Кетуксимаб жана панитумумаб сыяктуу максаттуу дары-дармектер клиникада колоректалдык ракка каршы эффективдүү терапиялык препараттар катары кеңири колдонулуп келет. Клиникалык маалыматтар көрсөткөндөй, КРАС мутациялары бар бейтаптар бул моноклоналдык антитело препаратына олуттуу таасир этпейт жана жапайы түрдөгү бейтаптар гана андан пайда ала алышат. Ошондуктан, KRAS ген мутациясынын статусу клиникалык жактан маанилүү терапиялык маркер катары каралат, ал колоректалдык рактын прогнозуна жана дарылоо эффектисине күчтүү байланышы бар. 2009-жылы Улуттук Рак Комплекстүү Тармагы (NCCN) Колоректалдык Рак Клиникалык Практикасынын Колдонмосунда метастаздык колоректалдык рагы менен ооруган бардык бейтаптар KRAS ген мутациясынын абалын аныктоого тийиш жана EGFR максаттуу терапиясын алуу үчүн KRAS жапайы түрү гана сунушталат. Ошол эле жылы Америкалык клиникалык онкология коому (ASCO) ошондой эле шишиктин максаттуу терапиясы үчүн молекулярдык маркер катары клиникалык дарылоо боюнча сунуштарды чыгарды, бул анын маанилүү жетектөөчү маанисин көрсөтөт. Учурда КРАС генетикалык тестирлөө клиникалык жактан кеңири жүргүзүлүүдө. Биз, негизинен, клиникалык тандоодо шилтеме үчүн KRAS ген мутациясын аныктоонун ата мекендик ыкмаларын баалайбыз.
1. Колоректалдык рактын КРАС ген мутациясынын оң көрсөткүчү
Колоректалдык ракта KRAS генинин мутациясынын деңгээли 35%тен 45%ке чейин жогору, ал эми жогорку коркунучтуу мутация аймагы 12-экзондогу 13 жана 2-кодондор болуп саналат жана 61 жана 146 сыяктуу сейрек кездешүүлөр дагы эле бар. сайт. KRAS ген мутацияларын аныктоонун көптөгөн ыкмалары бар, анын ичинде түз секвенирлөө, жогорку резолюциядагы эрүү ийри сызыгынын анализи (HRM), пиросеквенирлөө, сандык ПТР, мутацияны күчөтүү блок системасы (amplinc atio)nrefractorymutation системасы (ARMS), чектөө фрагменттеринин узундугу полиморфизми (RFLP), полимераздык чынжыр реакциясы-бир тилкелүү конформациялык полиморфизмди талдоо (ПТР-бир катар конфомация полиморфизми (ПЦР-ССКП), денатурациянын төмөнкү температурасында биргелешип күчөтүү ПТР (СУУК-ПЦР) жана жогорку натыйжалуу суюк хроматографиялык анализ ж.б.у.с.).
