Målrettede lægemidler såsom cetuximab og panitumumab er blevet brugt i vid udstrækning i klinikken som effektive terapeutiske lægemidler mod tyktarmskræft. Kliniske data viser, at patienter med KRAS-mutationer ikke har nogen signifikant effekt på dette monoklonale antistoflægemiddel, og kun vildtypepatienter kan drage fordel af det. Derfor anses KRAS-genmutationsstatus klinisk som en vigtig terapeutisk markør, som har en stærk sammenhæng med prognosen og behandlingseffekten af kolorektal cancer. 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines fastlægger, at alle patienter med metastatisk kolorektal cancer skal påvise KRAS-genmutationsstatus, og kun KRAS-vildtype anbefales at modtage EGFR-målrettet behandling. Samme år udsendte American Society of Clinical Oncology (ASCO) også de samme kliniske behandlingsanbefalinger som en molekylær markør for tumormålrettet terapi, hvilket viser dens vigtige vejledende betydning. På nuværende tidspunkt er KRAS genetisk testning blevet udført i vid udstrækning klinisk. Vi evaluerer hovedsageligt de indenlandske KRAS-genmutationsdetektionsmetoder til reference i klinisk udvælgelse.
1. Den positive rate af KRAS-genmutation i kolorektal cancer
Ved kolorektal cancer er mutationsraten for KRAS-genet så høj som 35 % til 45 %, og højrisiko-mutationsstedet er kodon 12 og 13 på exon 2, og der er stadig sjældne, såsom 61 og 146. Mutation websted. Der er mange detektionsmetoder for KRAS-genmutationer, herunder direkte sekventering, højopløsningssmeltekurveanalyse (HRM), pyrosequencing, kvantitativ PCR, mutationsamplifikationsbloksystem (amplinc atio) refraktært mutationssystem (ARMS), restriktionsfragmentlængdepolymorfi (RFLP), polymerasekædereaktion-enkeltstrenget konformationspolymorfi-analyse (PCR-enkeltstrengs-konfomationspolymorfi (PCR-SSCP), co-amplifikation ved lavere denatureringstemperatur PCR (COLD-PCR) og højtydende væskekromatografianalyse osv.
2. Evaluering af KRAS-mutationsdetektionsmetoder
1. Direkte sekventeringsmetode: Det er den mest klassiske metode til påvisning af KRAS-genmutationer, og den er også guldstandarden til påvisning af genmutationer. Den direkte sekventeringsmetode baseret på princippet om dideoxy-sekventering kan mest intuitivt vise ændringen af gensekvens i form af base peak map. Detektionstypen er mere omfattende, og det er også den tidligst anvendte mutationsdetektionsmetode. På trods af fremkomsten af den nye generation af sekventeringsplatforme bruger forskere i ind- og udland stadig resultaterne af direkte sekventering som en skala til at måle og bestemme pålideligheden af den nye metode. Gao Jing et al. Anvendt direkte sekventering til påvisning af KRAS- og BRAF-genmutationer hos 966 patienter med kolorektal cancer. Dette er også analysen af KRAS-genmutationen med den største indenlandske prøve rapporteret i litteraturen. Ling Yun og andre mener, at den direkte sekventeringsmetode er den mest direkte og effektive detektionsmetode til at forstå mutationsstatus for hvert gen, hvilket kan afklare typen af mutation, især til påvisning af ukendte mutationer. Selvom følsomheden af denne metode er relativt lav, kan den forbedres ved metoder såsom mikrodissektion for at berige tumorceller. Den direkte sekventeringsmetode er også blevet anvendt til KRAS-detektion af større prøvestørrelser i andre indenlandske forskningsgrupper. Men lavere følsomhed er den største ulempe ved direkte sekventering. At dømme ud fra resultaterne rapporteret i Kina er mutationsdetektionshastigheden ved direkte sekventering ikke lav. Liu Xiaojing et al. Sammenlignede direkte sekventering og peptidnukleinsyreklemme PCR (PNA-PCR) og fandt, at 43 tilfælde af KRAS-genmutationer blev påvist ved direkte sekventering. Ud over disse mutationer blev PNA-PCR også påvist ved direkte sekventering. Ti mutationer blev fundet i vildtypen, og der blev fremsat forslag til at bestemme vildtypepatienterne ved PCR og den direkte sekventeringsmetode til at bestemme mutantpatienterne. Qiu Tian et al. Detekterede 131 kolorektal cancerprøver ved hjælp af fluorescerende PCR-optimeret oligonukleotidprobemetode og direkte sekventeringsmetode, og de positive rater af KRAS-genmutationer var 41.2 % (54/131) og 40.5 % (53/131) ). Bai Dongyu diskuterede også påvisningsfølsomheden af forskellige metoder. Af de 200 kolorektal cancerpatienter blev 63 påvist ved RT-qPCR-mutationer, og mutationspåvisningsraten var 31.5 %; 169 prøver blev sekventeret med succes ved direkte sekventering af 50 tilfælde af mutation, mutationsdetektionsrate 29.6%. Selvom den direkte sekventeringsmetode nøjagtigt, objektivt og specifikt kan påvise KRAS-genmutationsstatus, er dens mangler såsom høje tekniske krav, komplicerede operationsprocedurer, let at forårsage krydskontaminering og tidskrævende og besværlig fortolkning af resultaterne også meget indlysende. Ofte er der ikke noget sekventeringsudstyr, og prøven skal sendes til det tilsvarende firma til test, hvilket tager lang tid og har store omkostninger, så det har store begrænsninger.
