Lijekovi za ciljanje kao što su cetuksimab i panitumumab naširoko su korišteni u klinici kao učinkoviti terapijski lijekovi za kolorektalni karcinom. Klinički podaci pokazuju da pacijenti s KRAS mutacijama nemaju značajan učinak na ovaj lijek s monoklonskim protutijelima i da samo pacijenti divljeg tipa mogu imati koristi od njega. Stoga se status mutacije gena KRAS klinički smatra važnim terapijskim markerom, koji ima jaku korelaciju s prognozom i učinkom liječenja kolorektalnog karcinoma. Smjernice kliničke prakse za kolorektalni rak Nacionalne sveobuhvatne mreže za rak (NCCN) iz 2009. propisuju da svi pacijenti s metastatskim kolorektalnim rakom moraju otkriti status mutacije gena KRAS, a samo divlji tip KRAS preporučuje se za primanje ciljane terapije EGFR-om. Iste je godine i Američko društvo za kliničku onkologiju (ASCO) izdalo iste preporuke za kliničko liječenje kao molekularni marker za ciljanu terapiju tumora, što pokazuje njegovo važno usmjeravajuće značenje. Trenutno se genetsko testiranje KRAS-a široko provodi klinički. Uglavnom procjenjujemo domaće metode otkrivanja mutacije gena KRAS za referencu u kliničkom odabiru.
1. Pozitivna stopa mutacije gena KRAS u kolorektalnom karcinomu
U kolorektalnom karcinomu stopa mutacije gena KRAS iznosi čak 35% do 45%, a visokorizično mjesto mutacije su kodoni 12 i 13 na egzonu 2, a još uvijek postoje rijetki poput 61 i 146. Mutacija mjestu. Postoje mnoge metode detekcije za mutacije gena KRAS, uključujući izravno sekvenciranje, analizu krivulje taljenja visoke rezolucije (HRM), pirosekvencioniranje, kvantitativni PCR, sustav bloka za amplifikaciju mutacije (amplinc atio) nrefraktornu mutacijski sustav (ARMS), polimorfizam duljine restrikcijskih fragmenata (RFLP), polimerazna lančana reakcija-jednolančana konformacijska analiza polimorfizma (PCR-jednolančani konfomacijski polimorfizam (PCR-SSCP), ko-amplifikacija pri nižoj temperaturi denaturacijske PCR (COLD-PCR) i analiza tekućinske kromatografije visokih performansi itd.
2. Procjena metoda otkrivanja mutacije KRAS
1. Metoda izravnog sekvenciranja: To je najklasičnija metoda za otkrivanje mutacija gena KRAS, a također je i zlatni standard za otkrivanje mutacija gena. Metoda izravnog sekvenciranja koja se temelji na principu dideoksi sekvenciranja može najintuitivnije pokazati promjenu genske sekvence u obliku mape vršnih baza. Vrsta otkrivanja opsežnija je, a ujedno je i najranija primijenjena metoda otkrivanja mutacija. Unatoč pojavi novih generacijskih platformi za sekvenciranje, znanstvenici u zemlji i inozemstvu i dalje koriste rezultate izravnog sekvenciranja kao ljestvicu za mjerenje i određivanje pouzdanosti nove metode. Gao Jing i sur. Primijenjeno izravno sekvenciranje za otkrivanje mutacija gena KRAS i BRAF u 966 pacijenata s kolorektalnim karcinomom. Ovo je također analiza mutacije gena KRAS s najvećim domaćim uzorkom prijavljenim u literaturi. Ling Yun i drugi vjeruju da je metoda izravnog sekvenciranja najizravnija i najučinkovitija metoda otkrivanja za razumijevanje statusa mutacije svakog gena, koja može pojasniti vrstu mutacije, posebno za otkrivanje nepoznatih mutacija. Iako je osjetljivost ove metode relativno niska, može se poboljšati metodama poput mikrodisekcije za obogaćivanje tumorskih stanica. Metoda izravnog sekvenciranja primijenjena je i na KRAS otkrivanje većih veličina uzoraka u drugim domaćim istraživačkim skupinama. Međutim, niža osjetljivost najveći je nedostatak izravnog sekvenciranja. Sudeći prema rezultatima objavljenim u Kini, stopa detekcije mutacija izravnim sekvenciranjem nije niska. Liu Xiaojing i sur. Usporedili smo izravno sekvenciranje i PCR stezaljku peptidne nukleinske kiseline (PNA-PCR) i otkrili da su 43 slučaja mutacija gena KRAS otkrivena izravnim sekvenciranjem. Osim