2. КРАС мутациясын аныктоо ыкмаларын баалоо
1. Түз секвенирлөө ыкмасы: Бул КРАС ген мутациясын аныктоонун эң классикалык ыкмасы, ошондой эле ген мутациясын аныктоонун алтын стандарты болуп саналат. Дидеокси секвенирлөө принцибине негизделген тике секвенирлөө ыкмасы ген ырааттуулугунун өзгөрүшүн базалык пик картасы түрүндө эң интуитивдик түрдө көрсөтө алат. Тактоо түрү кыйла кеңири жана ал мутацияны аныктоонун эң алгачкы ыкмасы болуп саналат. Жаңы муундун секвенирлөө платформаларынын пайда болгонуна карабастан, үйдөгү жана чет өлкөлүк окумуштуулар дагы эле жаңы ыкманын ишенимдүүлүгүн өлчөө жана аныктоо үчүн шкала катары түз секвенирлөөнүн натыйжаларын колдонушат. Гао Цзин жана башкалар. Колоректалдык рагы менен ооруган 966 бейтапта KRAS жана BRAF ген мутацияларын аныктоо үчүн тике секвенирлөө колдонулат. Бул ошондой эле адабиятта айтылган эң чоң ата мекендик үлгү менен КРАС ген мутациясынын анализи. Лин Юн жана башкалар түз секвенирлөө ыкмасы ар бир гендин мутация абалын түшүнүү үчүн эң тике жана эффективдүү аныктоо ыкмасы болуп саналат деп эсептешет, ал мутациянын түрүн, өзгөчө белгисиз мутацияларды аныктоо үчүн тактай алат. Бул ыкманын сезгичтиги салыштырмалуу төмөн болсо да, шишик клеткаларын байытуу үчүн микродиссекция сыяктуу ыкмалар менен жакшыртса болот. Түз секвенирлөө ыкмасы КРАСтын башка ата мекендик изилдөө топторунда чоңураак үлгүлөрдү аныктоодо да колдонулган. Бирок, төмөнкү сезгичтик түз секвенирлөөнүн эң чоң кемчилиги болуп саналат. Кытайда билдирилген жыйынтыктарга караганда, тике секвенирлөө аркылуу мутацияны аныктоо көрсөткүчү төмөн эмес. Liu Xiaojing жана башкалар. Түз секвенирлөө жана пептиддик нуклеиндик кычкыл кысгыч ПТР (PNA-PCR) салыштырылып, түз секвенирлөө жолу менен KRAS ген мутациясынын 43 учуру аныкталган. Бул мутациялардан тышкары, PNA-PCR да түз секвенирлөө жолу менен аныкталган. Жапайы типте он мутация табылып, жапайы типтеги бейтаптарды ПТР жана мутанттык бейтаптарды аныктоо үчүн тике секвенирлөө ыкмасы менен аныктоо боюнча сунуштар берилди. Qiu Tian жана башкалар. Флуоресценттик ПТР оптималдаштырылган олигонуклеотиддик зонд ыкмасы жана тике секвенирлөө ыкмасы менен 131 колоректалдык рак үлгүлөрү аныкталган жана КРАС ген мутацияларынын оң көрсөткүчтөрү 41.2% (54/131) жана 40.5% (53/131) болгон. Bai Dongyu ошондой эле ар кандай ыкмаларды аныктоо сезимталдыкты талкуулады. Колоректалдык рагы менен ооруган 200 оорулуудан 63 RT-qPCR мутациялары менен аныкталган жана мутацияны аныктоо көрсөткүчү 31.5% түзгөн; Мутациянын 169 учурун тике секвенирлөө жолу менен 50 үлгү ийгиликтүү секвенирленген, мутацияны аныктоо коэффициенти 29.6%. Түз секвенирлөө ыкмасы КРАС ген мутациясынын абалын так, объективдүү жана атайын аныктай алса да, анын кемчиликтери, мисалы, жогорку техникалык талаптар, татаал операция процедуралары, кайчылаш булганууну пайда кылуу оңой жана натыйжаларды көп убакытты талап кылган жана көп түйшүктүү интерпретациялоо. ачык. Көбүнчө секвенирлөөчү жабдыктар жок, үлгүнү текшерүү үчүн тиешелүү компанияга жөнөтүү керек, бул көп убакытты талап кылат жана кымбатка турат, ошондуктан анын чоң чектөөлөрү бар.