Pyrosequencing metode:
Pyrosequencing-metoden er også en mere bekvem metode til KRAS-genmutationsdetektion med hensyn til sekventeringsfølsomhed, detektionsomkostninger og tid til at rapportere. Gentageligheden af denne metode er bedre. Ifølge det opnåede topkort Den kvantitative undersøgelse af mutationshyppigheden af et bestemt sted og sammenligningen mellem mutationshyppighederne af forskellige steder er klar på et øjeblik. I de seneste år har Ogino et al., Hutchins et al. Har brugt pyrosequencing-teknologi til at teste KRAS-mutationer hos patienter med store prøver af kolorektal cancer. Resultaterne indikerer, at pyrosequencing-teknologi er et effektivt værktøj til at screene patienter for målrettet terapi. Tumormolekylær diagnose har brede anvendelsesmuligheder. Indenlandske forskere har også brugt pyrosequencing-teknologi til klinisk at detektere KRAS-mutationer i kolorektal cancer med god nøjagtighed og pålidelighed. Denne metode har bedre specificitet og højere sensitivitet. SundstrÖm et al. Sammenlignede allel-specifik PCR og pyrosequencing i kliniske applikationer og fandt, at i 314 tilfælde af KRAS-mutationer i kolorektal cancerpatienter var specificiteten af pyrosequencing overlegen i forhold til alleler. PCR, og har god følsomhed over for væv med lavt tumorcelleindhold. Fortynd andelen af tumorceller til 1.25% til 2.5%. Pyrosequencing kan stadig detektere mutationssignaler. Når minimumsindholdet af mutante alleler i prøven skal nå op på 20 % for at blive påvist ved Sanger-sekventering, kan det påvises ved HRM-metoden, når det når 10 %, og for pyrosekventering kan kun mutationer påvises med 5 %. Alleler. Vi brugte pyrosequencing til at påvise KRAS-mutationer hos 717 patienter med kolorektal cancer og fandt ud af, at hyppigheden af KRAS-mutationer var 40.9 %. Mutationsraten for codon 12 var 30.1 %, mutationsraten for codon 13 var 9.8 %, og mutationsraten for codon 61 var 1.0 %. Vi berigede vævene med højere tumorindhold ved manuel mikrodissektion før testning, hvilket gjorde resultaterne mere pålidelige. Metoden har god sensitivitet og specificitet, og er let at udvikle i klinisk praksis. Ulempen ved pyrosequencing er de høje omkostninger ved detektion, og processen med at forberede enkeltstrenget DNA til sekventering af prøver er besværlig. I fremtiden kan pyrosequencing afsættes til udvikling af teknologi til direkte detektion af dobbeltstrengede PCR-produkter, hvilket i høj grad vil forenkle operationen. Og effektivt reducere omkostningerne ved sekventering for at opnå omfattende fremme af klinisk testning.
