Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Pozitívna miera mutácie génu KRAS v rakovine hrubého čreva a konečníka
V prípade kolorektálneho karcinómu je miera mutácie génu KRAS až 35% až 45% a vysoko rizikovým miestom mutácie sú kodóny 12 a 13 na exóne 2 a stále sa vyskytujú zriedkavé mutácie, ako napríklad 61 a 146. stránky. Existuje veľa detekčných metód pre mutácie génu KRAS, vrátane priameho sekvenovania, analýzy krivky topenia s vysokým rozlíšením (HRM), pyrosekvenovania, kvantitatívnej PCR, blokového systému amplifikačnej amplifikácie (amplinc atio), refraktérneho mutačného systému (ARMS), polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP), analýza polymorfizmu polymerázovej reťazovej reakcie - jednoreťazcová konformačná polymorfizmus (PCR-singlestrandový konfomačný polymorfizmus (PCR-SSCP), spoločná amplifikácia pri nízkej denaturačnej teplote PCR (COLD-PCR) a analýza vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie atď.)
2. Hodnotenie metód detekcie mutácií KRAS
1. Metóda priameho sekvenovania: Je to najklasickejšia metóda na detekciu génových mutácií KRAS a je tiež zlatým štandardom na detekciu génových mutácií. Metóda priameho sekvenovania založená na princípe dideoxy sekvenovania môže najintuitívnejšie ukázať zmenu génovej sekvencie vo forme mapy základného píku. Typ detekcie je komplexnejší a je to tiež najskôr použitá metóda detekcie mutácií. Napriek vzniku platforiem pre sekvenovanie novej generácie vedci doma i v zahraničí stále používajú výsledky priameho sekvenovania ako stupnicu na meranie a určovanie spoľahlivosti novej metódy. Gao Jing a kol. Aplikovalo sa priame sekvenovanie na detekciu génových mutácií KRAS a BRAF u 966 pacientov s kolorektálnym karcinómom. Toto je tiež analýza mutácie génu KRAS s najväčšou domácou vzorkou uvedenou v literatúre. Ling Yun a ďalší sa domnievajú, že metóda priameho sekvenovania je najpriamejšou a najúčinnejšou detekčnou metódou na pochopenie stavu mutácie každého génu, ktorá môže objasniť typ mutácie, najmä na detekciu neznámych mutácií. Aj keď je citlivosť tejto metódy relatívne nízka, je možné ju zlepšiť metódami, ako je mikrodisekcia, ktorá obohatí nádorové bunky. Metóda priameho sekvenovania sa tiež použila na detekciu KRAS väčších veľkostí vzoriek v iných domácich výskumných skupinách. Nižšia citlivosť je však najväčšou nevýhodou priameho sekvenovania. Podľa výsledkov hlásených v Číne nie je miera detekcie mutácií priamym sekvenovaním nízka. Liu Xiaojing a kol. V porovnaní s priamym sekvenovaním a peptidovou nukleovou kyselinou pomocou clamp PCR (PNA-PCR) bolo zistené, že priamym sekvenovaním bolo zistených 43 prípadov mutácií génu KRAS. Okrem týchto mutácií sa PNA-PCR detegovala aj priamym sekvenovaním. Desať mutácií sa našlo u divokého typu a boli predložené návrhy na stanovenie pacientov divokého typu pomocou PCR a metódou priameho sekvenovania na stanovenie mutantných pacientov. Qiu Tian a kol. Zistilo sa 131 vzoriek rakoviny hrubého čreva metódou oligonukleotidovej sondy optimalizovanej fluorescenčnou PCR a metódou priameho sekvenovania a pozitívny pomer mutácií génu KRAS bol 41.2% (54/131) a 40.5% (53/131)). Bai Dongyu tiež diskutoval o citlivosti detekcie rôznych metód. Z 200 pacientov s kolorektálnym karcinómom bolo 63 detegovaných mutáciami RT-qPCR a miera detekcie mutácií bola 31.5%; 169 vzoriek bolo úspešne sekvenovaných priamym sekvenovaním 50 prípadov mutácie, miera detekcie mutácií 29.6%. Aj keď metóda priameho sekvenovania dokáže presne, objektívne a špecificky zistiť stav mutácie génu KRAS, veľmi malé sú aj jej nedostatky, ako sú vysoké technické požiadavky, komplikované operačné postupy, ľahká krížová kontaminácia a časovo náročná a namáhavá interpretácia výsledkov. zrejmé. Sekvenčné zariadenie často nie je k dispozícii a vzorka musí byť odoslaná na testovanie príslušnej spoločnosti, čo trvá dlho a má vysoké náklady, takže má veľké obmedzenia.