Пиросеквенирлөө ыкмасы:
Пиросеквенирлөө ыкмасы ошондой эле секвенирлөө сезгичтиги, аныктоонун баасы жана отчет берүү убактысы жагынан КРАС ген мутациясын аныктоо үчүн ыңгайлуу ыкма болуп саналат. Бул ыкманын кайталануучулугу жакшыраак. Алынган пик картасы боюнча Белгилүү бир участоктун мутация жыштыгын сандык изилдөө жана ар кандай участоктордун мутация жыштыктарын салыштыруу бир караганда түшүнүктүү. Акыркы жылдарда Огино жана башкалар, Хатчинс жана башкалар. Колоректалдык рактын чоң үлгүлөрү бар пациенттерде KRAS мутацияларын текшерүү үчүн пиросеквенирлөө технологиясын колдонушкан. Натыйжалар pyrosequecing технологиясы бейтаптарды максаттуу терапия үчүн скрининг үчүн күчтүү курал экенин көрсөтүп турат. Шишиктин молекулярдык диагностикасы кеңири колдонууга ээ. Ата мекендик окумуштуулар ошондой эле pyrosequencing технологиясын жакшы тактык жана ишенимдүүлүк менен, колоректалдык рактын KRAS мутацияларын клиникалык аныктоо үчүн колдонушкан. Бул ыкма жакшыраак өзгөчөлүккө жана жогорку сезгичтикке ээ. SundstrÖm жана башкалар. Клиникалык колдонмолордо аллельдик-спецификалык ПТР жана пиросеквенирлөө салыштырылып, колоректалдык рагы менен ооругандардын КРАС мутациясынын 314 учурларда пиросеквенирлөөнүн өзгөчөлүгү аллельдерден жогору экенин аныкташкан. ПЦР жана шишик клеткасынын мазмуну төмөн ткандарга жакшы сезгичтиги бар. Шишик клеткаларынын үлүшүн 1.25% дан 2.5% га чейин суюлтуңуз. Пиросеквенирлөө дагы эле мутация сигналдарын аныктай алат. Үлгүдөгү мутант аллелдердин минималдуу мазмуну Сэнгер секвенирлөө жолу менен аныктоо үчүн 20% жетиши керек болгондо, ал 10% жеткенде HRM ыкмасы менен, ал эми пиросеквенирлөө үчүн 5% гана мутацияларды аныктоого болот. Аллелдер. Колоректалдык рагы менен ооруган 717 бейтапта КРАС мутациясын аныктоо үчүн пиросеквенирлөө ыкмасын колдондук жана КРАС мутациясынын жыштыгы 40.9%ды түздү. 12-кодондун мутациясынын ылдамдыгы 30.1%, 13-кодондун мутациясынын ылдамдыгы 9.8% жана 61-кодондун мутациясынын ылдамдыгы 1.0% болгон. Биз тестирлөөдөн мурун кол менен микродиссекциялоо жолу менен шишиктин мазмуну жогору болгон кыртыштарды байытып, натыйжаларды ишенимдүүрөөк кылдык. Метод жакшы сезгичтикке жана өзгөчөлүккө ээ жана клиникалык практикада иштеп чыгуу оңой. Пиросеквенирлөөнүн кемчилиги – аныктоонун кымбаттыгы, ал эми үлгүлөрдү секвенирлөө үчүн бир катарлуу ДНКны даярдоо процесси түйшүктүү. Келечекте пиросеквенирлөө операцияны бир топ жөнөкөйлөтүүчү эки катарлуу ПТР продуктуларын түз аныктоо технологиясын иштеп чыгууга арналышы мүмкүн. Ал эми клиникалык тестирлөөнүн комплекстүү илгерилетүүсүнө жетүү үчүн секвенирлөөнүн баасын эффективдүү төмөндөтүңүз.