3. ARMS metode:
Denne teknologi bruger primere til at skelne mellem vildtype- og mutantgener, wh
ich er blevet rapporteret så tidligt som i 1980'erne. Den største fordel ved denne metode er, at den har en følsomhed på op til 1.0 % og kan detektere mutante gener i prøver så lave som 1.0 %. I design kan længden af målproduktet forkortes i størst muligt omfang, og problemet med, at nøjagtige detektionsresultater ikke kan opnås, fordi det meste af DNA'et ekstraheret fra den paraffinindlejrede vævsprøve er fragmenteret. Denne teknologi kombinerer real-time PCR-platformen for at opnå lukket rørdrift under amplifikation. Betjeningen er enkel og kræver ikke efterbehandling af produktet, hvilket kan undgå forurening af det amplificerede produkt i størst muligt omfang. På nuværende tidspunkt er scorpion-ARMS-metoden, der kombinerer skorpionprobe og amplifikationsblokmutationssystem, mere almindeligt anvendt i verden. Kombinationen af de to teknologier kan maksimere begge siders følsomhed og specificitet. Gao Jie et al. Brugte denne metode til at påvise KRAS-genmutationsstatus hos 167 patienter med kolorektal cancer, hvilket tyder på, at denne metode er pålidelig og nøjagtig. Wang Hui et al. Brugte også ARMS til at detektere KRAS-mutationer i 151 tilfælde af formaldehyd-fikseret og paraffin-indlejret væv. I USA bruger COBAS-kittet (Roche), der er godkendt af FDA til klinisk testning af KRAS, og Therascreen RGQ-kittet (Qiagen) certificeret af European Union In Vitro Diagnostics (CE-IVD) alle ARMS-princippet. Blandt de almindelige metoder er ARMS-metoden den mest følsomme, og prisen er relativt rimelig. Derfor bruger en stor del af den kliniske påvisning af KRAS-gener i ind- og udland ARMS-metoden, men fordi metoden er baseret på PCR-teknologi, er dens mangel, at den kun kan påvises Kendte stedsmutationer.
4. Real-time fluorescens kvantitativ PCR-metode:
Det er en PCR-baseret detektionsmetode til at bestemme mutationen ved Ct-værdi. Det har fordelene ved stærk specificitet, høj følsomhed, nøjagtig kvantificering, nem betjening og fuldstændig lukket reaktion. Mange eksperimentelle grupper har vedtaget denne metode til påvisning af KRAS-mutationer i kolorektal cancer. Sammenlignet med den direkte sekventeringsmetode optager kvantitativ PCR en større fordel med hensyn til følsomhed. De fleste forskere, der sammenligner de to metoder, mener, at kvantitativ PCR er mere følsom. Liu Wei et al. Brugte to metoder til at lave en detaljeret analyse af påvisningsresultaterne af 280 tilfælde af kolorektal cancer KRAS-genmutationer, 94 tilfælde af KRAS-gensekventeringsmutationer, den positive rate var 33.57% (94/280), hvoraf real-time fluorescens kvantitativ PCR var positiv 91 tilfælde havde en følsomhed på 96.8 % (91/94). Af de 186 gensekventerende vildtype-tilfælde var 184 negative ved realtids kvantitativ PCR med en specificitet på 98.9 % (184/186). Sammenfaldsraten mellem real-time fluorescens kvantitativ PCR-metode og direkte gensekventeringsmetode var 98.2%. I de to detektionsmetoder var de positive og negative koincidensrater for hvert mutationssted over 90 %, og koincidensraten for fire steder nåede 100 %. Detektionsresultaterne af de to metoder var meget konsistente, hvilket indikerer fluorescerende kvantitativ PCR. Det er en mere pålidelig metode til mutationsdetektion. Men PCR-baserede metoder skal designe primere og prober baseret på kendte mutationstyper, så alle mulige mutationer kan ikke påvises, og kun specifikke steder kan påvises. Hvis et bestemt sted ikke er inkluderet i kittets detektionsområde, selvom der faktisk er en mutation, er kitresultatet stadig negativt. Selvom følsomheden af kvantitativ PCR er høj, skal om der er falske positiver stadig verificeres ved hjælp af DNA-sekventeringsteknologi eller retrospektive og prospektive kliniske eksperimenter med store prøvestørrelser for at bekræfte sammenhængen mellem KRAS-mutationsstatus og effektiviteten af målrettet stoffer. Derfor bør den høje følsomhed af mutationsdetektion ikke forfølges blindt, mens specificiteten og nøjagtigheden af detektionen bør ignoreres. Under forskellige laboratorieforhold kan den optimale metode til mutationsdetektion i prøver også være anderledes. For prøver med en højere andel af mutationer har Sanger-sekventeringsmetoden en højere nøjagtighed ved påvisning af genmutationer, mens for prøver med en lavere andel af mutationer kan Sanger-sekventeringsmetoden forekomme falske negativer, og påvisningsmetoden med fluorescerende PCR som teknisk platform kan karakteriseres ved høj følsomhed.
