تم استخدام الأدوية المستهدفة مثل سيتوكسيماب وبانيتوموماب على نطاق واسع في العيادة كأدوية علاجية فعالة لسرطان القولون والمستقيم. تظهر البيانات السريرية أن المرضى الذين يعانون من طفرات KRAS ليس لديهم أي تأثير كبير على دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، ويمكن فقط للمرضى من النوع البري الاستفادة منه. لذلك، تعتبر حالة طفرة جين KRAS سريريًا علامة علاجية مهمة، والتي لها علاقة قوية مع تشخيص سرطان القولون والمستقيم وتأثيره العلاجي. تنص إرشادات الممارسة السريرية لسرطان القولون والمستقيم للشبكة الوطنية الشاملة للسرطان (NCCN) لعام 2009 على أن جميع المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم النقيلي يجب أن يكتشفوا حالة طفرة جين KRAS، ويوصى فقط بالنوع البري KRAS لتلقي العلاج الموجه EGFR. وفي العام نفسه، أصدرت الجمعية الأمريكية لعلم الأورام السريري (ASCO) أيضًا نفس توصيات العلاج السريري كعلامة جزيئية للعلاج الذي يستهدف الورم، مما يوضح أهميته التوجيهية الهامة. في الوقت الحاضر، تم إجراء الاختبارات الجينية لـ KRAS سريريًا على نطاق واسع. نقوم بشكل أساسي بتقييم طرق الكشف عن طفرة الجينات KRAS المحلية لتكون مرجعًا في الاختيار السريري.
1. المعدل الإيجابي للطفرة الجينية KRAS في سرطان القولون والمستقيم
في سرطان القولون والمستقيم ، يصل معدل الطفرات في جين KRAS إلى 35٪ إلى 45٪ ، وموقع الطفرات عالية الخطورة هو الكودونات 12 و 13 على إكسون 2 ، ولا تزال هناك طفرات نادرة مثل 61 و 146. الطفرة موقع. هناك العديد من طرق الكشف عن الطفرات الجينية KRAS ، بما في ذلك التسلسل المباشر ، وتحليل منحنى الذوبان عالي الدقة (HRM) ، والتسلسل الحراري ، و PCR الكمي ، ونظام كتلة التضخيم الطفري (Amplinc atio) ، ونظام التحوير الانكساري (ARMS) ، وتعدد أشكال طول جزء التقييد (RFLP) ، تفاعل البوليميراز المتسلسل - تحليل تعدد الأشكال للتشكيل أحادي الخيط (PCR- تعدد أشكال اختلاط سلسلة الأحادي (PCR-SSCP) ، التضخيم المشترك عند انخفاض درجة حرارة تمسخ PCR (COLD-PCR) وتحليل كروماتوجرافيا سائل عالي الأداء ، إلخ.
2. تقييم طرق الكشف عن طفرة KRAS
1. طريقة التسلسل المباشر: هي الطريقة الأكثر كلاسيكية للكشف عن الطفرات الجينية KRAS ، وهي أيضًا المعيار الذهبي للكشف عن الطفرات الجينية. يمكن أن تُظهر طريقة التسلسل المباشر القائمة على مبدأ تسلسل الديوكسي بشكل حدسي تغيير تسلسل الجينات في شكل خريطة ذروة أساسية. يعد نوع الاكتشاف أكثر شمولاً ، وهو أيضًا أول طريقة مطبقة للكشف عن الطفرات. على الرغم من ظهور جيل جديد من منصات التسلسل ، لا يزال العلماء في الداخل والخارج يستخدمون نتائج التسلسل المباشر كمقياس لقياس وتحديد موثوقية الطريقة الجديدة. جاو جينغ وآخرون. تم تطبيق التسلسل المباشر للكشف عن الطفرات الجينية لـ KRAS و BRAF في 966 مريضًا بسرطان القولون والمستقيم. هذا أيضًا هو تحليل الطفرة الجينية KRAS مع أكبر عينة محلية تم الإبلاغ عنها في الأدبيات. يعتقد لينغ يون وآخرون أن طريقة التسلسل المباشر هي أكثر طرق الكشف المباشرة والفعالة لفهم حالة الطفرة لكل جين ، والتي يمكن أن توضح نوع الطفرة ، خاصة للكشف عن الطفرات غير المعروفة. