Markmiðunarlyf eins og cetuximab og panitumumab hafa verið mikið notuð á heilsugæslustöðvum sem áhrifarík meðferðarlyf við ristilkrabbameini. Klínískar upplýsingar sýna að sjúklingar með KRAS stökkbreytingar hafa engin marktæk áhrif á þetta einstofna mótefnalyf og aðeins villigerðasjúklingar geta notið góðs af því. Þess vegna er klínískt litið á stöðu KRAS genstökkbreytinga sem mikilvægt meðferðarmerki, sem hefur sterka fylgni við horfur og meðferðaráhrif ristilkrabbameins. Í 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Clinical Practice Guidelines er kveðið á um að allir sjúklingar með krabbamein í ristli og endaþarmi með meinvörpum verði að greina stöðu KRAS-genastökkbreytinga og aðeins er mælt með KRAS villigerð til að fá EGFR markvissa meðferð. Sama ár gaf American Society of Clinical Oncology (ASCO) einnig út sömu klínískar meðferðarráðleggingar sem sameindamerki fyrir æxlismiðaða meðferð, sem sýnir mikilvæga leiðbeinandi þýðingu þess. Sem stendur hafa KRAS erfðafræðilegar prófanir verið víða gerðar klínískt. Við metum aðallega innlendar KRAS gena stökkbreytingar uppgötvunaraðferðir til viðmiðunar í klínísku vali.
1. Jákvæð hlutfall KRAS-stökkbreytinga í krabbameini í ristli og endaþarmi
Í krabbameini í ristli og endaþarmi er stökkbreytingartíðni KRAS-erfðavísisins eins hátt og 35% til 45% og stökkbreytingarstaður í mikilli áhættu er kóðar 12 og 13 í exon 2 og enn eru sjaldgæfir eins og 61 og 146. Stökkbreyting síða. Það eru margar greiningaraðferðir fyrir stökkbreytingar á KRAS, þar á meðal bein raðgreining, háupplausn bræðsluferlugreiningar (HRM), gervigreining, magn PCR, stökkbreytingarmyndunarkerfi (amplinc atio) nrefractormutation system (ARMS), skerðing brotalengd fjölbreytni (RFLP), fjölliða keðjuverkun - eins strengs fjölbreytileikagreining (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), sam-magnun við lægri denaturation hitastig PCR (COLD-PCR) og afkastamikil vökvaskilgreining o.fl.
2. Mat á greiningaraðferðum KRAS stökkbreytinga
1. Bein raðgreiningaraðferð: Þetta er klassískasta aðferðin til að greina stökkbreytingar á KRAS genum og hún er einnig gulls ígildi til að greina stökkbreytingar á genum. Bein raðgreiningaraðferð byggð á meginreglunni um dideoxy raðgreining getur sýnt breytilega genaröðina í formi grunntoppskorts. Greiningartegundin er yfirgripsmeiri og hún er einnig fyrsta aðferðin við greiningu stökkbreytinga. Þrátt fyrir tilkomu nýrra kynslóðar raðgreiningarvettvanga nota fræðimenn heima og erlendis enn niðurstöður beinnar raðgreiningar sem mælikvarða til að mæla og ákvarða áreiðanleika nýju aðferðarinnar. Gao Jing o.fl. Beitt beinni raðgreiningu til greiningar á stökkbreytingum á KRAS og BRAF hjá 966 sjúklingum með ristilkrabbamein. Þetta er einnig greiningin á stökkbreytingu KRAS með stærsta innlenda sýni sem greint hefur verið frá í bókmenntunum. Ling Yun og aðrir telja að bein raðgreiningaraðferðin sé beinasta og árangursríkasta greiningaraðferðin til að skilja stökkbreytingarstöðu hvers erfða, sem getur skýrt tegund stökkbreytinga, sérstaklega til að greina óþekktar stökkbreytingar. Þrátt fyrir að næmi þessarar aðferðar sé tiltölulega lítið, þá er hægt að bæta hana með aðferðum eins og örgreiningu til að auðga æxlisfrumur. Beinni raðgreiningaraðferðinni hefur einnig verið beitt við KRAS greiningu stærri úrtaksstærða hjá öðrum innlendum rannsóknarhópum. Hins vegar er lægra næmi stærsti ókosturinn við beina raðgreiningu. Miðað við niðurstöðurnar sem greint var frá í Kína er stökkbreytingartíðni með beinni raðgreiningu ekki lág. Liu Xiaojing o.fl. Samanborið við beina raðgreiningu og peptíð kjarnsýru klemmu PCR (PNA-PCR) og kom í ljós að 43 tilfelli af KRAS gen stökkbreytingum greindust með beinni raðgreiningu. Til