5. HRM metode:
Det er en af de mere almindeligt anvendte gendetektionsmetoder i de senere år. Det har fordelene ved simpelt, hurtigt, følsomt og enkelt rør for at undgå forurening. For at udforske gennemførligheden af dets anvendelse i kliniske tests, brugte Liu Liqin og andre HRM-metoden til at detektere KRAS-genmutationer i 64 patienter med kolorektal cancer, og brugte derefter direkte sekventering til at verificere resultaterne. Resultaterne af HRM og direkte sekventering viser sig at være konsistente. Sammenlignet med direkte sekventering er påvisningen af KRAS-genmutationer ved HRM enkel og nøjagtig, hvilket tyder på, at det er en pålidelig metode, der er egnet til klinisk testning. Chen Zhihong et al. Brugte HRM-metoden til at teste en række blandede prøver indeholdende forskellige proportioner af KRAS-mutantplasmider for at evaluere deres følsomhed. Det blev fundet, at andelen af plasmidmutationer i de blandede prøver var 10 %, og følsomheden nåede 10 %. Efterfølgende blev metoden brugt til at påvise KRAS-genmutationer i 60 tyktarmskræftvævsprøver. Sammenlignet med den direkte sekventeringsmetode var sensitiviteten af HRM-metoden 100 %, og specificiteten var 96 % (43/45). Ulempen ved HRM-metoden er, at det er umuligt nøjagtigt at angive den specifikke mutationstype og hvilket kodon, der er muteret. Hvis der findes en abnormitet på smeltekurven, er sekventeringsmetode nødvendig for at bestemme mutationstypen. Harlé-forskningsgruppen brugte 156 tilfælde af tyktarmskræftvæv til at sammenligne fluorescerende PCR-, ARMS- og HRM-metoder. Resultaterne tyder på, at selvom de tre metoder er velegnede til klinisk testning, er pålideligheden af HRM ikke så god som de to andre metoder.
6. Andre metoder:
Ud over de ovennævnte metoder har andre detektionsmetoder deres egne fordele og ulemper ved anvendelse, såsom PCR-SSCP, højtydende væskekromatografi, fluorescerende PCR-optimeret oligonukleotidprobemetode, metode til nestet PCR og ARMS-kombination, COLD-PCR metode osv. Højtydende væskekromatografi har stærk specificitet, men efterspørgslen efter prøver er stor; PCR-SSCP er lav i omkostninger og økonomisk, men operationen er kompliceret; mutationsdetektionsteknologien baseret på fluorescerende PCR har stærk specificitet, høj sensitivitet og nøjagtig kvantitativ, nem betjening, fuldt blokeret reaktion og andre fordele, men alle skal designe primere og prober i overensstemmelse med den kendte mutationstype, så kun specifikke steder kan opdaget, og alle mulige mutationer kan ikke påvises.
3. Resumé
Sammenfattende, fordi mutationsstederne og detektionsmetoderne i forskellige laboratorier ikke er ensartede, er størrelsen af de analyserede tumorprøver og kvaliteten af DNA-ekstraktion også ujævn, hvilket resulterer i eksistensen af store eller små eksperimentelle resultater mellem laboratorier. Forskelle, standardiseringen Detektion af KRAS-genmutationer er blevet et problem med klinisk påvisning i forskellige lande. På nuværende tidspunkt er der mange metoder til at påvise mutationer i KRAS-genet. Følsomheden fra høj til lav er ARMS, pyrosequencing, HRM, real-time kvantitativ PCR og direkte sekventering. Ud fra den kliniske virkelighed er lav sensitivitet ikke befordrende for klinisk behandling, men for sensitive metoder vil få detektionsspecificiteten til at falde, og unødvendige falske positive resultater kan forekomme og påvirke patientens efterfølgende medicinbehandling. I betragtning af ovenstående aspekter, kombineret med metoden godkendt af FDA, anbefales ARMS-metoden. Fra et markedsperspektiv skal molekylær diagnostik naturligvis ikke understrege mig
thods, men fokuser på de endelige korrekte resultater. Forskellige laboratorier kan anvende passende testmetoder i henhold til den aktuelle situation, men kun hvis de har gode operatørkvalifikationer og interne kvalitetskontrolsystemer. Under de nuværende indenlandske laboratoriemiljøforhold er det nødvendigt at udføre test i et standardiseret PCR-laboratorium og deltage i nationale og internationale inter-room kvalitetskontrolaktiviteter for at sikre pålidelig laboratorietestkvalitet. Standardiseret ledelse er en nødvendig betingelse for at sikre konstante resultater. I Kina er der et presserende behov for at forene og standardisere den kliniske test af KRAS-genet og at generere et standardiseret og standardiseret testprogram i henhold til forskellige behov, og dette program kan udvides til påvisning af BRAF, PIK23450_3CA, EGFR og andre gener for at fremme klinisk molekylær patologitestning.