Metóda pyrosekvenovania:
Metóda pyrosekvenovania je tiež pohodlnejšou metódou na detekciu génovej mutácie KRAS z hľadiska citlivosti sekvenovania, nákladov na detekciu a času potrebného na podanie správy. Opakovateľnosť tejto metódy je lepšia. Podľa získanej mapy píku Kvantitatívna štúdia frekvencie mutácií určitého miesta a porovnanie medzi frekvenciami mutácií rôznych miest sú zrejmé na prvý pohľad. V posledných rokoch Ogino a kol., Hutchins a kol. Použili technológiu pyrosekvenovania na testovanie mutácií KRAS u pacientov s veľkými vzorkami rakoviny hrubého čreva a konečníka. Výsledky naznačujú, že technológia pyrosekvenovania je účinným nástrojom na skríning pacientov na cielenú liečbu. Molekulárna diagnostika nádoru má široké uplatnenie. Domáci vedci tiež použili technológiu pyrosekvenovania na klinickú detekciu mutácií KRAS v rakovine hrubého čreva a konečníka s dobrou presnosťou a spoľahlivosťou. Táto metóda má lepšiu špecifickosť a vyššiu citlivosť. SundstrÖm a kol. V porovnaní s alelicky špecifickou PCR a pyrosekvenovaním v klinických aplikáciách sa zistilo, že v 314 prípadoch mutácií KRAS u pacientov s kolorektálnym karcinómom bola špecifickosť pyrosekvenovania vyššia ako u alel. PCR a má dobrú citlivosť na tkanivá s nízkym obsahom nádorových buniek. Zrieďte podiel nádorových buniek na 1.25% až 2.5%. Pyrosekvenovanie môže stále detegovať mutačné signály. Keď je potrebné, aby minimálny obsah mutantných alel vo vzorke dosiahol 20%, aby sa detegoval Sangerovým sekvenovaním, dá sa to zistiť metódou HRM, keď dosiahne 10%, a pri pyrosekvenovaní je možné detegovať iba mutácie o 5%. Alely. Pomocou pyrosekvenovania sme detekovali mutácie KRAS u 717 pacientov s kolorektálnym karcinómom a zistili sme, že frekvencia mutácií KRAS bola 40.9%. Rýchlosť mutácie kodónu 12 bola 30.1%, rýchlosť mutácie kodónu 13 bola 9.8% a rýchlosť mutácie kodónu 61 bola 1.0%. Pred testovaním sme tkanivá obohatili o vyšší obsah nádoru manuálnou mikrodisekciou, vďaka čomu boli výsledky spoľahlivejšie. Metóda má dobrú citlivosť a špecifickosť a je ľahko vyvinutá v klinickej praxi. Nevýhodou pyrosekvenovania sú vysoké náklady na detekciu a proces prípravy jednovláknovej DNA na sekvenovanie vzoriek je ťažkopádny. V budúcnosti možno pyrosekvenovanie venovať vývoju technológie na priamu detekciu dvojvláknových produktov PCR, čo výrazne zjednoduší operáciu. A efektívne znížiť náklady na sekvenovanie, aby ste dosiahli komplexnú podporu klinických testov.
3. Metóda ARMS:
Táto technológia využíva priméry na rozlíšenie génov divokého typu a mutantného typu, wh
boli hlásené už v 1980. rokoch. Najväčšou výhodou tejto metódy je, že má citlivosť až 1.0% a dokáže detekovať mutantné gény vo vzorkách už od 1.0%. V dizajne možno dĺžku cieľového produktu skrátiť do najväčšej miery a problém, že nemožno dosiahnuť presné výsledky detekcie, nie je možné získať, pretože väčšina DNA extrahovanej z parafínom zaliatych vzoriek tkaniva je fragmentovaná. Táto technológia kombinuje platformu PCR v reálnom čase, aby sa počas amplifikácie dosiahlo fungovanie uzavretej skúmavky. Operácia je jednoduchá a nevyžaduje následné spracovanie produktu, čo môže v najväčšej miere zabrániť kontaminácii amplifikovaného produktu. V súčasnosti sa vo svete bežne používa metóda škorpión-ARMS kombinujúca škorpiónovú sondu a systém mutácie amplifikačných blokov. Kombinácia týchto dvoch technológií môže maximalizovať citlivosť a špecifickosť oboch strán. Gao Jie a kol. Táto metóda sa použila na zistenie stavu mutácie génu KRAS u 167 pacientov s kolorektálnym karcinómom, čo naznačuje, že táto metóda je spoľahlivá a presná. Wang Hui a kol. Tiež sa použil ARMS na detekciu mutácií KRAS v 151 prípadoch tkanív fixovaných formaldehydom a zaliatych parafínom. V Spojených štátoch používa súprava COBAS (Roche) schválená FDA na klinické testovanie KRAS a súprava Therascreen RGQ (Qiagen) certifikovaná Európskou úniou in vitro diagnostiku (CE-IVD) princíp ARMS. Spomedzi bežných metód je metóda ARMS najcitlivejšia a náklady sú pomerne prijateľné. Preto veľká časť klinickej detekcie génov KRAS doma i v zahraničí používa metódu ARMS, ale pretože metóda je založená na technológii PCR, jej nedostatkom je, že ju možno detegovať iba známe mutácie miesta.