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة منخفضة نسبيًا ، إلا أنه يمكن تحسينها بطرق مثل التسليخ الدقيق لإثراء الخلايا السرطانية. تم تطبيق طريقة التسلسل المباشر أيضًا على كشف KRAS لأحجام العينات الأكبر في مجموعات البحث المحلية الأخرى. ومع ذلك ، فإن الحساسية المنخفضة هي أكبر عيب في التسلسل المباشر. انطلاقًا من النتائج التي تم الإبلاغ عنها في الصين ، فإن معدل اكتشاف الطفرة عن طريق التسلسل المباشر ليس منخفضًا. ليو شياو جينغ وآخرون. مقارنة بالتسلسل المباشر ومشبك الحمض النووي الببتيد PCR (PNA-PCR) ووجد أنه تم اكتشاف 43 حالة من طفرات جينية KRAS عن طريق التسلسل المباشر. بالإضافة إلى هذه الطفرات ، تم اكتشاف PNA-PCR أيضًا عن طريق التسلسل المباشر. تم العثور على عشر طفرات في النوع البري ، وقدمت اقتراحات لتحديد مرضى النوع البري بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل وطريقة التسلسل المباشر لتحديد المرضى المتحولين. كيو تيان وآخرون. تم الكشف عن 131 عينة من سرطان القولون والمستقيم عن طريق طريقة مسبار قليل النوكليوتيد المُحسَّن بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري وطريقة التسلسل المباشر ، وكانت المعدلات الإيجابية للطفرات الجينية KRAS 41.2٪ (54/131) و 40.5٪ (53/131)). ناقش Bai Dongyu أيضًا حساسية الكشف للطرق المختلفة. من بين 200 مريض بسرطان القولون والمستقيم ، تم اكتشاف 63 من خلال طفرات RT-qPCR ، وكان معدل اكتشاف الطفرات 31.5٪ ؛ تم تسلسل 169 عينة بنجاح عن طريق التسلسل المباشر لـ 50 حالة طفرة ، ومعدل اكتشاف الطفرة 29.6٪. على الرغم من أن طريقة التسلسل المباشر يمكن أن تكتشف بدقة وموضوعية وعلى وجه التحديد حالة طفرة الجينات KRAS ، إلا أن أوجه القصور فيها مثل المتطلبات التقنية العالية وإجراءات التشغيل المعقدة وسهولة التسبب في التلوث المتبادل والتفسير الشاق والوقت للنتائج هي أيضًا بديهي. غالبًا لا توجد معدات تسلسل ، ويجب إرسال العينة إلى الشركة المقابلة للاختبار ، الأمر الذي يستغرق وقتًا طويلاً وبتكلفة عالية ، لذا فإن له قيودًا كبيرة.
طريقة Pyrosequencing:
طريقة Pyrosequencing هي أيضًا طريقة أكثر ملاءمة لاكتشاف طفرة جينية KRAS من حيث حساسية التسلسل وتكلفة الكشف ووقت الإبلاغ. تكرار هذه الطريقة أفضل. وفقًا لخريطة الذروة التي تم الحصول عليها ، فإن الدراسة الكمية لتكرار الطفرة لموقع معين والمقارنة بين ترددات الطفرات لمواقع مختلفة واضحة في لمحة. في السنوات الأخيرة ، Ogino et al. ، Hutchins et al. استخدموا تقنية التسلسل الحراري لاختبار طفرات KRAS في المرضى الذين يعانون من عينات كبيرة من سرطان القولون والمستقيم. تشير النتائج إلى أن تقنية التسلسل الحراري هي أداة قوية لفحص المرضى من أجل العلاج المستهدف. التشخيص الجزيئي للورم له آفاق تطبيق واسعة. استخدم العلماء المحليون أيضًا تقنية التسلسل الحراري للكشف السريري عن طفرات KRAS في سرطان القولون والمستقيم ، بدقة وموثوقية جيدين. تتميز هذه الطريقة بخصوصية أفضل وحساسية أعلى. SundstrÖm وآخرون. مقارنةً بتفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليلي والتسلسل الحراري في التطبيقات السريرية ووجد أنه في 314 حالة من طفرات KRAS في مرضى سرطان القولون والمستقيم ، كانت خصوصية التسلسل الحراري أعلى من تلك الموجودة في الأليلات. PCR ، ولديه حساسية جيدة للأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الخلايا