viðbótar þessum stökkbreytingum greindist PNA-PCR einnig með beinni raðgreiningu. Tíu stökkbreytingar fundust í villtu gerðinni og tillögur komu fram til að ákvarða villta tegundarsjúklinga með PCR og beinni raðgreiningaraðferð til að ákvarða stökkbreyttu sjúklingana. Qiu Tian o.fl. Greindust 131 krabbamein í ristli og endaþarmi með flúrljómun PCR bjartsýnu fákeppni rannsakaðri aðferð og beinni raðgreiningaraðferð og jákvæð tíðni KRAS genbreytinga var 41.2% (54/131) og 40.5% (53/131)). Bai Dongyu fjallaði einnig um uppgötvun næmni mismunandi aðferða. Af 200 krabbameinssjúklingum í ristli og endaþarmi greindust 63 með RT-qPCR stökkbreytingum og greiningartíðni stökkbreytinga var 31.5%; 169 sýni tókst að raðgreina með beinni raðgreiningu 50 tilfelli stökkbreytinga, hlutfall uppgötvunarhlutfall 29.6%. Þrátt fyrir að bein raðaðferð geti nákvæmlega, hlutlægt og sérstaklega greint stöðu stökkbreytinga á erfðavísi KRAS, eru annmarkar hennar eins og miklar tæknilegar kröfur, flóknar aðgerðir, auðvelt að valda krossmengun og tímafrek og erfiðar túlkun á niðurstöðunum einnig mjög augljóst. Oft er enginn raðbúnaður og senda eintakið til samsvarandi fyrirtækis til prófunar, sem tekur langan tíma og hefur mikinn kostnað, svo það hefur miklar takmarkanir.
Pyrosequencing aðferð:
Pyrosequencing aðferð er einnig þægilegri aðferð til að greina stökkbreytingu á genum KRAS hvað varðar næmni raðgreiningar, greiningarkostnað og skýrslutíma. Endurtekjanleiki þessarar aðferðar er betri. Samkvæmt fengnu hámarkskorti Megindleg rannsókn á stökkbreytingartíðni tiltekins staðar og samanburður á stökkbreytingartíðni mismunandi staða er skýr í fljótu bragði. Undanfarin ár hafa Ogino o.fl., Hutchins o.fl. Hef notað gervigreiningartækni til að prófa KRAS stökkbreytingar hjá sjúklingum með stór sýni af endaþarmskrabbameini. Niðurstöðurnar benda til þess að gáttatækni sé öflugt tæki til að skima sjúklinga fyrir markvissri meðferð. Æxli sameindagreining hefur mikla möguleika á notkun. Innlendir fræðimenn hafa einnig notað gervigreiningartækni til að greina klínískt KRAS stökkbreytingar í endaþarmskrabbameini, með góðri nákvæmni og áreiðanleika. Þessi aðferð hefur betri sérstöðu og meiri næmi. SundstrÖm o.fl. Samanborið við samsamsvörun PCR og gjóskusviptingu í klínískum forritum og kom í ljós að í 314 tilfellum KRAS-stökkbreytinga hjá krabbameini í ristli og endaþarmi var sértækni gervigreiningar betri en samsætur. PCR og hefur góða næmi fyrir vefjum með lítið æxlisfrumuinnihald. Þynntu hlutfall æxlisfrumna í 1.25% til 2.5%. Pyrosequencing getur ennþá greint stökkbreytingarmerki. Þegar lágmarksinnihald stökkbreyttra samsætna í sýninu þarf að ná 20% til að greina með Sanger raðgreiningu, er hægt að greina það með HRM aðferð þegar það nær 10%, og fyrir gervigreiningu er aðeins hægt að greina stökkbreytingar um 5%. Alleles. Við notuðum gervigreiningu til að greina KRAS stökkbreytingar hjá 717 sjúklingum með endaþarmskrabbamein og komumst að því að tíðni KRAS stökkbreytinga var 40.9%. Stökkbreytingartíðni codon 12 var 30.1%, stökkbreytingartíðni codon 13 var 9.8% og stökkbreytingarhlutfall codon 61 var 1.0%. Við auðguðum vefina með hærra æxlisinnihaldi með handvirkri smáskiptingu fyrir próf og gerðum árangurinn áreiðanlegri. Aðferðin hefur góða næmni og sérstöðu og er auðvelt að þróa hana í klínískri framkvæmd. Ókosturinn við pyrosequencing er mikill greiningarkostnaður og ferlið við að búa til einstrengað DNA fyrir raðgreiningarsýni er fyrirferðarmikið. Í framtíðinni er hægt að helga pyrosequencing til þróunar tækni til beinnar uppgötvunar á tvöföldum þráðlausum PCR vörum, sem mun einfalda aðgerðina til muna. Og dregið í raun úr kostnaði við raðgreiningu til að ná fram alhliða kynningu á klínískum prófum.