ovih mutacija, PNA-PCR je također otkriven izravnim sekvenciranjem. Deset mutacija pronađeno je u divljem tipu, a dani su prijedlozi za određivanje pacijenata divljeg tipa PCR -om i metodom izravnog sekvenciranja za određivanje mutiranih pacijenata. Qiu Tian i sur. Otkriven je 131 uzorak kolorektalnog karcinoma metodom oligonukleotidne sonde optimizirane PCR-om optimizirane metode metode izravnog sekvenciranja, a pozitivne stope mutacija gena KRAS bile su 41.2% (54/131) i 40.5% (53/131)). Bai Dongyu je također raspravljao o osjetljivosti otkrivanja različitih metoda. Od 200 pacijenata s kolorektalnim karcinomom, 63 su otkrivena pomoću RT-qPCR mutacija, a stopa detekcije mutacija bila je 31.5%; 169 uzoraka uspješno je sekvencirano izravnim sekvenciranjem 50 slučajeva mutacije, stopa detekcije mutacije 29.6%. Iako metoda izravnog sekvenciranja može točno, objektivno i specifično otkriti status mutacije gena KRAS, njezini nedostaci, kao što su visoki tehnički zahtjevi, složeni postupci rada, lako uzrokovati unakrsnu kontaminaciju te dugotrajno i mukotrpno tumačenje rezultata, također su vrlo očito. Često nema opreme za sekvenciranje, a uzorak je potrebno poslati u odgovarajuću tvrtku na ispitivanje, koje traje dugo i ima visoku cijenu, pa ima velika ograničenja.
Metoda pirosekvenciranja:
Metoda pirosekvenciranja također je prikladnija metoda za detekciju mutacije gena KRAS u smislu osjetljivosti sekvenciranja, cijene detekcije i vremena za izvještavanje. Ponovljivost ove metode je bolja. Prema dobivenoj karti vrhova Kvantitativna studija učestalosti mutacija određenog mjesta i usporedba između frekvencija mutacija različitih mjesta jasna su na prvi pogled. Posljednjih godina Ogino i sur., Hutchins i sur. Koristili su tehnologiju pirosekvenciranja za testiranje KRAS mutacija u pacijenata s velikim uzorcima kolorektalnog karcinoma. Rezultati ukazuju na to da je tehnologija pirosekvenciranja moćan alat za pregled pacijenata radi ciljane terapije. Molekularna dijagnoza tumora ima široke izglede za primjenu. Domaći znanstvenici također su koristili tehnologiju pirosekvenciranja za kliničku detekciju KRAS mutacija u kolorektalnom karcinomu, s dobrom točnošću i pouzdanošću. Ova metoda ima bolju specifičnost i veću osjetljivost. SundstrÖm i sur. Usporedili su alel-specifični PCR i pirosekvencioniranje u kliničkim primjenama i otkrili da je u 314 slučajeva KRAS mutacija u pacijenata s kolorektalnim karcinomom, specifičnost pirosekvenciranja bila superiornija od alela. PCR i ima dobru osjetljivost na tkiva s niskim sadržajem tumorskih stanica. Razrijedite udio tumorskih stanica na 1.25% do 2.5%. Pirosekvencija i dalje može detektirati signale mutacije. Kada minimalni sadržaj mutiranih alela u uzorku mora doseći 20%da bi se otkrio Sangerovim sekvenciranjem, može se otkriti HRM metodom kad dosegne 10%, a za pirosekvenciranje samo mutacije se mogu otkriti za 5%. Alele. Koristili smo pirosekvencioniranje za otkrivanje KRAS mutacija kod 717 pacijenata s kolorektalnim karcinomom i otkrili smo da je učestalost KRAS mutacija 40.9%. Stopa mutacije kodona 12 bila je 30.1%, stopa mutacije kodona 13 9.8%, a stopa mutacije kodona 61 1.0%. Obogatili smo tkiva s većim sadržajem tumora ručnom mikrodisekcijom prije testiranja, čineći rezultate pouzdanijim. Metoda ima dobru osjetljivost i specifičnost te se lako razvija u kliničkoj praksi. Nedostatak pirosekvenciranja je visoka cijena detekcije, a postupak pripreme jednolančane DNA za sekvenciranje uzoraka je glomazan. U budućnosti se pirosekvenciranje može posvetiti razvoju tehnologije za izravno otkrivanje dvolančanih PCR proizvoda, što će uvelike pojednostaviti rad. I učinkovito smanjiti troškove sekvenciranja kako bi se postigla sveobuhvatna promocija kliničkog ispitivanja.