السرطانية. تخفف نسبة الخلايا السرطانية إلى 1.25٪ إلى 2.5٪. لا يزال بإمكان Pyrosequencing اكتشاف إشارات الطفرات. عندما يحتاج الحد الأدنى من محتوى الأليلات الطافرة في العينة إلى 20٪ ليتم اكتشافه بواسطة تسلسل Sanger ، يمكن اكتشافه بواسطة طريقة إدارة الموارد البشرية عندما يصل إلى 10٪ ، وبالنسبة للتسلسل الحراري ، يمكن اكتشاف الطفرات فقط بنسبة 5٪. الأليلات. استخدمنا التسلسل الحراري للكشف عن طفرات KRAS في 717 مريضًا بسرطان القولون والمستقيم ووجدنا أن تواتر طفرات KRAS كانت 40.9٪. كان معدل طفرة الكودون 12 30.1٪ ، ومعدل طفرة الكودون 13 كان 9.8٪ ، ومعدل طفرة الكودون 61 كان 1.0٪. قمنا بإثراء الأنسجة بمحتوى أعلى من الورم عن طريق التسليخ المجهري اليدوي قبل الاختبار ، مما يجعل النتائج أكثر موثوقية. تتميز الطريقة بحساسية وخصوصية جيدة ، ومن السهل تطويرها في الممارسة السريرية. عيب التسلسل الحراري هو التكلفة العالية للكشف ، وعملية تحضير الحمض النووي أحادي الجديلة لتسلسل العينات مرهقة. في المستقبل ، يمكن تكريس التسلسل الحراري لتطوير التكنولوجيا للكشف المباشر عن منتجات PCR مزدوجة الشريطة ، مما يبسط العملية إلى حد كبير. وتقليل تكلفة التسلسل بشكل فعال لتحقيق الترويج الشامل للاختبارات السريرية.
3 - طريقة إدارة المحفوظات والسجلات:
تستخدم هذه التقنية مواد أولية للتمييز بين الجينات من النوع البري والجينات الطافرة ، wh
تم الإبلاغ عن البقع البيضاء في وقت مبكر من الثمانينيات. أكبر ميزة لهذه الطريقة هي أنها تتمتع بحساسية تصل إلى 1980٪ ويمكنها اكتشاف الجينات الطافرة في عينات منخفضة تصل إلى 1.0٪. في التصميم ، يمكن تقصير طول المنتج المستهدف إلى أقصى حد ، والمشكلة المتمثلة في عدم إمكانية الحصول على نتائج الكشف الدقيقة لأن معظم الحمض النووي المستخرج من عينة الأنسجة المضمنة بالبارافين مجزأ. تجمع هذه التقنية بين منصة PCR في الوقت الفعلي لتحقيق عملية أنبوب مغلق أثناء التضخيم. العملية بسيطة ولا تتطلب معالجة لاحقة للمنتج ، والتي يمكن أن تتجنب تلوث المنتج المضخم إلى أقصى حد. في الوقت الحاضر ، تُستخدم طريقة العقرب-ARMS التي تجمع بين مسبار العقرب ونظام طفرة كتلة التضخيم بشكل أكثر شيوعًا في العالم. يمكن أن يؤدي الجمع بين التقنيتين إلى زيادة حساسية وخصوصية كلا الجانبين. جاو جي وآخرون. استخدمت هذه الطريقة لاكتشاف حالة الطفرة الجينية KRAS في 1.0 مريضًا مصابًا بسرطان القولون والمستقيم ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة موثوقة ودقيقة. وانغ هوي وآخرون. تستخدم أيضًا ARMS للكشف عن طفرات KRAS في 167 حالة من الأنسجة المثبتة بالفورمالديهايد والمدمجة بالبارافين. في الولايات المتحدة ، تستخدم مجموعة COBAS (Roche) المعتمدة من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) للاختبار السريري لـ KRAS ومجموعة Therascreen RGQ (Qiagen) المعتمدة من قبل الاتحاد الأوروبي في التشخيص المختبري (CE-IVD) مبدأ ARMS. من بين الطرق الشائعة ، طريقة ARMS هي الأكثر حساسية والتكلفة معقولة نسبيًا. لذلك ، يستخدم جزء كبير من الاكتشاف السريري لجينات KRAS في الداخل والخارج طريقة ARMS ، ولكن نظرًا لأن الطريقة تعتمد على تقنية PCR ، فإن عيبها هو أنه لا يمكن اكتشافها إلا طفرات الموقع المعروفة.