3. ARMS ыкмасы:
Бул технология жапайы типтеги жана мутанттык гендерди айырмалоо үчүн праймерлерди колдонот
ич 1980-жылдардын башында эле билдирилген. Бул ыкманын эң чоң артыкчылыгы 1.0% га чейин сезгичтикке ээ жана 1.0% төмөн үлгүлөрдөгү мутант гендерди аныктай алат. Дизайнда максаттуу продуктунун узундугу эң чоң даражада кыскартылышы мүмкүн жана парафин менен камтылган кыртыш үлгүсүнөн алынган ДНКнын көбү фрагменттелгендиктен так аныктоо натыйжаларын алуу мүмкүн эмес. Бул технология күчөтүү учурунда жабык түтүктүн иштешине жетишүү үчүн реалдуу убакыт ПТР платформасын бириктирет. Операция жөнөкөй жана продуктуну кийинки иштетүүнү талап кылбайт, бул күчөтүлгөн продуктунун булганышын эң чоң деңгээлде алдын алат. Азыркы учурда дүйнөдө Scorpion-ARMS ыкмасы scorpion зонд жана амплификация блок мутация системасын айкалыштырган ыкмасы көбүрөөк колдонулат. Эки технологиянын айкалышы эки тараптын тең сезгичтигин жана өзгөчөлүгүн арттыра алат. Гао Жие жана башкалар. Бул ыкманы колоректалдык рагы менен ооруган 167 бейтаптын KRAS ген мутациясынын абалын аныктоо үчүн колдонду, бул ыкманын ишенимдүү жана так экенин көрсөтүп турат. Wang Hui жана башкалар. Ошондой эле ARMS формальдегид менен бекитилген жана парафин менен камтылган ткандардын 151 учурунан KRAS мутациясын аныктоо үчүн колдонулган. Америка Кошмо Штаттарында KRAS клиникалык сыноо үчүн FDA тарабынан бекитилген COBAS комплекти (Roche) жана Европа Биримдиги In Vitro Diagnostics (CE-IVD) тарабынан тастыкталган Therascreen RGQ комплекти (Qiagen) бардыгы ARMS принцибин колдонушат. Жалпы ыкмалардын ичинен ARMS ыкмасы эң сезимтал жана баасы салыштырмалуу акылга сыярлык. Ошондуктан, үйдө жана чет өлкөлөрдө КРАС гендерин клиникалык аныктоонун чоң бөлүгү ARMS ыкмасын колдонуп жатат, бирок метод ПЦР технологиясына негизделгендиктен, анын кемчилиги аны бир гана белгилүү сайт мутацияларын аныктоого болот.
4. Реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР ыкмасы:
Бул Ct мааниси боюнча мутацияны аныктоо үчүн ПТРге негизделген аныктоо ыкмасы. Ал күчтүү өзгөчөлүк, жогорку сезгичтик, так сандык аныктоо, жеңил иштетүү жана толук жабык реакциянын артыкчылыктарына ээ. Көптөгөн эксперименталдык топтор бул ыкманы ичеги рагында КРАС мутациясын аныктоо үчүн колдонушкан. Түз секвенирлөө ыкмасы менен салыштырганда, сандык ПТР сезгичтикте көбүрөөк артыкчылыкка ээ. Көпчүлүк окумуштуулар эки ыкманы салыштырып, сандык ПЦР сезгич деп эсептешет. Liu Wei жана башкалар. КРАС ген мутациясынын 280 учуру, КРАС генинин секвенирлөөчү мутациясынын 94 учуру, оң көрсөткүчү 33.57% (94/280), анын ичинен реалдуу убакыт режиминде флуоресценттик сандык ПТР оң болду 91 учурдун сезгичтиги 96.8% (91/94) болгон. 