Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Позитивний показник мутації гена KRAS при раку прямої кишки
При колоректальному раку рівень мутації гена KRAS сягає від 35% до 45%, а місцем мутації з високим ризиком є кодони 12 і 13 на екзоні 2, і все ще є рідкісні, такі як 61 і 146. Мутація сайт. Існує безліч методів виявлення мутацій генів KRAS, включаючи пряме секвенування, аналіз кривої плавлення з високою роздільною здатністю (HRM), піросеквенування, кількісну ПЛР, систему блоків посилення мутацій (amplinc atio), систему рефрактерних мутацій (ARMS), поліморфізм довжини фрагментів рестрикції (RFLP), полімеразна ланцюгова реакція - одноланцюговий конформаційний поліморфізм конформації (ПЛР - одноланцюговий поліморфізм конфомації (PCR-SSCP), коампліфікація при нижчій температурі денатурації ПЛР (COLD-PCR) та високоефективний аналіз рідинної хроматографії тощо.
2. Оцінка методів виявлення мутації KRAS
1. Метод прямого секвенування: Це найбільш класичний метод виявлення мутацій гена KRAS, а також є золотим стандартом для виявлення генних мутацій. Метод прямого секвенування, заснований на принципі дідеокси-секвенування, може найбільш інтуїтивно продемонструвати зміну генної послідовності у вигляді базової карти піків. Тип виявлення є більш повним, і це також найбільш ранній метод виявлення мутацій. Незважаючи на появу платформ секвенування нового покоління, вчені в країні та за кордоном все ще використовують результати прямого секвенування як шкалу для вимірювання та визначення надійності нового методу. Гао Цзин та ін. Застосовували пряме секвенування для виявлення мутацій гена KRAS та BRAF у 966 пацієнтів з колоректальним раком. Це також аналіз мутації гена KRAS з найбільшим вітчизняним зразком, про який повідомляється в літературі. Лінг Юн та інші вважають, що метод прямого секвенування є найбільш прямим та ефективним методом виявлення для розуміння статусу мутації кожного гена, який може уточнити тип мутації, особливо для виявлення невідомих мутацій. Хоча чутливість цього методу відносно низька, його можна покращити такими методами, як мікродісекція для збагачення пухлинних клітин. Метод прямого секвенування також застосовувався для виявлення KRAS більших розмірів зразків в інших вітчизняних дослідницьких групах. Однак менша чутливість є найбільшим недоліком прямого секвенування. Судячи з результатів, повідомлених у Китаї, частота виявлення мутацій шляхом прямого секвенування не є низькою. Лю Сяоїн та ін. Порівняли пряме секвенування та пептидну затискач нуклеїнової кислоти ПЛР (PNA-PCR) та виявили, що шляхом прямого секвенування було виявлено 43 випадки мутації гена KRAS. На додаток до цих мутацій, PNA-PCR виявляли також шляхом прямого секвенування. Було виявлено десять мутацій дикого типу, і було запропоновано визначити пацієнтів дикого типу методом ПЛР та методом прямого секвенування для визначення мутантів. Qiu Tian та ін. Виявлено 131 зразок раку прямої кишки методом флуоресцентного ПЛР-оптимізованого олігонуклеотидного зонду та методом прямого секвенування, а позитивні показники мутації генів KRAS становили 41.2% (54/131) та 40.5% (53/131). Бай Дуню також обговорив чутливість виявлення різних методів. З 200 хворих на рак прямої кишки 63 виявлено за допомогою мутацій RT-qPCR, а коефіцієнт виявлення мутацій становив 31.5%; 169 зразків успішно секвенували шляхом прямого секвенування 50 випадків мутації, коефіцієнт виявлення мутації 29.6%. Хоча метод прямого секвенування може точно, об'єктивно і конкретно виявити стан мутації гена KRAS, його недоліки, такі як високі технічні вимоги, складні операційні процедури, які легко викликати перехресне забруднення, а також трудомістка та копітка інтерпретація результатів також дуже очевидний. Часто обладнання для секвенування відсутнє, і зразок потрібно направити у відповідну компанію для тестування, що займає тривалий час і має високу вартість, тому воно має великі обмеження.