3. ARMS aðferð:
Þessi tækni notar grunnur til að greina á milli villta tegundar og stökkbreyttra gena, wh
þeirra hefur verið tilkynnt strax á níunda áratugnum. Stærsti kosturinn við þessa aðferð er að hún hefur allt að 1980% næmi og getur greint stökkbreytt gen í sýnum niður í 1.0%. Í hönnuninni er hægt að stytta lengd markafurðarinnar að mestu leyti og vandamálið að ekki er hægt að fá nákvæmar uppgötvunarniðurstöður vegna þess að mest af DNA sem dregið er úr paraffín-innfelldu vefjasýni er sundurliðað. Þessi tækni sameinar rauntíma PCR vettvang til að ná lokaðri aðgerð meðan á mögnun stendur. Aðgerðin er einföld og krefst ekki eftirvinnslu vörunnar, sem getur komið í veg fyrir mengun magnaðrar vöru að mestu leyti. Sem stendur er algengara að nota scorpion-ARMS aðferðin sem sameinar sporðdreka og stökkbreytingarkerfi. Samsetning tækninnar tveggja getur hámarkað næmi og sérstöðu beggja aðila. Gao Jie o.fl. Notaði þessa aðferð til að greina stöðu stökkbreytinga á KRAS hjá 1.0 sjúklingum með ristilkrabbamein, sem bendir til þess að þessi aðferð sé áreiðanleg og nákvæm. Wang Hui o.fl. Notaði einnig ARMS til að greina stökkbreytingar á KRAS í 167 tilfelli af formaldehýðföstum og innfelldum paraffínvefjum. Í Bandaríkjunum nota COBAS búnaðurinn (Roche) sem FDA hefur samþykkt til klínískra rannsókna á KRAS og Therascreen RGQ búnaðurinn (Qiagen) sem vottaður er af In vitro Diagnostics (CE-IVD) Evrópusambandsins, ARMS meginreglan. Meðal algengra aðferða er ARMS aðferðin viðkvæmust og kostnaður tiltölulega sanngjarn. Þess vegna er stór hluti klínískrar uppgötvunar KRAS-gena heima og erlendis að nota ARMS aðferðina, en vegna þess að aðferðin er byggð á PCR tækni er galli hennar að það er aðeins hægt að greina Þekktar stökkbreytingar.
