCR imbriquée et ARMS, COLD-PCR méthode, etc. La chromatographie liquide à haute performance a une forte spécificité, mais la demande d'échantillons est importante; La PCR-SSCP est peu coûteuse et économique, mais l'opération est compliquée; la technologie de détection de mutation basée sur la PCR fluorescente a une forte spécificité, une sensibilité élevée et une précision quantitative, un fonctionnement facile, une réaction entièrement bloquée et d'autres avantages, mais tous doivent concevoir des amorces et des sondes en fonction du type de mutation connu, de sorte que seuls des sites spécifiques peuvent être détecté, et toutes les mutations possibles ne peuvent pas être détectées.
3. Résumé
En résumé, comme les sites de mutation et les méthodes de détection dans les différents laboratoires ne sont pas uniformes, la taille des échantillons tumoraux analysés et la qualité de l'extraction de l'ADN sont également inégales, ce qui entraîne l'existence de grands ou petits résultats expérimentaux entre les laboratoires Différences, la standardisation de la détection des mutations génétiques KRAS est devenue un problème de détection clinique préoccupant dans divers pays. À l'heure actuelle, il existe de nombreuses méthodes pour détecter des mutations dans le gène KRAS. La sensibilité de haut en bas est ARMS, pyroséquençage, HRM, PCR quantitative en temps réel et séquençage direct. D'après la réalité clinique, une faible sensibilité n'est pas propice au traitement clinique, mais des méthodes trop sensibles entraîneront une baisse de la spécificité de la détection, et des faux positifs inutiles peuvent survenir et affecter le régime médicamenteux ultérieur du patient. Compte tenu des aspects ci-dessus, combinés à la méthode approuvée par la FDA, la méthode ARMS est recommandée. Bien sûr, du point de vue du marché, le diagnostic moléculaire ne doit pas me mettre l'accent
thods, mais concentrez-vous sur les résultats finaux corrects. Différents laboratoires peuvent adopter des méthodes de test appropriées en fonction de la situation réelle, mais uniquement s'ils disposent de bonnes qualifications d'opérateur et de systèmes de contrôle qualité internes. Dans les conditions environnementales actuelles des laboratoires nationaux, il est nécessaire d'effectuer des tests dans un laboratoire de PCR standardisé et de participer à des activités de contrôle de la qualité inter-salles nationales et internationales pour garantir une qualité fiable des tests de laboratoire. Une gestion standardisée est une condition nécessaire pour assurer des résultats constants. En Chine, il y a un besoin urgent d'unifier et de standardiser les tests cliniques du gène KRAS, et de générer un programme de test standardisé et standardisé en fonction des différents besoins, et ce programme peut être étendu à la détection de BRAF, PIK23450_3CA, EGFR et d'autres gènes pour promouvoir les tests cliniques de pathologie moléculaire.
