Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Den positiva frekvensen av KRAS-genmutation i kolorektal cancer
Vid kolorektal cancer är mutationsgraden för KRAS-genen så hög som 35% till 45%, och högriskmutationsstället är kodoner 12 och 13 på exon 2, och det finns fortfarande sällsynta sådana som 61 och 146. Mutation webbplats. Det finns många detektionsmetoder för KRAS-genmutationer, inklusive direkt sekvensering, högupplöst smältkurvanalys (HRM), pyrosekvensering, kvantitativ PCR, mutationsförstärkningsblocksystem (amplinc atio) nrefractormutation system (ARMS), restriktionsfragmentlängspolymorfism (RFLP) polymeraskedjereaktion-enkelsträngad konformationspolymorfismanalys (PCR-singlestrand confomation polymorfism (PCR-SSCP), samförstärkning vid PCR med lägre denatureringstemperatur (COLD-PCR) och högpresterande vätskekromatografianalys etc.
2. Utvärdering av KRAS-mutationsdetekteringsmetoder
1. Direkt sekvenseringsmetod: Det är den mest klassiska metoden för att detektera KRAS-genmutationer, och det är också guldstandarden för att detektera genmutationer. Den direkta sekvenseringsmetoden baserad på principen om dideoxisekvensering kan mest intuitivt visa förändringen av gensekvensen i form av bastoppskarta. Detekteringstypen är mer omfattande och det är också den tidigaste metoden för mutationsdetektering. Trots framväxten av nya generationens sekvenseringsplattformar använder forskare hemma och utomlands fortfarande resultaten av direkt sekvensering som en skala för att mäta och bestämma tillförlitligheten hos den nya metoden. Gao Jing et al. Tillämpade direkt sekvensering för detektion av KRAS- och BRAF-genmutationer hos 966 patienter med kolorektal cancer. Detta är också analysen av KRAS-genmutationen med det största inhemska provet som rapporterats i litteraturen. Ling Yun och andra tror att metoden med direkt sekvensering är den mest direkta och effektiva detektionsmetoden för att förstå mutationsstatus för varje gen, vilket kan klargöra typen av mutation, särskilt för detektering av okända mutationer. Även om känsligheten hos denna metod är relativt låg kan den förbättras med metoder såsom mikrodissektion för att berika tumörceller. Den direkta sekvenseringsmetoden har också tillämpats på KRAS-detektering av större provstorlekar i andra inhemska forskargrupper. Dock är lägre känslighet den största nackdelen med direkt sekvensering. Att döma av de rapporterade resultaten i Kina är mutationsdetekteringsgraden genom direkt sekvensering inte låg. Liu Xiaojing et al. Jämförde direkt sekvensering och peptidnukleinsyraklämma PCR (PNA-PCR) och fann att 43 fall av KRAS-genmutationer detekterades genom direkt sekvensering. Förutom dessa mutationer detekterades också PNA-PCR genom direkt sekvensering. Tio mutationer hittades i vildtypen och förslag lades för att bestämma vildtypspatienterna med PCR och den direkta sekvenseringsmetoden för att bestämma mutantpatienterna. Qiu Tian et al. Detekterade 131 kolorektalcancerprover med fluorescerande PCR-optimerad oligonukleotidsondmetod och direkt sekvenseringsmetod, och de positiva hastigheterna för KRAS-genmutationer var 41.2% (54/131) och 40.5% (53/131)). Bai Dongyu diskuterade också detekteringskänsligheten hos olika metoder. Av de 200 patienter med kolorektal cancer upptäcktes 63 genom RT-qPCR-mutationer och mutationsdetekteringsgraden var 31.5%; 169 prover sekvenserades framgångsrikt genom direkt sekvensering 50 fall av mutation, mutationsdetekteringsgrad 29.6%. Även om den direkta sekvenseringsmetoden exakt, objektivt och specifikt kan upptäcka KRAS-genmutationsstatusen, är dess brister såsom höga tekniska krav, komplicerade operationer, enkla att orsaka korskontaminering och tidskrävande och mödosam tolkning av resultaten också mycket uppenbar. Ofta finns det ingen sekvenseringsutrustning, och exemplet måste skickas till motsvarande företag för testning, vilket tar lång tid och har en hög kostnad, så det har stora begränsningar.
