Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Тоқ ішек қатерлі ісігіндегі KRAS ген мутациясының оң деңгейі
Колоректальды қатерлі ісік кезінде KRAS генінің мутация жылдамдығы 35% -дан 45% -ға дейін, ал жоғары қауіпті мутация орны 12 экзонында 13 және 2 кодоны болып табылады, ал 61 және 146 сияқты сирек кездеседі. сайт. KRAS гендік мутациясын анықтаудың көптеген әдістері бар, соның ішінде тікелей секвенирлеу, жоғары ажыратымдылықты балқу қисығын талдау (HRM), пиросеквенция, сандық ПТР, мутацияны күшейту блогы жүйесі (амплинк атио) нрефракторимутация жүйесі (ARMS), шектеу фрагментінің ұзындығы полиморфизм (RFLP), полимеразды тізбекті реакция-бір тізбекті конформациялық полиморфизмді талдау (ПТР-синглестродтық конфомация полиморфизмі (ПТР-SSCP), денатурацияның төменгі температурасындағы ПТР (COLD-PCR) температурасында ко-күшейту және жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясын талдау және т.б.
2. KRAS мутациясын анықтау әдістерін бағалау
1. Тікелей секвенирлеу әдісі: бұл KRAS гендік мутациясын анықтауға арналған ең классикалық әдіс, сонымен қатар гендік мутацияны анықтауға арналған алтын стандарт. Дидексиялық тізбектеу принципіне негізделген тікелей секвенирлеу әдісі гендік реттіліктің өзгеруін интуитивті түрде базалық шың картасы түрінде көрсете алады. Анықтау түрі неғұрлым жан-жақты және ол мутацияны анықтаудың алғашқы әдісі болып табылады. Жаңа буынның секвенирлеу платформаларының пайда болуына қарамастан, отандық және шетел ғалымдары тікелей секвенирлеу нәтижелерін өлшеу және жаңа әдістің сенімділігін анықтау шкаласы ретінде қолданады. Гао Цзин және басқалар. Колоректальды қатерлі ісікпен ауыратын 966 науқастың KRAS және BRAF гендік мутациясын анықтауға бағытталған тікелей секвенирлеу қолданылды. Бұл сондай-ақ әдебиетте келтірілген ең үлкен отандық үлгісі бар KRAS ген мутациясын талдау. Линг Юн және басқалар тікелей секвенирлеу әдісі - бұл мутацияның түрін нақтылауға болатын, әсіресе, белгісіз мутацияны анықтауға болатын, әрбір геннің мутациялық күйін түсіну үшін ең тура және тиімді анықтау әдісі деп санайды. Бұл әдістің сезімталдығы салыстырмалы түрде төмен болғанымен, оны ісік жасушаларын байыту үшін микродиссекция сияқты әдістермен жақсартуға болады. Тікелей тізбектеу әдісі басқа отандық зерттеу топтарында KRAS үлгінің үлкен мөлшерін анықтауға да қолданылды. Алайда, сезімталдықтың төмендеуі тікелей тізбектелудің ең үлкен кемшілігі болып табылады. Қытайда келтірілген нәтижелерге қарағанда, мутацияны тікелей секвенирлеу арқылы анықтау деңгейі төмен емес. Лю Сяоцзин және басқалар. Тікелей секвенирлеу мен пептидті нуклеин қышқылының қысқышы ПТР (ПНА-ПТР) салыстырып, KRAS генінің мутациясының 43 жағдайы тікелей секвенирлеу арқылы анықталғанын анықтады. Осы мутациялардан басқа PNA-PCR де тікелей секвенирлеу арқылы анықталды. Жабайы типтегі он мутация табылды және жабайы типтегі пациенттерді ПТР және мутантты пациенттерді анықтау үшін тікелей секвенирлеу әдісі бойынша анықтау бойынша ұсыныстар жасалды. Цю Тянь және басқалар. Флуоресцентті ПТР-оңтайландырылған олигонуклеотидті зонд әдісі және тікелей секвенирлеу әдісі бойынша колоректальды қатерлі ісіктің 131 үлгісі анықталды және KRAS ген мутациясының оң қарқыны 41.2% (54/131) және 40.5% (53/131) болды). Бай Донгю сонымен қатар әртүрлі әдістерді анықтау сезімталдығын талқылады. Тік ішек қатерлі ісігінің 200 науқасының 63-і RT-qPCR мутациясымен анықталды, ал мутацияны анықтау деңгейі 31.5% құрады; 169 үлгі сәтті реттелді, мутацияның 50 жағдайы, мутацияның анықталу деңгейі 29.6%. Тікелей тізбектеу әдісі KRAS генінің мутациялық күйін дәл, объективті және нақты түрде анықтай алғанымен, оның жоғары техникалық талаптары, күрделі жұмыс процедуралары, ластануды жеңілдетуі және нәтижелерді ұзақ және еңбекті түсіндіру сияқты кемшіліктері де өте маңызды айқын. Көбіне секвенирлеу жабдықтары болмайды, ал үлгіні сынау үшін тиісті компанияға жіберу керек, бұл ұзақ уақытты алады және қымбатқа түседі, сондықтан ол үлкен шектеулерге ие.