4. Rauntíma magnbundin PCR aðferð:
Það er PCR-undirstaða greiningaraðferð til að ákvarða stökkbreytinguna með Ct gildi. Það hefur kosti sterkrar sérstöðu, mikils næmis, nákvæmrar magngreiningar, auðveldrar notkunar og fullkomlega lokuð viðbrögð. Margir tilraunahópar hafa tekið upp þessa aðferð til að greina KRAS stökkbreytingar í ristilkrabbameini. Samanborið við beina raðgreiningaraðferð, hefur megindleg PCR meiri forskot á næmni. Flestir fræðimenn sem bera saman aðferðirnar tvær telja að megindleg PCR sé næmari. Liu Wei o.fl. Notaði tvær aðferðir til að gera nákvæma greiningu á greiningarniðurstöðum 280 tilfella af ristilkrabbameini KRAS gen stökkbreytingum, 94 tilfellum af KRAS gena raðbreytingum, jákvæða hlutfallið var 33.57% (94/280), þar af rauntíma flúrljómun magnbundið. PCR var jákvætt 91 tilfelli var með næmi 96.8% (91/94). Af 186 genaraðgreiningum villigerðartilvika voru 184 neikvæðar með rauntíma magn PCR, með sérhæfni upp á 98.9% (184/186). Samhliða hlutfall rauntíma flúrljómunar megindlegrar PCR aðferðar og beinni genaröðunaraðferðar var 98.2%. Í greiningaraðferðunum tveimur var jákvæð og neikvæð tilviljun hvers stökkbreytingarstaðar yfir 90% og tilviljunarhlutfall fjögurra staða náði 100%. Greiningarniðurstöður aðferðanna tveggja voru mjög samkvæmar, sem gefur til kynna flúrljómandi magn PCR. Það er áreiðanlegri aðferð til að greina stökkbreytingar. Hins vegar þurfa PCR-undirstaða aðferðir að hanna primera og rannsaka út frá þekktum stökkbreytingategundum, þannig að ekki er hægt að greina allar mögulegar stökkbreytingar og aðeins hægt að greina ákveðna staði. Ef ákveðin staður er ekki innifalinn í greiningarsviði settsins, jafnvel þótt stökkbreyting sé í raun, er niðurstaða settsins samt neikvæð. Þar að auki, þó að næmni megindlegrar PCR sé mikil, þarf enn að sannreyna hvort um falskar jákvæðar niðurstöður séu að ræða með DNA raðgreiningartækni, eða afturskyggnum og væntanlegum klínískum tilraunum með stórum sýnastærðum til að staðfesta fylgni á milli KRAS stökkbreytingastöðu og virkni markvissu. lyf. Þess vegna ætti ekki að elta í blindni mikla næmni stökkbreytingagreiningar, en hunsa ætti sérhæfni og nákvæmni greiningar. Við mismunandi rannsóknarstofuaðstæður getur ákjósanlegasta aðferðin til að greina stökkbreytingar í sýnum einnig verið önnur. Fyrir sýni með hærra hlutfall stökkbreytinga hefur Sanger raðgreiningaraðferðin meiri nákvæmni við að greina stökkbreytingar í genum, en fyrir sýni með lægra hlutfall stökkbreytinga getur Sanger raðgreiningaraðferðin Falsneikvísanir komið fram og greiningaraðferðin sem notar flúrljómandi PCR sem tæknilegan vettvang getur einkennst af miklu næmi.
5. HRM aðferð:
Það er ein algengasta genagreiningaraðferðin undanfarin ár. Það hefur kosti einfaldrar, hraðvirkra, viðkvæmra og eins hólka til að koma í veg fyrir mengun. Til að kanna hagkvæmni notkunar þess í klínískum prófum notuðu Liu Liqin og aðrir HRM aðferðina til að greina stökkbreytingar á KRAS genum hjá 64 sjúklingum með ristilkrabbamein og notuðu síðan beina raðgreiningu til að sannreyna niðurstöðurnar. Niðurstöður HRM og bein raðgreining reynast vera í samræmi. Í samanburði við beina raðgreiningu er greining KRAS-genbreytinga með HRM einföld og nákvæm, sem bendir til þess að hún sé áreiðanleg aðferð sem henti klínískum prófum. Chen Zhihong o.fl. Notaði HRM aðferðina til að prófa röð af blönduðum sýnum sem innihalda mismunandi hlutföll KRAS stökkbreyttra plasmíða til að meta næmi þeirra. Í ljós kom að hlutfall plasmíðstökkbreytinga í blönduðu sýnunum var 10% og næmið náði 10%. Í framhaldinu var aðferðin notuð til að greina stökkbreytingar á KRAS í 60 ristilkrabbameinssýnum. Í samanburði við beina raðgreiningaraðferðina var næmi HRM aðferðarinnar 100% og sértækni 96% (43/45). Ókosturinn við HRM aðferðina er að ómögulegt er að veita nákvæmlega tilgreindar stökkbreytingargerðir og hvaða kóðun er stökkbreytt. Ef óeðlilegt finnst á bræðsluferlinum er þörf á raðgreiningaraðferð til að ákvarða tegund stökkbreytinga. Rannsóknarhópurinn Harlé notaði 156 tilfelli af krabbameini í ristli og endaþarmi til að bera saman PCR, ARMS og HRM aðferðir við flúr. Niðurstöðurnar benda til þess að þrátt fyrir að aðferðirnar þrjár henti klínískum prófum sé áreiðanleiki HRM ekki eins góður og hinar tvær aðferðirnar.