3. ARMS metoda:
Ova tehnologija koristi početnice za razlikovanje gena divljeg tipa i mutiranih, wh
ich je prijavljeno već 1980 -ih. Najveća prednost ove metode je ta što ima osjetljivost do 1.0% i može otkriti mutirane gene u uzorcima do 1.0%. U dizajnu se duljina ciljnog proizvoda može u najvećoj mjeri skratiti, a problem je što se ne mogu dobiti točni rezultati detekcije jer je većina DNK ekstrahirana iz uzorka tkiva ugrađenog u parafin fragmentirana. Ova tehnologija kombinira PCR platformu u stvarnom vremenu za postizanje rada zatvorenih cijevi tijekom pojačanja. Operacija je jednostavna i ne zahtijeva naknadnu obradu proizvoda, čime se u najvećoj mjeri može izbjeći onečišćenje pojačanog proizvoda. Trenutno se u svijetu češće koristi metoda scorpion-ARMS koja kombinira scorpion sondu i sustav mutacije bloka amplifikacije. Kombinacija dviju tehnologija može povećati osjetljivost i specifičnost obje strane. Gao Jie i sur. Koristila je ovu metodu za otkrivanje statusa mutacije gena KRAS u 167 pacijenata s kolorektalnim karcinomom, što ukazuje na to da je ova metoda pouzdana i točna. Wang Hui i sur. Također se koristi ARMS za otkrivanje KRAS mutacija u 151 slučaju tkiva fiksiranih formaldehidom i parafinom. U Sjedinjenim Državama kompleti COBAS (Roche) odobreni od strane FDA-e za klinička ispitivanja KRAS-a i Therascreen RGQ komplet (Qiagen) certificirani od strane Europske unije in vitro dijagnostikom (CE-IVD) koriste ARMS princip. Među uobičajenim metodama, metoda ARMS je najosjetljivija, a cijena je relativno razumna. Stoga velik dio kliničkog otkrivanja KRAS gena u zemlji i inozemstvu koristi ARMS metodu, no budući da se metoda temelji na PCR tehnologiji, njezin je nedostatak to što se mogu otkriti samo poznate mutacije na mjestu.