Пиросеквенция әдісі:
Пиросеквенция әдісі де KRAS генінің мутациясын анықтау үшін реттілік сезімталдығы, анықтау құны және есеп беру уақыты тұрғысынан ыңғайлы әдіс болып табылады. Бұл әдістің қайталануы жақсырақ. Алынған шың картасына сәйкес белгілі бір учаскенің мутациялық жиілігін сандық зерттеу және әр түрлі учаскелердің мутациялық жиіліктерін салыстыру бір қарағанда айқын көрінеді. Соңғы жылдары Огино және басқалар, Хатчинс және т.б. Колоректальды қатерлі ісіктің үлкен үлгілері бар науқастарда KRAS мутациясын сынау үшін пиросеквенция технологиясын қолданыңыз. Нәтижелер пиросеквенция технологиясы пациенттерді мақсатты терапияға скринингтеудің қуатты құралы екенін көрсетеді. Ісік молекулалық диагностикасының қолдану мүмкіндігі кең. Сондай-ақ, отандық ғалымдар колоректалды қатерлі ісіктердегі KRAS мутациясын клиникалық тұрғыдан анықтау үшін пиросеквенция технологиясын жақсы дәлдікпен және сенімділікпен қолданды. Бұл әдіс жақсы спецификаға және жоғары сезімталдыққа ие. SundstrÖm және басқалар. Клиникалық қосымшалардағы аллельді спецификалық ПТР мен пиросеквенцияны салыстыра отырып, KRAS мутациясының 314 жағдайында колоректальды қатерлі ісік ауруында пиросеквенцияның аллельдікінен жоғары екендігі анықталды. ПТР, және ісік жасушаларының құрамы төмен тіндерге жақсы сезімталдыққа ие. Ісік жасушаларының үлесін 1.25% -дан 2.5% -ға дейін сұйылтыңыз. Пиросеквенция әлі де мутация сигналдарын анықтай алады. Таңдаушыдағы мутантты аллельдердің ең аз мөлшері 20% -ке жетіп, Сангер тізбегі арқылы анықталуы керек болса, оны HRM әдісімен 10% -ке жеткенде анықтауға болады, ал пиросеквенция үшін тек мутацияны 5% -да анықтауға болады. Аллельдер. Біз колоректальды қатерлі ісікпен ауыратын 717 науқастың KRAS мутациясын анықтау үшін пиросеквенцияны қолдандық және KRAS мутациясының жиілігі 40.9% -ды құрады. 12 кодонының мутация жылдамдығы 30.1%, 13 кодонның мутация жылдамдығы 9.8%, 61 кодонның мутация жылдамдығы 1.0% құрады. Біз тіндерді тестілеу алдында қолмен микродиссекциялау арқылы ісіктің жоғары құрамымен байыттық, нәтижесі сенімді болды. Әдістің сезімталдығы мен ерекшелігі жақсы, клиникалық тәжірибеде оны дамыту оңай. Пиросеквенцияның жетіспеушілігі - анықтаудың жоғары құны, ал бір тізбекті ДНҚ-ны үлгілерді секвенирлеу үшін дайындау процесі ауыр. Болашақта пиросеквенцияны екі жіпті ПТР өнімін тікелей анықтау технологиясын жасауға бағыттай беруге болады, бұл жұмысты едәуір жеңілдетеді. Клиникалық тестілеудің жан-жақты алға жылжуына қол жеткізу үшін секвенирлеу құнын тиімді төмендетіңіз.