Метод піросеквенування:
Метод піросеквенування також є більш зручним методом для виявлення мутації гена KRAS з точки зору чутливості до секвенування, вартості виявлення та часу на повідомлення. Повторюваність цього методу є кращою. Згідно з отриманою картою піків Кількісне вивчення частоти мутацій певного сайту та порівняння між частотами мутацій різних сайтів чіткі з першого погляду. В останні роки Огіно та ін., Хатчінс та ін. Використовували технологію піросеквенування для тестування мутацій KRAS у пацієнтів з великими зразками колоректального раку. Результати показують, що технологія піросеквенування є потужним інструментом для обстеження пацієнтів для цілеспрямованої терапії. Молекулярна діагностика пухлини має широкі перспективи застосування. Вітчизняні вчені також використовували технологію піросеквенування для клінічного виявлення мутацій KRAS при раку прямої кишки з хорошою точністю та надійністю. Цей метод має кращу специфічність і вищу чутливість. Сундстрем та ін. Порівнявши специфічну для алелів ПЛР та піросеквенування у клінічному застосуванні, встановили, що у 314 випадках мутації KRAS у хворих на рак прямої кишки специфічність піросеквенування перевищувала специфічність алелів. ПЛР і має хорошу чутливість до тканин з низьким вмістом клітин пухлини. Розбавити частку пухлинних клітин до 1.25% до 2.5%. Піросеквенування все ще може виявляти мутаційні сигнали. Коли мінімальний вміст мутантних алелей у зразку повинен досягати 20%, щоб виявити за допомогою секвенування Сангера, його можна виявити методом HRM, коли він досягає 10%, а для піросеквенування тільки мутації можна виявити на 5%. Алелі. Ми використовували піросеквенцію для виявлення мутацій KRAS у 717 пацієнтів з колоректальним раком і виявили, що частота мутацій KRAS становила 40.9%. Частота мутації кодону 12 становила 30.1%, частота мутації кодону 13 - 9.8%, а частота мутації кодону 61 - 1.0%. Ми збагатили тканини більш високим вмістом пухлини шляхом ручної мікродисекції перед тестуванням, роблячи результати більш надійними. Метод має хорошу чутливість і специфічність, і його легко розробити в клінічній практиці. Недоліком піросеквенування є висока вартість виявлення, а процес підготовки одноланцюгової ДНК для секвенування зразків громіздкий. У майбутньому піросеквенування може бути присвячене розробці технології прямого виявлення дволанцюжкових продуктів ПЛР, що значно спростить операцію. І ефективно знизити вартість секвенування для досягнення всебічного просування клінічного тестування.
3. Збройовий метод:
Ця технологія використовує праймери для розрізнення генів дикого типу та мутантів, wh
про них повідомлялося ще у 1980-х роках. Найбільша перевага цього методу полягає в тому, що він має чутливість до 1.0% і може виявляти мутантні гени у зразках до 1.0%. У дизайні довжина цільового продукту може бути скорочена в найбільшій мірі, і проблема в тому, що неможливо отримати точні результати виявлення, оскільки більша частина ДНК, витягнутої з вкладеного в парафін зразка тканини, фрагментована. Ця технологія поєднує ПЛР-платформу в реальному часі для досягнення роботи в закритих трубках під час посилення. Операція проста і не вимагає подальшої обробки продукту, що дозволяє уникнути забруднення ампліфікованого продукту найбільшою мірою. В даний час у світі частіше використовується метод скорпіона-ARMS, що поєднує зонд скорпіона та систему мутації блоку посилення. Поєднання двох технологій може максимізувати чутливість і специфічність обох сторін. Гао Цзе та співавт. Застосовували цей метод для виявлення статусу мутації гена KRAS у 167 пацієнтів з колоректальним раком, припускаючи, що цей метод є надійним і точним. Ван Хуей та ін. Також використовували ARMS для виявлення мутацій KRAS у 151 випадку фіксованих формальдегідом та вбудованих у парафін тканин. У США комплект COBAS (Roche), схвалений FDA для клінічних випробувань KRAS, та комплект Therascreen RGQ (Qiagen), сертифікований Європейським Союзом з діагностики in vitro (CE-IVD), використовують принцип ARMS. Серед найпоширеніших методів метод ARMS є найбільш чутливим і вартість відносно обґрунтована. Тому велика частина клінічного виявлення генів KRAS у нас та за кордоном використовують метод ARMS, але оскільки метод заснований на технології ПЛР, його недоліком є те, що його можна виявити лише за відомими мутаціями сайтів.