Pyrosekvenseringsmetod:
Pyrosekvenseringsmetoden är också en mer bekväm metod för KRAS-genmutationsdetektering när det gäller sekvensbestämningskänslighet, detekteringskostnad och tid att rapportera. Repeterbarheten för denna metod är bättre. Enligt den erhållna toppkartan Den kvantitativa studien av mutationsfrekvensen för en viss plats och jämförelsen mellan mutationsfrekvenserna för olika platser är tydlig vid en överblick. På senare år har Ogino et al., Hutchins et al. Har använt pyrosekvenseringsteknik för att testa KRAS-mutationer hos patienter med stora prover av kolorektal cancer. Resultaten indikerar att pyrosekvenseringsteknik är ett kraftfullt verktyg för screening av patienter för riktad terapi. Tumörmolekylär diagnos har breda användningsmöjligheter. Inhemska forskare har också använt pyrosekvenseringsteknik för att kliniskt upptäcka KRAS-mutationer i kolorektal cancer med god noggrannhet och tillförlitlighet. Denna metod har bättre specificitet och högre känslighet. SundstrÖm et al. Jämfört allelspecifik PCR och pyrosekvensering i kliniska applikationer och fann att i 314 fall av KRAS-mutationer hos kolorektal cancerpatienter var specificiteten för pyrosekvensering överlägsen den för alleler. PCR, och har god känslighet för vävnader med lågt tumörcellinnehåll. Späd ut andelen tumörceller till 1.25% till 2.5%. Pyrosekvensering kan fortfarande upptäcka mutationssignaler. När minimiinnehållet av mutanta alleler i provet måste nå 20% för att detekteras av Sanger-sekvensering, kan det detekteras med HRM-metoden när det når 10%, och för pyrosekvensering kan endast mutationer detekteras med 5%. Alleler. Vi använde pyrosekvensering för att upptäcka KRAS-mutationer hos 717 patienter med kolorektal cancer och fann att frekvensen av KRAS-mutationer var 40.9%. Mutationsgraden för kodon 12 var 30.1%, mutationsgraden för kodon 13 var 9.8% och mutationsgraden för kodon 61 var 1.0%. Vi berikade vävnaderna med högre tumörinnehåll genom manuell mikrodissektion innan testning, vilket gjorde resultaten mer tillförlitliga. Metoden har god känslighet och specificitet och är lätt att utveckla i klinisk praxis. Nackdelen med pyrosekvensering är den höga kostnaden för detektion, och processen med att framställa enkelsträngat DNA för sekvenseringsprover är besvärligt. I framtiden kan pyrosequencing ägnas åt utveckling av teknik för direkt detektering av dubbelsträngade PCR-produkter, vilket i hög grad förenklar driften. Och effektivt minska kostnaderna för sekvensering för att uppnå omfattande marknadsföring av kliniska tester.
3. ARMS-metod:
Denna teknik använder primers för att skilja mellan vildtyps- och mutantgener, wh
som har rapporterats så tidigt som på 1980-talet. Den största fördelen med denna metod är att den har en känslighet på upp till 1.0% och kan upptäcka mutanta gener i prover så låga som 1.0%. I designen kan målproduktens längd förkortas i största utsträckning och problemet att exakta detektionsresultat inte kan uppnås eftersom det mesta av DNA som extraheras från det paraffininbäddade vävnadsprovet är fragmenterat. Denna teknologi kombinerar PCR-plattformen i realtid för att uppnå slutna rördrift under förstärkning. Operationen är enkel och kräver ingen efterbehandling av produkten, vilket i största möjliga utsträckning kan undvika kontaminering av den förstärkta produkten. För närvarande används scorpion-ARMS-metoden som kombinerar skorpionsond och amplifieringsblockmutationssystem oftare i världen. Kombinationen av de två teknikerna kan maximera båda sidors känslighet och specificitet. Gao Jie et al. Användte denna metod för att upptäcka KRAS-genmutationsstatus hos 167 patienter med kolorektal cancer, vilket tyder på att denna metod är tillförlitlig och korrekt. Wang Hui et al. Används också ARMS för att detektera KRAS-mutationer i 151 fall av formaldehydfixerade och paraffininbäddade vävnader. I USA använder COBAS-satsen (Roche) godkänd av FDA för klinisk testning av KRAS och Therascreen RGQ-satsen (Qiagen) certifierad av Europeiska unionen In Vitro Diagnostics (CE-IVD) alla ARMS-principen. Bland de vanliga metoderna är ARMS-metoden den mest känsliga och kostnaden relativt rimlig. Därför använder en stor del av den kliniska detektionen av KRAS-gener hemma och utomlands ARMS-metoden, men eftersom metoden bygger på PCR-teknik är dess brist att den bara kan detekteras Kända platsmutationer.