186 ген секвенирлөөчү жапайы типтеги учурлардын 184ү реалдуу убакытта сандык ПТР менен терс болгон, өзгөчөлүгү 98.9% (184/186). Реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР ыкмасы менен гендердин тике секвенирлөө ыкмасынын дал келүү көрсөткүчү 98.2% түздү. Эки аныктоо методдорунда ар бир мутация сайтынын оң жана терс кокустук көрсөткүчтөрү 90% дан жогору болгон жана төрт сайттын дал келүү көрсөткүчү 100% га жеткен. Эки ыкманын аныктоонун натыйжалары абдан ырааттуу болду, бул флуоресценттик сандык ПТРди көрсөтүүдө. Бул мутацияны аныктоонун ишенимдүү ыкмасы. Бирок, ПТРдин негизиндеги методдор белгилүү мутациянын түрлөрүнө негизделген праймерлерди жана зонддорду долбоорлоосу керек, ошондуктан бардык мүмкүн болгон мутацияларды аныктоо мүмкүн эмес жана белгилүү бир жерлерди гана аныктоого болот. Белгилүү бир сайт комплекттин аныктоо диапазонуна кирбесе, чындыгында мутация бар болсо да, комплекттин натыйжасы дагы эле терс болот. Мындан тышкары, сандык ПТРдин сезгичтиги жогору болсо да, жалган позитивдердин бар-жоктугу дагы эле ДНК секвенирлөө технологиясы менен текшерилиши керек, же КРАС мутациясынын абалы менен максаттуу мутациянын эффективдүүлүгүнүн ортосундагы корреляцияны тастыктоо үчүн чоң үлгүдөгү ретроспективдүү жана келечектүү клиникалык эксперименттер. дарылар. Демек, мутацияны аныктоонун жогорку сезгичтигине сокурлук менен умтулууга болбойт, ал эми аныктоонун өзгөчөлүгүнө жана тактыгына көңүл бурбоо керек. Ар кандай лабораториялык шарттарда үлгүлөрдөгү мутацияны аныктоонун оптималдуу ыкмасы да ар кандай болушу мүмкүн. Мутациялардын көбүрөөк үлүшү бар үлгүлөр үчүн Сэнгер секвенирлөө ыкмасы ген мутацияларын аныктоодо жогорку тактыкка ээ, ал эми мутациялардын азыраак үлүшү бар үлгүлөр үчүн Сэнгер секвенирлөө ыкмасы жалган негативдер пайда болушу мүмкүн жана техникалык платформа катары флуоресценттик ПТРди колдонуу менен аныктоо ыкмасы жогорку сезгичтиги менен мүнөздөлөт.
5. HRM ыкмасы:
Бул акыркы жылдары көп колдонулган ген аныктоо ыкмаларынын бири болуп саналат. Бул булганууну болтурбоо үчүн жөнөкөй, тез, сезимтал жана бир түтүктүн артыкчылыктарына ээ. Клиникалык тестирлөөдө аны колдонуунун максатка ылайыктуулугун изилдөө үчүн Лю Лицин жана башкалар HRM ыкмасын колоректалдык рагы менен ооруган 64 бейтапта KRAS ген мутациясын аныктоо үчүн колдонушкан, андан кийин натыйжаларды текшерүү үчүн тике секвенирлөө колдонушкан. HRM жана тике секвенирлөөнүн натыйжалары ырааттуу экени аныкталган. Түз секвенирлөө менен салыштырганда, HRM тарабынан KRAS ген мутацияларын аныктоо жөнөкөй жана так, бул клиникалык тестирлөө үчүн ылайыктуу ишенимдүү ыкма экенин көрсөтүп турат. Чен Жихонг жана башкалар. KRAS мутанттык плазмидаларынын ар кандай пропорцияларын камтыган аралаш үлгүлөрдүн сериясын сыноо үчүн HRM ыкмасы алардын сезгичтигин баалоо үчүн колдонулган. Аралаш үлгүлөрдөгү плазмиддик мутациялардын үлүшү 10%, ал эми сезгичтиги 10%ке жеткени аныкталган. Кийинчерээк, ыкма 60 колоректалдык рак кыртышынын үлгүлөрүндө KRAS ген мутациясын аныктоо үчүн колдонулган. Түз секвенирлөө ыкмасы менен салыштырганда, HRM ыкмасынын сезгичтиги 100%, өзгөчөлүгү 96% (43/45) болгон. HRM методунун кемчилиги – конкреттүү мутациянын түрүн жана кайсы кодон мутацияланганын так берүү мүмкүн эмес. Эгерде эрүү ийри сызыгында аномалия табылса, мутациянын түрүн аныктоо үчүн секвенирлөө ыкмасы керек. Harlé изилдөө тобу флуоресценттик ПТР, ARMS жана HRM ыкмаларын салыштыруу үчүн ичегинин рак кыртышынын 156 учурун колдонушкан. Натыйжалар үч ыкма клиникалык тестирлөө үчүн ылайыктуу болсо да, HRM ишенимдүүлүгү башка эки ыкма сыяктуу жакшы эмес экенин көрсөтүп турат.