4. Кількісний метод ПЛР у режимі реального часу:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. Метод HRM:
Це один із найбільш часто використовуваних методів виявлення генів в останні роки. Він має переваги простої, швидкої, чутливої та однієї трубки, щоб уникнути забруднення. Для того, щоб дослідити доцільність його використання в клінічних випробуваннях, Liu Liqin та інші використовували метод HRM для виявлення мутацій гена KRAS у 64 пацієнтів з колоректальним раком, а потім використовували пряме секвенування для перевірки результатів. Встановлено, що результати HRM та прямого послідовності є послідовними. У порівнянні з прямим секвенуванням виявлення мутацій гена KRAS за допомогою HRM є простим і точним, що свідчить про те, що це надійний метод, придатний для клінічного тестування. Chen Zhihong та співавт. Метод HRM використовували для тестування серії змішаних зразків, що містять різні пропорції мутантних плазмід KRAS, для оцінки їх чутливості. Було встановлено, що частка плазмідних мутацій у змішаних зразках становила 10%, а чутливість сягала 10%. Згодом метод був використаний для виявлення мутації гена KRAS у 60 зразках тканин раку прямої кишки. Порівняно з методом прямого секвенування чутливість методу HRM становила 100%, а специфічність - 96% (43/45). Недоліком методу HRM є те, що неможливо точно вказати конкретний тип мутації і який кодон мутує. Якщо на кривій плавлення виявляється аномалія, для визначення типу мутації необхідний метод секвенування. Дослідницька група Харле використовувала 156 випадків тканин раку прямої кишки для порівняння флуоресцентних методів ПЛР, ARMS та HRM. Результати свідчать про те, що, хоча ці три методи є придатними для клінічних випробувань, надійність HRM не така хороша, як інші два методи.
6. Інші методи:
На додаток до вищезазначених методів, інші методи виявлення мають свої переваги та недоліки в застосуванні, такі як ПЛР-SSCP, високоефективна рідинна хроматографія, флуоресцентний метод оптимізованого олігонуклеотидного зонду, оптимізований ПЛР, Спосіб вкладеної ПЛР та комбінації ОРУ, ХОЛОД-ПЛР метод тощо. Високоефективна рідинна хроматографія має сильну специфічність, але попит на зразки великий; PCR-SSCP є низьким за вартістю та економічним, але операція складна; Технологія виявлення мутацій, заснована на флуоресцентній ПЛР, має сильну специфічність, високу чутливість і точну кількісну, просту експлуатацію, повністю заблоковану реакцію та інші переваги, але всі вони повинні розробляти праймери та зонди відповідно до відомого типу мутації, тому можуть бути визначені лише певні місця виявлено, і всі можливі мутації виявити неможливо.
3. резюме
Підводячи підсумок, оскільки місця мутації та методи виявлення в різних лабораторіях неоднорідні, розмір аналізованих зразків пухлини та якість вилучення ДНК також нерівномірні, що призводить до існування великих або малих експериментальних результатів між лабораторіями. Відмінності, стандартизація виявлення мутації гена KRAS стало проблемою клінічного виявлення, що викликає занепокоєння в різних країнах. В даний час існує багато методів виявлення мутацій гена KRAS. Чутливість від високого до низького - ARMS, піросеквенування, HRM, кількісна ПЛР у режимі реального часу та пряме секвенування. З клінічної реальності низька чутливість не сприяє клінічному лікуванню, але занадто чутливі методи спричинять зниження специфічності виявлення, і можуть виникнути непотрібні помилково позитивні результати, які впливатимуть на подальший режим прийому препарату пацієнтом. Враховуючи вищезазначені аспекти, в поєднанні з методом, затвердженим FDA, рекомендується метод ARMS. Звичайно, з точки зору ринку, молекулярна діагностика не повинна наголошувати на мені
методи, але зосередьтеся на остаточних правильних результатах. Різні лабораторії можуть застосовувати відповідні методи тестування відповідно до фактичної ситуації, але лише за умови, що вони мають хорошу кваліфікацію оператора та внутрішні системи контролю якості. За сучасних умов навколишнього середовища вітчизняної лабораторії необхідно проводити тестування в стандартизованій ПЛР-лабораторії та брати участь у внутрішньокімнатних заходах контролю якості для забезпечення надійної якості лабораторних досліджень. Стандартизоване управління є необхідною умовою для забезпечення постійних результатів. У Китаї існує нагальна потреба уніфікувати та стандартизувати клінічне тестування гена KRAS, а також створити стандартизовану та стандартизовану програму тестування відповідно до різних потреб, і цю програму можна розширити до виявлення BRAF, PIK23450_3CA, EGFR та інші гени для сприяння тестуванню клінічної молекулярної патології.