3. ARMS әдісі:
Бұл технологияда жабайы типті және мутантты гендерді, wh
ich туралы 1980 жылдары-ақ хабарланған. Бұл әдістің ең үлкен артықшылығы - оның сезімталдығы 1.0% -ке дейін және сынамалардағы мутантты гендерді 1.0% -ке дейін анықтай алады. Дизайн кезінде мақсатты өнімнің ұзындығын барынша қысқартуға болады және парафинге салынған ұлпа үлгісінен алынған ДНҚ-ның көп бөлігі фрагменттелгендіктен, дәл анықтау нәтижелеріне қол жеткізу мүмкін емес. Бұл технология күшейту кезінде жабық түтікпен жұмыс істеуге қол жеткізу үшін нақты уақыттағы ПТР платформасын біріктіреді. Операция қарапайым және өнімнің кейінгі өңделуін қажет етпейді, бұл күшейтілген өнімнің ластануынан барынша сақтануы мүмкін. Қазіргі кезде әлемде скорпион-зонд пен күшейту блогының мутация жүйесін біріктіретін скорпион-ARMS әдісі жиі қолданылады. Екі технологияның үйлесуі екі жақтың да сезімталдығы мен ерекшелігін барынша арттыра алады. Гао Цзе және басқалар. Бұл әдісті колоректальды қатерлі ісікпен ауыратын 167 пациенттің KRAS генінің мутациялық жағдайын анықтау үшін қолданды, бұл әдіс сенімді әрі дәл екенін көрсетті. Ван Хуй және басқалар. Формальдегидпен бекітілген және парафинді тіндердің 151 жағдайындағы KRAS мутациясын анықтау үшін ARMS қолданылады. Америка Құрама Штаттарында KRAS клиникалық тестілеу үшін FDA мақұлдаған COBAS жиынтығы (Roche) және Еуропалық Одақ In Vitro Diagnostics (CE-IVD) сертификаттаған Therascreen RGQ жиынтығы (Qiagen) барлығы ARMS принципін қолданады. Жалпы әдістердің ішінде ARMS әдісі ең сезімтал және құны салыстырмалы түрде қолайлы. Сондықтан, KRAS гендерін клиникалық анықтаудың көп бөлігі үйде және шетелде ARMS әдісін қолданады, бірақ әдіс ПТР технологиясына негізделгендіктен, оның жетіспеушілігі - оны тек белгілі сайт мутациясын анықтауға болады.
4. Нақты уақыттағы люминесценттік сандық ПТР әдісі:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. HRM әдісі:
Бұл соңғы жылдары жиі қолданылатын гендерді анықтау әдістерінің бірі. Оның ластануын болдырмау үшін қарапайым, жылдам, сезімтал және жалғыз түтікшенің артықшылықтары бар. Клиникалық тестілеуде қолданудың орындылығын зерттеу үшін Лю Лицин және басқалары HRM әдісін қолданып, тік ішектің қатерлі ісігі бар 64 науқастың KRAS гендік мутациясын анықтады, содан кейін нәтижелерді тексеру үшін тікелей секвенирлеуді қолданды. HRM және тікелей секвенция нәтижелері сәйкес келеді. Тікелей секвенирлеумен салыстырғанда, KRAS ген мутациясын HRM арқылы анықтау қарапайым және дәл, бұл клиникалық тексеруге жарамды сенімді әдіс екендігін көрсетеді. Чен Чжихун және басқалар. HRM әдісі олардың сезімталдығын бағалау үшін KRAS мутантты плазмидаларының әр түрлі пропорцияларынан тұратын аралас үлгілер сериясын тексеру үшін қолданылды. Аралас үлгілердегі плазмида мутацияларының үлесі 10%, ал сезімталдығы 10% жететіні анықталды. Кейіннен бұл әдіс колоректалды қатерлі ісік тіндерінің 60 үлгісіндегі KRAS ген мутациясын анықтау үшін қолданылды. Тікелей тізбектеу әдісімен салыстырғанда HRM әдісінің сезімталдығы 100%, ал ерекшелігі 96% құрады (43/45). HRM әдісінің жетіспеушілігі - нақты мутация түрін дәл беру мүмкін емес және қандай кодон мутацияланған. Егер балқу қисық сызығынан ауытқушылық табылса, мутация түрін анықтау үшін реттілік әдісі қажет. Harlé зерттеу тобы флуоресцентті ПТР, ARMS және HRM әдістерін салыстыру үшін колоректалды қатерлі ісік тінінің 156 жағдайын қолданды. Нәтижелер көрсеткендей, үш әдіс клиникалық тестілеуге қолайлы болғанымен, HRM сенімділігі басқа екі әдіс сияқты жақсы емес.