4. في الوقت الحقيقي طريقة مضان الكمي PCR:
إنها طريقة كشف تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد الطفرة بقيمة Ct. إنها تتميز بمزايا الخصوصية القوية والحساسية العالية والقياس الكمي الدقيق والتشغيل السهل والتفاعل المغلق بالكامل. اعتمدت العديد من المجموعات التجريبية هذه الطريقة للكشف عن طفرات KRAS في سرطان القولون والمستقيم. بالمقارنة مع طريقة التسلسل المباشر، يحتل PCR الكمي ميزة أكبر في الحساسية. يعتقد معظم العلماء الذين يقارنون الطريقتين أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أكثر حساسية. ليو وي وآخرون. تم استخدام طريقتين لإجراء تحليل مفصل لنتائج الكشف عن 280 حالة من طفرات جين KRAS لسرطان القولون والمستقيم، و94 حالة من طفرات تسلسل الجينات KRAS، وكان المعدل الإيجابي 33.57٪ (94/280)، منها مضان كمي في الوقت الحقيقي كانت نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل إيجابية، وكانت حساسية 91 حالة 96.8% (91/94). من بين 186 حالة من النوع البري للتسلسل الجيني، كانت 184 منها سلبية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، مع خصوصية 98.9% (184/186). وكان معدل المصادفة بين طريقة PCR الكمية في الوقت الحقيقي وطريقة التسلسل الجيني المباشر 98.2٪. وفي طريقتي الكشف كانت معدلات التطابق الإيجابية والسلبية لكل موقع طفرة أعلى من 90%، كما وصلت نسبة التطابق لأربعة مواقع إلى 100%. وكانت نتائج الكشف عن الطريقتين متسقة للغاية، مما يشير إلى أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلورسنتي هو طريقة أكثر موثوقية للكشف عن الطفرات. ومع ذلك، تحتاج الطرق المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تصميم بادئات وتحقيقات بناءً على أنواع الطفرات المعروفة، لذلك لا يمكن اكتشاف جميع الطفرات المحتملة، ويمكن اكتشاف مواقع محددة فقط. إذا لم يتم تضمين موقع معين في نطاق الكشف الخاص بالمجموعة، حتى لو كانت هناك طفرة بالفعل، فإن نتيجة المجموعة لا تزال سلبية. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عالية، ما إذا كانت هناك نتائج إيجابية كاذبة لا تزال بحاجة إلى التحقق منها بواسطة تقنية تسلسل الحمض النووي، أو التجارب السريرية بأثر رجعي ومستقبلي مع أحجام عينات كبيرة لتأكيد العلاقة بين حالة طفرة KRAS وفعالية الاختبارات المستهدفة. المخدرات . ولذلك، لا ينبغي متابعة الحساسية العالية للكشف عن الطفرات بشكل أعمى، في حين ينبغي تجاهل خصوصية ودقة الكشف. في ظل ظروف معملية مختلفة، قد تكون الطريقة المثلى للكشف عن الطفرات في العينات مختلفة أيضًا. بالنسبة للعينات التي لديها نسبة أعلى من الطفرات، فإن طريقة تسلسل سانجر لديها دقة أعلى في اكتشاف الطفرات الجينية، بينما بالنسبة للعينات ذات نسبة أقل من الطفرات، فإن طريقة تسلسل سانجر قد تحدث سلبيات كاذبة، وطريقة الكشف تستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري كمنصة تقنية يمكن أن تتميز بحساسية عالية.
5. طريقة إدارة الموارد البشرية:
إنها واحدة من أكثر طرق الكشف عن الجينات شيوعًا في السنوات الأخيرة. لها مزايا الأنبوب البسيط ، السريع ، الحساس ، والمفرد لتجنب التلوث. من أجل استكشاف جدوى استخدامه في الاختبارات السريرية ، استخدم Liu Liqin وآخرون طريقة HRM لاكتشاف طفرات جينية KRAS في 64 مريضًا بسرطان القولون والمستقيم ، ثم استخدموا التسلسل المباشر للتحقق من النتائج. تم العثور على نتائج إدارة الموارد البشرية والتسلسل المباشر لتكون متسقة. بالمقارنة مع التسلسل المباشر ، فإن اكتشاف طفرات جينات KRAS بواسطة إدارة الموارد البشرية بسيط ودقيق ، مما يشير إلى أنها طريقة موثوقة ومناسبة للاختبار السريري. Chen Zhihong et al. استخدمت طريقة إدارة الموارد البشرية لاختبار سلسلة من العينات المختلطة التي تحتوي على نسب مختلفة من البلازميدات المتحولة من KRAS لتقييم حساسيتها. وجد أن نسبة طفرات البلازميد في العينات المختلطة كانت 10٪ ، والحساسية وصلت إلى 10٪. بعد ذلك ، تم استخدام الطريقة للكشف عن الطفرات الجينية KRAS في 60 عينة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم. بالمقارنة مع طريقة التسلسل المباشر ، كانت حساسية طريقة إدارة الموارد البشرية 100٪ ، وكانت الخصوصية 96٪ (43/45). عيب طريقة إدارة الموارد البشرية هو أنه من المستحيل توفير نوع الطفرة المحدد بدقة وأي كودون تم تحويره. إذا تم العثور على شذوذ في منحنى الذوبان ، فإن طريقة التسلسل ضرورية لتحديد نوع الطفرة. استخدمت مجموعة أبحاث Harlé 156 حالة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم لمقارنة أساليب تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري ، ونظام ARMS ، وإدارة الموارد البشرية. تشير النتائج إلى أنه على الرغم من أن الطرق الثلاث مناسبة للاختبار السريري ، فإن موثوقية إدارة الموارد البشرية ليست جيدة مثل الطريقتين الأخريين.