4. Kvantitativna PCR metoda fluorescencije u stvarnom vremenu:
To je detekcijska metoda temeljena na PCR-u za određivanje mutacije prema vrijednosti Ct. Ima prednosti jake specifičnosti, visoke osjetljivosti, točne kvantifikacije, jednostavnog rada i potpuno zatvorene reakcije. Mnoge eksperimentalne skupine usvojile su ovu metodu za detekciju KRAS mutacija u kolorektalnom karcinomu. U usporedbi s metodom izravnog sekvenciranja, kvantitativni PCR ima veću prednost u osjetljivosti. Većina znanstvenika koji uspoređuju ove dvije metode vjeruje da je kvantitativni PCR osjetljiviji. Liu Wei i sur. Koristio sam dvije metode za detaljnu analizu rezultata detekcije 280 slučajeva mutacija gena KRAS kolorektalnog karcinoma, 94 slučaja mutacija sekvenciranja gena KRAS, pozitivna stopa bila je 33.57% (94/280), od čega je kvantitativna fluorescencija u stvarnom vremenu PCR je bio pozitivan 91 slučaj imao je osjetljivost od 96.8% (91/94). Od 186 slučajeva divljeg tipa sekvenciranja gena, 184 su bila negativna kvantitativnom PCR-om u stvarnom vremenu, sa specifičnošću od 98.9% (184/186). Stopa podudarnosti između metode kvantitativne PCR fluorescencije u stvarnom vremenu i metode izravnog sekvencioniranja gena bila je 98.2%. U dvije metode detekcije, pozitivne i negativne stope podudarnosti svakog mjesta mutacije bile su iznad 90%, a stopa podudarnosti četiri mjesta dosegla je 100%. Rezultati otkrivanja dviju metoda bili su vrlo dosljedni, što ukazuje na fluorescentni kvantitativni PCR. To je pouzdanija metoda za otkrivanje mutacija. Međutim, metode temeljene na PCR-u trebaju oblikovati početnice i sonde na temelju poznatih tipova mutacija, tako da se ne mogu detektirati sve moguće mutacije, a mogu se detektirati samo određena mjesta. Ako određeno mjesto nije uključeno u raspon detekcije kompleta, čak i ako stvarno postoji mutacija, rezultat kompleta je i dalje negativan. Osim toga, iako je osjetljivost kvantitativnog PCR-a visoka, postoje li lažno pozitivni rezultati i dalje se moraju provjeriti tehnologijom sekvenciranja DNA ili retrospektivnim i prospektivnim kliničkim eksperimentima s velikim veličinama uzoraka kako bi se potvrdila korelacija između statusa mutacije KRAS-a i učinkovitosti ciljanih lijekovi . Stoga se visokoj osjetljivosti detekcije mutacije ne treba slijepo baviti, dok specifičnost i točnost detekcije treba zanemariti. U različitim laboratorijskim uvjetima, optimalna metoda za otkrivanje mutacija u uzorcima također može biti različita. Za uzorke s većim udjelom mutacija, Sangerova metoda sekvenciranja ima veću točnost u otkrivanju genskih mutacija, dok za uzorke s nižim udjelom mutacija, Sangerova metoda sekvenciranja može doći do lažno negativnih rezultata, a metoda detekcije koja koristi fluorescentni PCR kao tehničku platformu može se karakterizirati visokom osjetljivošću.
5. HRM metoda:
To je jedna od najčešće korištenih metoda otkrivanja gena posljednjih godina. Ima prednosti jednostavne, brze, osjetljive i jednostruke cijevi kako bi se izbjeglo zagađenje. Kako bi istražili izvedivost njegove uporabe u kliničkim ispitivanjima, Liu Liqin i drugi koristili su HRM metodu za otkrivanje mutacija gena KRAS u 64 bolesnika s kolorektalnim karcinomom, a zatim su koristili izravno sekvenciranje za provjeru rezultata. Utvrđeno je da su rezultati HRM -a i izravnog sekvenciranja dosljedni. U usporedbi s izravnim sekvenciranjem, otkrivanje mutacija gena KRAS pomoću HRM -a jednostavno je i točno, što upućuje na to da je to pouzdana metoda pogodna za klinička ispitivanja. Chen Zhihong i sur. Pomoću HRM metode testirao je niz miješanih uzoraka koji sadrže različite omjere KRAS mutiranih plazmida za procjenu njihove osjetljivosti. Utvrđeno je da je udio mutacija plazmida u miješanim uzorcima bio 10%, a osjetljivost dosegla 10%. Nakon toga, metoda je korištena za otkrivanje mutacija gena KRAS u 60 uzoraka tkiva kolorektalnog karcinoma. U usporedbi s metodom izravnog sekvenciranja, osjetljivost HRM metode bila je 100%, a specifičnost 96% (43/45). Nedostatak HRM metode je što je nemoguće točno dati specifičan tip mutacije i koji je kodon mutiran. Ako se na krivulji taljenja pronađe abnormalnost, potrebna je metoda sekvenciranja kako bi se odredio tip mutacije. Istraživačka skupina Harlé koristila je 156 slučajeva tkiva kolorektalnog karcinoma za usporedbu fluorescentnih PCR, ARMS i HRM metoda. Rezultati sugeriraju da, iako su tri metode prikladne za kliničko ispitivanje, pouzdanost HRM -a nije toliko dobra kao ostale dvije metode.
