Ciljna zdravila, kot sta cetuksimab in panitumumab, se pogosto uporabljajo v kliniki kot učinkovita terapevtska zdravila za kolorektalni rak. Klinični podatki kažejo, da bolniki z mutacijami KRAS nimajo pomembnega učinka na to zdravilo z monoklonskimi protitelesi in da lahko koristi le bolnikom z divjim tipom. Zato se status mutacije gena KRAS klinično obravnava kot pomemben terapevtski marker, ki ima močno korelacijo z prognozo in učinkom zdravljenja kolorektalnega raka. Smernice za klinično prakso raka debelega črevesa in danke iz leta 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) določajo, da morajo vsi bolniki z metastatskim rakom debelega črevesa in danke odkriti status genske mutacije KRAS, pri čemer se za ciljno zdravljenje z EGFR priporoča samo divji tip KRAS. Istega leta je tudi Ameriško združenje za klinično onkologijo (ASCO) izdalo enaka priporočila za klinično zdravljenje kot molekularni marker za tumorsko ciljno zdravljenje, kar kaže na njegov pomemben usmerjevalni pomen. Trenutno se genetsko testiranje KRAS široko izvaja klinično. V glavnem ocenjujemo domače metode za odkrivanje genskih mutacij KRAS za referenco pri klinični selekciji.
1. Pozitivna stopnja mutacije gena KRAS pri kolorektalnem raku
Pri kolorektalnem raku je stopnja mutacije gena KRAS od 35% do 45%, visoko tvegano mesto mutacije pa je kodon 12 in 13 na eksonu 2, še vedno pa obstajajo redki, kot sta 61 in 146. Mutacija spletnem mestu. Obstaja veliko metod odkrivanja mutacij genov KRAS, vključno z neposrednim zaporedjem, analizo krivulje taljenja z visoko ločljivostjo (HRM), pirosekvenciranjem, kvantitativnim PCR, sistemom ojačevalnih blokov mutacij (amplinc atio) sistemom nrefractorymutation (ARMS), polimorfizmom dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP), analiza verižne reakcije polimeraze - enojna verižna konformacija polimorfizma (PCR - enojna veriga polimorfizma (PCR-SSCP), ko-amplifikacija pri nižji temperaturi denaturacije PCR (COLD-PCR) in analiza tekoče kromatografije z visoko zmogljivostjo itd.
2. Vrednotenje metod odkrivanja mutacij KRAS
1. Metoda neposrednega zaporedja: je najbolj klasična metoda za odkrivanje genskih mutacij KRAS in je tudi zlati standard za odkrivanje genskih mutacij. Metoda neposrednega zaporedja, ki temelji na principu dideoksi zaporedja, lahko najbolj intuitivno prikaže spremembo genskega zaporedja v obliki osnovne mape vrha. Vrsta odkrivanja je celovitejša in je tudi najzgodnejša uporabljena metoda zaznavanja mutacij. Kljub pojavu platform za zaporedje nove generacije učenjaki doma in v tujini še vedno uporabljajo rezultate neposrednega zaporedja kot lestvico za merjenje in določanje zanesljivosti nove metode. Gao Jing in sod. Uporabili smo neposredno zaporedje za odkrivanje mutacij genov KRAS in BRAF pri 966 bolnikih s kolorektalnim rakom. To je tudi analiza mutacije gena KRAS z največjim domačim vzorcem, o katerem poročajo v literaturi. Ling Yun in drugi verjamejo, da je metoda neposrednega zaporedja najbolj neposredna in učinkovita metoda zaznavanja za razumevanje stanja mutacije vsakega gena, ki lahko razjasni vrsto mutacije, zlasti za odkrivanje neznanih mutacij. Čeprav je občutljivost te metode razmeroma nizka, jo je mogoče izboljšati z metodami, kot je mikrodisekcija za obogatitev tumorskih celic. Metoda neposrednega zaporedja je bila uporabljena tudi za odkrivanje večjih vzorcev KRAS v drugih domačih raziskovalnih skupinah. Vendar je manjša občutljivost največja slabost neposrednega zaporedja. Sodeč po rezultatih, objavljenih na Kitajskem, stopnja zaznavanja mutacij z neposrednim zaporedjem ni nizka. Liu Xiaojing idr. V primerjavi z neposrednim zaporedjem in PCR z objemko peptidne nukleinske kisline (PNA-PCR) smo ugotovili, da so z neposrednim zaporedjem odkrili 43 primerov mutacij genov KRAS. Poleg teh mutacij smo PNA-PCR odkrili tudi z neposrednim zaporedjem. Pri divjem tipu so našli deset mutacij in podali predloge za določitev bolnikov z divjim tipom s PCR in metodo neposrednega zaporedja za določitev mutiranih bolnikov. Qiu Tian et al. S pomočjo fluorescentne metode PCR-optimizirane oligonukleotidne sonde in metode neposrednega zaporedja smo odkrili 131 vzorcev kolorektalnega raka, pozitivne stopnje mutacij genov KRAS pa so bile 41.2% (54/131) in 40.5% (53/131). Bai Dongyu je razpravljal tudi o občutljivosti različnih metod. Od 200 bolnikov z rakom debelega črevesa in danke je bilo 63 odkritih z mutacijami RT-qPCR, stopnja odkrivanja mutacij pa je bila 31.5%; 169 vzorcev je bilo uspešno zaporednih z neposrednim zaporedjem 50 primerov mutacije, stopnja odkrivanja mutacij 29.6%. Čeprav lahko metoda neposrednega zaporedja natančno, objektivno in natančno odkrije status mutacije gena KRAS, so njene pomanjkljivosti, kot so visoke tehnične zahteve, zapleteni operativni postopki, ki lahko povzročijo navzkrižno kontaminacijo, ter dolgotrajna in mukotrpna razlaga rezultatov. očitno. Pogosto ni opreme za zaporedje in je treba primerek poslati ustreznemu podjetju na testiranje, ki traja dolgo in ima visoke stroške, zato ima velike omejitve.