6. طرق أخرى:
بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه ، فإن طرق الكشف الأخرى لها مزاياها وعيوبها الخاصة في التطبيق ، مثل PCR-SSCP ، كروماتوجرافيا السائل عالية الأداء ، طريقة مسبار قليل النوكليوتيد الفلوري المحسن PCR ، طريقة الجمع بين PCR و ARMS المتداخلة ، COLD-PCR الطريقة ، إلخ. الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لها خصوصية قوية ، ولكن الطلب على العينات كبير ؛ PCR-SSCP منخفض التكلفة واقتصادي ، لكن العملية معقدة ؛ تتميز تقنية اكتشاف الطفرات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوري بخصوصية قوية وحساسية عالية وكمية دقيقة وتشغيل سهل وتفاعل محجوب بالكامل ومزايا أخرى ، ولكن جميعها تحتاج إلى تصميم بادئات وتحقيقات وفقًا لنوع الطفرة المعروفة ، لذلك يمكن فقط مواقع محددة ، ولا يمكن اكتشاف جميع الطفرات المحتملة.
3. ملخص
باختصار ، نظرًا لأن مواقع الطفرات وطرق الكشف في المختبرات المختلفة ليست موحدة ، فإن حجم عينات الورم التي تم تحليلها ونوعية استخراج الحمض النووي غير متساويين ، مما أدى إلى وجود نتائج تجريبية كبيرة أو صغيرة بين المختبرات. من KRAS في الكشف عن الطفرات الجينية أصبح موضوع اكتشاف سريري مثير للقلق في العديد من البلدان. في الوقت الحاضر ، هناك العديد من الطرق لاكتشاف الطفرات في جين KRAS. الحساسية من الأعلى إلى الأدنى هي ARMS ، والتسلسل الحراري ، وإدارة الموارد البشرية ، و PCR الكمي في الوقت الحقيقي ، والتسلسل المباشر. من الواقع الإكلينيكي ، الحساسية المنخفضة لا تساعد على العلاج السريري ، ولكن الأساليب الحساسة للغاية ستؤدي إلى انخفاض خصوصية الكشف ، وقد تحدث نتائج إيجابية خاطئة غير ضرورية وتؤثر على نظام العلاج اللاحق للمريض. بالنظر إلى الجوانب المذكورة أعلاه ، جنبًا إلى جنب مع الطريقة المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء ، يوصى باستخدام طريقة قسم إدارة المحفوظات والسجلات. بالطبع ، من منظور السوق ، لا ينبغي أن تؤكد علي التشخيصات الجزيئية
ولكن ركز على النتائج الصحيحة النهائية. يمكن للمختبرات المختلفة أن تتبنى طرق اختبار مناسبة وفقًا للوضع الفعلي ، ولكن فقط إذا كانت تتمتع بمؤهلات مشغل جيدة وأنظمة داخلية لمراقبة الجودة. في ظل الظروف البيئية الحالية للمختبر المحلي ، من الضروري إجراء الاختبار في مختبر PCR قياسي والمشاركة في أنشطة مراقبة الجودة المحلية والدولية بين الغرف لضمان جودة اختبار معملية موثوقة. الإدارة الموحدة هي شرط ضروري لضمان نتائج ثابتة. في الصين ، هناك حاجة ملحة لتوحيد وتوحيد الاختبارات السريرية لجين KRAS ، وإنشاء برنامج اختبار موحد وموحد وفقًا للاحتياجات المختلفة ، ويمكن توسيع هذا البرنامج للكشف عن BRAF و PIK23450_3CA و EGFR و الجينات الأخرى لتعزيز اختبار علم الأمراض الجزيئي السريري.