6. Aðrar aðferðir:
Auk ofangreindra aðferða hafa aðrar uppgötvunaraðferðir sína eigin kosti og galla í notkun, svo sem PCR-SSCP, vökvaskiljun með miklum afköstum, flúrljómandi PCR bjartsýnisfrumukrabbameinsaðferð, Aðferð við hreiður PCR og ARMS samsetningu, COLD-PCR aðferð o.s.frv. Háskerpavökvaskiljun hefur mikla sérstöðu, en eftirspurn eftir sýnum er mikil; PCR-SSCP er lágmark í kostnaði og hagkvæmt, en aðgerðin er flókin; stökkbreytingartækni byggð á flúrljómun PCR hefur sterka sérhæfni, mikla næmi og nákvæma magn, Auðvelt aðgerð, að fullu læst viðbrögð og aðrir kostir, en allir þurfa að hanna grunn og rannsaka í samræmi við þekkta stökkbreytingargerð, svo aðeins hægt er að tilgreina sérstaka staði greind og ekki er hægt að greina allar mögulegar stökkbreytingar.
3. Yfirlit
Í stuttu máli, vegna þess að stökkbreytingarstaðirnir og greiningaraðferðir á mismunandi rannsóknarstofum eru ekki einsleitar, eru stærð æxlisgreina sem eru greind og gæði DNA útdráttar einnig misjöfn, sem leiðir til þess að stórar eða litlar tilraunaniðurstöður eru milli rannsóknarstofa Mismunur, stöðlun af greiningu KRAS-stökkbreytinga hefur orðið klínískt greiningarmál sem hefur áhyggjur í ýmsum löndum. Sem stendur eru margar aðferðir til að greina stökkbreytingar í KRAS geninu. Næmið frá háu til lágu er ARMS, gervigreining, HRM, rauntíma magn PCR og bein raðgreining. Frá klínískum veruleika stuðlar lágt næmi ekki til klínískrar meðferðar en of viðkvæmar aðferðir munu leiða til þess að greiningarhæfni minnkar og óþarfa rangar jákvæðar niðurstöður geta komið fram og haft áhrif á síðari lyfjameðferð sjúklingsins. Miðað við ofangreinda þætti, ásamt aðferðinni sem FDA hefur samþykkt, er mælt með ARMS aðferðinni. Auðvitað, frá markaðssjónarmiði, ættu sameindagreiningar ekki að leggja áherslu á mig
thods, en einbeittu þér að endanlegum réttum niðurstöðum. Mismunandi rannsóknarstofur geta tekið upp viðeigandi prófunaraðferðir í samræmi við raunverulegar aðstæður, en aðeins ef þær hafa góða rekstrarhæfileika og innra gæðaeftirlitskerfi. Við núverandi umhverfisaðstæður á innlendum rannsóknarstofu er nauðsynlegt að framkvæma prófanir á staðlaðri PCR rannsóknarstofu og taka þátt í innlendum og alþjóðlegum gæðaeftirlitsaðgerðum á milli herbergja til að tryggja áreiðanleg gæði rannsóknarstofuprófa. Stöðluð stjórnun er nauðsynlegt skilyrði til að tryggja stöðugan árangur. Í Kína er brýn þörf á að sameina og staðla klínískar prófanir á KRAS geninu og búa til staðlað og staðlað prófunarprógram í samræmi við mismunandi þarfir og hægt er að útvíkka þetta forrit til að greina BRAF, PIK23450_3CA, EGFR og önnur gen til að stuðla að klínískum sameindameinafræðiprófum.