4. Kvantitatívna metóda fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. Metóda HRM:
Je to jedna z najbežnejšie používaných metód detekcie génov v posledných rokoch. Má výhody jednoduchej, rýchlej, citlivej a samostatnej trubice, aby sa zabránilo znečisteniu. Aby sa preskúmala uskutočniteľnosť jeho použitia v klinickom testovaní, Liu Liqin a ďalší použili metódu HRM na detekciu mutácií génu KRAS u 64 pacientov s kolorektálnym karcinómom a potom na overenie výsledkov použili priame sekvenovanie. Zistilo sa, že výsledky HRM a priameho sekvenovania sú konzistentné. V porovnaní s priamym sekvenovaním je detekcia mutácií génu KRAS pomocou HRM jednoduchá a presná, čo naznačuje, že ide o spoľahlivú metódu vhodnú na klinické testovanie. Chen Zhihong a kol. Použila sa metóda HRM na testovanie série zmiešaných vzoriek obsahujúcich rôzne podiely mutantných plazmidov KRAS na vyhodnotenie ich citlivosti. Zistilo sa, že podiel plazmidových mutácií v zmiešaných vzorkách bol 10% a citlivosť dosiahla 10%. Následne bola metóda použitá na detekciu mutácií génu KRAS v 60 vzorkách tkaniva hrubého čreva a konečníka. V porovnaní s metódou priameho sekvenovania bola citlivosť metódy HRM 100% a špecifickosť 96% (43/45). Nevýhodou metódy HRM je, že nie je možné presne poskytnúť konkrétny typ mutácie a ktorý kodón je mutovaný. Ak sa na krivke topenia zistí abnormalita, je na určenie typu mutácie potrebná metóda sekvenovania. Výskumná skupina Harlé použila 156 prípadov tkaniva rakoviny hrubého čreva a konečníka na porovnanie metód fluorescenčnej PCR, ARMS a HRM. Výsledky naznačujú, že hoci sú tieto tri metódy vhodné na klinické testovanie, spoľahlivosť HRM nie je taká dobrá ako v prípade ostatných dvoch metód.
6. Iné metódy:
Okrem vyššie uvedených metód majú ďalšie detekčné metódy svoje vlastné výhody a nevýhody v aplikácii, ako napríklad PCR-SSCP, vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, metóda fluorescenčnej PCR optimalizovanej oligonukleotidovej sondy, metóda kombinácie vnorenej PCR a ARMS, COLD-PCR metóda atď. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia má silnú špecifickosť, ale dopyt po vzorkách je veľký; PCR-SSCP je nenákladný a ekonomický, ale operácia je komplikovaná; technológia detekcie mutácií založená na fluorescenčnej PCR má silnú špecifickosť, vysokú citlivosť a presné kvantitatívne vlastnosti, ľahkú obsluhu, plne blokovanú reakciu a ďalšie výhody, ale je potrebné navrhnúť priméry a sondy podľa známeho typu mutácie, takže je možné lokalizovať iba konkrétne miesta možné detekovať všetky možné mutácie.
3. Zhrnutie
Stručne povedané, pretože mutačné miesta a detekčné metódy v rôznych laboratóriách nie sú jednotné, veľkosť analyzovaných vzoriek nádoru a kvalita extrakcie DNA sú tiež nerovnomerné, čo vedie k existencii veľkých alebo malých experimentálnych výsledkov medzi laboratóriami. Rozdiely, štandardizácia detekcie génovej mutácie KRAS sa stal problémom klinickej detekcie v mnohých krajinách. V súčasnosti existuje veľa metód na detekciu mutácií v géne KRAS. Citlivosť od vysokej po nízku je ARMS, pyrosekvenovanie, HRM, kvantitatívna PCR v reálnom čase a priame sekvenovanie. Z klinickej reality nie je nízka citlivosť priaznivá pre klinickú liečbu, ale príliš citlivé metódy spôsobia pokles špecificity detekcie a môžu sa vyskytnúť zbytočné falošne pozitívne výsledky, ktoré ovplyvnia následný liečebný režim pacienta. Vzhľadom na vyššie uvedené aspekty sa v kombinácii s metódou schválenou FDA odporúča metóda ARMS. Z hľadiska trhu by ma samozrejme molekulárna diagnostika nemala zdôrazňovať
thods, ale zamerajte sa na konečné správne výsledky. Rôzne laboratóriá môžu prijať vhodné testovacie metódy podľa aktuálnej situácie, ale iba ak majú dobrú kvalifikáciu operátora a interné systémy kontroly kvality. V súčasných podmienkach domáceho prostredia laboratórií je potrebné vykonávať testovanie v štandardizovanom laboratóriu PCR a zúčastňovať sa domácich a medzinárodných aktivít kontroly kvality medzi miestnosťami, aby sa zabezpečila spoľahlivá kvalita laboratórnych testov. Štandardizované riadenie je nevyhnutnou podmienkou na zabezpečenie konštantných výsledkov. V Číne je naliehavá potreba zjednotiť a štandardizovať klinické testovanie génu KRAS a vytvoriť štandardizovaný a štandardizovaný testovací program podľa rôznych potrieb, pričom tento program možno rozšíriť na detekciu BRAF, PIK23450_3CA, EGFR a iné gény na podporu klinického testovania molekulárnej patológie.