6. Башка ыкмалар:
Жогоруда айтылган методдордон тышкары, башка аныктоо ыкмаларынын колдонуудагы өзүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери бар, мисалы, ПЦР-SSCP, жогорку натыйжалуу суюк хроматография, флуоресценттик ПТР оптималдаштырылган олигонуклеотиддик зонд ыкмасы, Уюшкан ПТР жана ARMS айкалышы ыкмасы, COLD-PCR ыкмасы, ж.б. жогорку натыйжалуу суюк хроматография күчтүү өзгөчөлүккө ээ, бирок үлгүлөргө суроо-талап чоң; PCR-SSCP баасы төмөн жана үнөмдүү, бирок операция татаал; Флуоресценттик ПТРге негизделген мутацияны аныктоо технологиясы күчтүү спецификалуулукка, жогорку сезгичтикке жана так сандык , Оңой иштөөгө, толугу менен бөгөттөлгөн реакцияга жана башка артыкчылыктарга ээ, бирок бардыгы белгилүү мутациянын түрүнө ылайык праймерлерди жана зонддорду долбоорлоо керек, ошондуктан белгилүү бир сайттар гана болушу мүмкүн. аныкталган жана бардык мүмкүн болгон мутацияларды аныктоо мүмкүн эмес.
3. Жыйынтык
Кыскача айтканда, ар кандай лабораториялардагы мутация жерлери жана аныктоо ыкмалары бирдей болбогондуктан, анализделген шишик үлгүлөрүнүн өлчөмү жана ДНКны экстракциялоо сапаты да бирдей эмес, натыйжада лабораториялар ортосунда чоң же кичине эксперименттик жыйынтыктар бар айырмачылыктар, стандартташтыруу КРАС ген мутациясын аныктоо ар кайсы өлкөлөрдө тынчсыздандырган клиникалык аныктоо маселеси болуп калды. Учурда КРАС гениндеги мутацияларды аныктоонун көптөгөн ыкмалары бар. Жогоркудан төмөнгө чейин сезгичтик - ARMS, pyrosequencing, HRM, реалдуу убакытта сандык ПТР жана түз секвенирлөө. Клиникалык чындыкка караганда, төмөн сезгичтик клиникалык дарылоо үчүн ыңгайлуу эмес, бирок өтө сезгич ыкмалар аныктоонун өзгөчөлүгүнүн төмөндөшүнө алып келет жана керексиз жалган оң натыйжалар келип, пациенттин кийинки дары режимине таасир этиши мүмкүн. Жогоруда айтылган аспектилерди эске алуу менен, FDA тарабынан бекитилген ыкма менен айкалышып, ARMS ыкмасы сунушталат. Албетте, рыноктук көз караштан алганда, молекулярдык диагностика мага басым жасабашы керек
thhods, бирок акыркы туура натыйжаларга көңүл буруңуз. Ар кандай лабораториялар иш жүзүндөгү кырдаалга ылайык тестирлөөнүн тиешелүү ыкмаларын кабыл алышы мүмкүн, бирок аларда жакшы оператордун квалификациясы жана ички сапатты көзөмөлдөө системалары болгондо гана. Учурдагы ата мекендик лабораториялык экологиялык шарттарда стандартташтырылган ПТР лабораториясында тестирлөө жүргүзүү жана лабораториялык тестирлөөнүн ишенимдүү сапатын камсыз кылуу үчүн ички жана эл аралык сапатты көзөмөлдөө иш-чараларына катышуу зарыл. Стандартташтырылган башкаруу туруктуу натыйжаларды камсыз кылуу үчүн зарыл шарт болуп саналат. Кытайда КРАС генинин клиникалык сыноосун унификациялоо жана стандартташтыруу, ошондой эле ар кандай муктаждыктарга ылайык стандартташтырылган жана стандартташтырылган тестирлөө программасын түзүү зарыл жана бул программаны BRAF, PIK23450_3CA, EGFR жана башка гендер клиникалык молекулярдык патологиялык тестирлөөгө көмөктөшөт.