6. Басқа әдістер:
Жоғарыда аталған әдістерден басқа, анықтаудың басқа әдістерінің өзіндік артықшылықтары мен кемшіліктері бар, мысалы, ПТР-SSCP, жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясы, флуоресцентті ПТР-оңтайландырылған олигонуклеотидті зонд әдісі, Кірістірілген ПТР және АРМ үйлесімі әдісі, COLD-PCR әдісі және т.с.с. Жоғары өнімді сұйық хроматографияның ерекшелігі күшті, бірақ сынамаларға сұраныс үлкен; ПТР-SSCP арзан және үнемді, бірақ операция күрделі; люминесцентті ПТР негізіндегі мутацияны анықтау технологиясы күшті спецификацияға, жоғары сезімталдыққа және дәл сандыққа ие, оңай жұмыс істейді, реакцияны толығымен жауып тастайды және басқа да артықшылықтарға ие, бірақ барлығына белгілі мутациялар типіне сәйкес праймерлер мен зондтарды жобалау қажет, сондықтан тек нақты сайттар болуы мүмкін анықталды, және барлық мүмкін мутацияны анықтау мүмкін емес.
3. қысқаша мазмұндама
Қорыта айтқанда, әртүрлі зертханалардағы мутация орындары мен анықтау әдістері біркелкі болмағандықтан, талданған ісік үлгілерінің мөлшері мен ДНҚ экстракциясының сапасы да біркелкі емес, нәтижесінде зертханалар арасында үлкен немесе кіші эксперимент нәтижелері болады Айырмашылықтар, стандарттау KRAS генінің мутациясын анықтау әртүрлі елдерде клиникалық анықтау мәселесіне айналды. Қазіргі уақытта KRAS генінің мутациясын анықтайтын көптеген әдістер бар. Жоғарыдан төменге сезімталдық ARMS, пиросеквенция, HRM, нақты уақыттағы сандық ПТР және тікелей секвенция болып табылады. Клиникалық шындыққа сәйкес, төмен сезімталдық клиникалық емдеуге қолайлы емес, бірақ тым сезімтал әдістер анықтау ерекшелігінің төмендеуіне әкеледі, ал қажетсіз жалған оң нәтижелер пайда болуы мүмкін және пациенттің келесі дәрі-дәрмек режиміне әсер етеді. Жоғарыда аталған аспектілерді ескере отырып, FDA мақұлдаған әдіспен біріктіріп, ARMS әдісі ұсынылады. Әрине, нарықтық тұрғыдан алғанда, молекулалық диагностика мені баса назар аудармауы керек
әдістері, бірақ соңғы дұрыс нәтижелерге назар аударыңыз. Әртүрлі зертханалар нақты жағдайға сәйкес тиісті сынақ әдістерін қолдана алады, бірақ оларда жақсы оператор біліктілігі және ішкі сапаны бақылау жүйелері болған жағдайда ғана. Ағымдағы отандық зертханалық қоршаған орта жағдайында стандартталған ПТР зертханасында сынақ жүргізу және сенімді зертханалық сынақ сапасын қамтамасыз ету үшін отандық және халықаралық сапаны бақылау іс-шараларына қатысу қажет. Стандартталған басқару тұрақты нәтижелерді қамтамасыз етудің қажетті шарты болып табылады. Қытайда KRAS генінің клиникалық сынауын біріздендіру және стандарттау, сондай-ақ әртүрлі қажеттіліктерге сәйкес стандартталған және стандартталған тестілеу бағдарламасын құру шұғыл қажеттілік бар және бұл бағдарламаны BRAF, PIK23450_3CA, EGFR және анықтауға кеңейтуге болады. клиникалық молекулалық патологияны сынауға көмектесетін басқа гендер.