4. Realtidsfluorescens kvantitativ PCR-metod:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. HRM-metod:
Det är en av de vanligaste gendetekteringsmetoderna de senaste åren. Det har fördelarna med enkelt, snabbt, känsligt och enda rör för att undvika föroreningar. För att undersöka genomförbarheten av dess användning vid klinisk testning använde Liu Liqin och andra HRM-metoden för att detektera KRAS-genmutationer hos 64 patienter med kolorektal cancer och använde sedan direkt sekvensering för att verifiera resultaten. Resultaten av HRM och direkt sekvensering har visat sig vara konsekventa. Jämfört med direkt sekvensering är detekteringen av KRAS-genmutationer med HRM enkel och korrekt, vilket tyder på att det är en pålitlig metod som är lämplig för klinisk testning. Chen Zhihong et al. Användte HRM-metoden för att testa en serie blandade prover innehållande olika proportioner av KRAS-mutanta plasmider för att utvärdera deras känslighet. Man fann att andelen plasmidmutationer i de blandade proverna var 10% och känsligheten nådde 10%. Därefter användes metoden för att detektera KRAS-genmutationer i 60 prover av kolorektal cancervävnad. Jämfört med den direkta sekvenseringsmetoden var känsligheten för HRM-metoden 100% och specificiteten var 96% (43/45). Nackdelen med HRM-metoden är att det är omöjligt att exakt tillhandahålla den specifika mutationstypen och vilket kodon som muteras. Om en abnormitet påträffas på smältkurvan, krävs sekvenseringsmetod för att bestämma mutationstypen. Forskargruppen Harlé använde 156 fall av kolorektal cancervävnad för att jämföra fluorescerande PCR-, ARMS- och HRM-metoder. Resultaten antyder att även om de tre metoderna är lämpliga för klinisk testning är tillförlitligheten hos HRM inte lika bra som de andra två metoderna.
6. Andra metoder:
Förutom de ovan nämnda metoderna har andra detektionsmetoder sina egna fördelar och nackdelar vid tillämpning, såsom PCR-SSCP, högpresterande vätskekromatografi, fluorescerande PCR-optimerad oligonukleotid-sondmetod, Metod för kapslad PCR och ARMS-kombination, COLD-PCR metod etc. Högpresterande vätskekromatografi har stark specificitet, men efterfrågan på prover är stor; PCR-SSCP har låg kostnad och är ekonomisk, men operationen är komplicerad. mutationsdetekteringstekniken baserad på fluorescerande PCR har stark specificitet, hög känslighet och exakt kvantitativ, enkel användning, helt blockerad reaktion och andra fördelar, men alla behöver utforma primers och sonder enligt den kända mutationstypen, så endast specifika platser kan vara upptäcktes och alla möjliga mutationer kan inte detekteras.
3. Sammanfattning
Sammanfattningsvis, eftersom mutationsställena och detektionsmetoderna i olika laboratorier inte är enhetliga, är storleken på de analyserade tumörproverna och kvaliteten på DNA-extraktion ojämn, vilket resulterar i att det finns stora eller små experimentella resultat mellan laboratorier Skillnader, standardisering av KRAS-genmutationsdetektering har blivit en klinisk detektionsfråga som oroar sig i olika länder. För närvarande finns det många metoder för att detektera mutationer i KRAS-genen. Känsligheten från hög till låg är ARMS, pyrosekvensering, HRM, realtids kvantitativ PCR och direkt sekvensering. Från den kliniska verkligheten bidrar inte låg känslighet till klinisk behandling, men alltför känsliga metoder kommer att göra att detekteringsspecificiteten minskar och onödiga falskt positiva resultat kan uppstå och påverka patientens efterföljande läkemedelsregim. Med tanke på ovanstående aspekter, i kombination med den metod som godkänts av FDA, rekommenderas ARMS-metoden. Naturligtvis, ur ett marknadsperspektiv, bör molekylär diagnostik inte betona mig
thods, men fokusera på de slutliga korrekta resultaten. Olika laboratorier kan anta lämpliga testmetoder beroende på den faktiska situationen, men bara om de har goda operatörskvalifikationer och interna kvalitetskontrollsystem. Under nuvarande inhemska laboratoriemiljöförhållanden är det nödvändigt att utföra testning i ett standardiserat PCR-laboratorium och delta i inhemska och internationella kvalitetskontrollaktiviteter mellan rummet för att säkerställa tillförlitlig laboratorietestkvalitet. Standardiserad förvaltning är en nödvändig förutsättning för att säkerställa konstanta resultat. I Kina finns det ett akut behov av att förena och standardisera den kliniska testningen av KRAS-genen, och att generera ett standardiserat och standardiserat testprogram enligt olika behov, och detta program kan utökas till detektion av BRAF, PIK23450_3CA, EGFR och andra gener för att främja klinisk molekylär patologitestning.