6. Ostale metode:
Osim gore navedenih metoda, druge metode detekcije imaju svoje prednosti i nedostatke u primjeni, kao što su PCR-SSCP, tekućinska kromatografija visokih performansi, metoda sonde oligonukleotidne sonde optimizirane za PCR, metoda ugniježđene kombinacije PCR i ARMS, COLD-PCR metoda itd. Tekuća kromatografija visokih performansi ima jaku specifičnost, ali je potražnja za uzorcima velika; PCR-SSCP je jeftin i ekonomičan, ali je rad kompliciran; tehnologija otkrivanja mutacija temeljena na fluorescentnom PCR -u ima snažnu specifičnost, visoku osjetljivost i točnu kvantitativnost, jednostavan rad, potpuno blokiranu reakciju i druge prednosti, ali svi moraju dizajnirati temeljne premaze i sonde u skladu s poznatim tipom mutacije, tako da se mogu odrediti samo određena mjesta otkrivene, a sve moguće mutacije ne mogu se otkriti.
3. Sažetak
Ukratko, budući da mjesta mutacije i metode detekcije u različitim laboratorijima nisu ujednačene, veličina analiziranih uzoraka tumora i kvaliteta ekstrakcije DNA također su neujednačeni, što rezultira postojanjem velikih ili malih eksperimentalnih rezultata među laboratorijima. Razlike, standardizacija detekcije mutacije gena KRAS postalo je pitanje kliničkog otkrivanja koje zabrinjava u različitim zemljama. Trenutno postoji mnogo metoda za otkrivanje mutacija gena KRAS. Osjetljivost od visoke do niske je ARMS, pirosekvencioniranje, HRM, kvantitativna PCR u stvarnom vremenu i izravno sekvenciranje. Iz kliničke stvarnosti, niska osjetljivost ne pogoduje kliničkom liječenju, ali previše osjetljive metode će uzrokovati smanjenje specifičnosti otkrivanja, a mogu se pojaviti i nepotrebni lažno pozitivni rezultati koji će utjecati na pacijentovu kasniju terapiju. S obzirom na gore navedene aspekte, u kombinaciji s metodom koju je odobrila FDA, preporučuje se ARMS metoda. Naravno, s tržišne perspektive, molekularna dijagnostika me ne bi trebala naglašavati
metode, ali se usredotočite na konačne točne rezultate. Različiti laboratoriji mogu usvojiti odgovarajuće metode ispitivanja u skladu sa stvarnom situacijom, ali samo ako imaju dobre kvalifikacije operatera i interne sustave kontrole kvalitete. U trenutnim uvjetima okoline domaćeg laboratorija, potrebno je provoditi testiranje u standardiziranom PCR laboratoriju i sudjelovati u domaćim i međunarodnim aktivnostima kontrole kvalitete unutar prostorija kako bi se osigurala pouzdana kvaliteta laboratorijskog testiranja. Standardizirano upravljanje nužan je uvjet za osiguranje stalnih rezultata. U Kini postoji hitna potreba za objedinjavanjem i standardizacijom kliničkog testiranja gena KRAS te za stvaranjem standardiziranog i standardiziranog programa testiranja prema različitim potrebama, a ovaj se program može proširiti na detekciju BRAF, PIK23450_3CA, EGFR i drugi geni za promicanje ispitivanja kliničke molekularne patologije.