Metoda pirorekvenciranja:
Metoda pirosekvenciranja je tudi bolj priročna metoda za odkrivanje mutacije gena KRAS v smislu občutljivosti zaporedja, stroškov odkrivanja in časa za poročanje. Ponovljivost te metode je boljša. Glede na dobljeno karto vrhov Kvantitativna študija pogostosti mutacij določenega mesta in primerjava med frekvencami mutacij različnih mest sta na prvi pogled jasna. V zadnjih letih so Ogino et al., Hutchins et al. Uporabili smo tehnologijo pirosekvenciranja za testiranje mutacij KRAS pri bolnikih z velikimi vzorci raka debelega črevesa in danke. Rezultati kažejo, da je tehnologija pirosekvenciranja močno orodje za pregled bolnikov na ciljno terapijo. Molekularna diagnoza tumorja ima široke možnosti uporabe. Domači znanstveniki so tudi z dobro natančnostjo in zanesljivostjo klinično odkrivali mutacije KRAS pri kolorektalnem raku. Ta metoda ima boljšo specifičnost in večjo občutljivost. SundstrÖm in sod. V primerjavi s PCR-jem, specifičnim za alel, in pirosekvenciranjem v kliničnih aplikacijah smo ugotovili, da je bila v 314 primerih mutacij KRAS pri bolnikih z rakom debelega črevesa in danke specifičnost pirosekvenciranja boljša od alelov. PCR in je dobro občutljiv na tkiva z nizko vsebnostjo tumorskih celic. Razredčite delež tumorskih celic na 1.25% do 2.5%. Pirosekvenciranje lahko še vedno zazna mutacijske signale. Kadar mora minimalna vsebnost mutiranih alelov v vzorcu doseči 20%, da jo lahko zaznamo s Sangerjevim zaporedjem, jo lahko zaznamo s HRM metodo, ko doseže 10%, pri pirosekvenciranju pa lahko zaznamo le 5% mutacije. Aleles. S pirosekvenciranjem smo odkrili mutacije KRAS pri 717 bolnikih s kolorektalnim rakom in ugotovili, da je bila pogostost mutacij KRAS 40.9%. Stopnja mutacije kodona 12 je bila 30.1%, stopnja mutacije kodona 13 je bila 9.8%, stopnja mutacije kodona 61 pa 1.0%. Pred testiranjem smo z ročno mikrodisekcijo obogatili tkiva z večjo vsebnostjo tumorjev, zaradi česar so bili rezultati bolj zanesljivi. Metoda ima dobro občutljivost in specifičnost ter jo je enostavno razviti v klinični praksi. Pomanjkljivost pirosekvenciranja so visoki stroški odkrivanja, postopek priprave enoverižne DNA za sekvenciranje vzorcev pa je okoren. V prihodnosti se lahko pirosekvenciranje posveti razvoju tehnologije za neposredno odkrivanje dvoverižnih izdelkov PCR, kar bo močno poenostavilo delovanje. In učinkovito zmanjšali stroške zaporedja za doseganje celovite promocije kliničnega testiranja.
3. Metoda ARMS:
Ta tehnologija uporablja primere za razlikovanje med divjimi in mutiranimi geni, wh
o njih poročajo že v osemdesetih letih prejšnjega stoletja. Največja prednost te metode je, da ima občutljivost do 1980% in lahko zazna mutirane gene v vzorcih do 1.0%. Pri načrtovanju se lahko dolžina ciljnega izdelka v največji meri skrajša in težava je, da ni mogoče dobiti natančnih rezultatov zaznavanja, ker je večina DNK, odvzete iz vzorca tkiva, vdelanega v parafin, razdrobljena. Ta tehnologija združuje PCR platformo v realnem času, da doseže delovanje zaprte cevi med ojačevanjem. Postopek je preprost in ne zahteva naknadne obdelave izdelka, ki lahko v največji meri prepreči kontaminacijo ojačenega izdelka. Trenutno se v svetu pogosteje uporablja metoda škorpijon-ARMS, ki kombinira mutacijski sistem škorpijonove sonde in ojačevalnega bloka. Kombinacija obeh tehnologij lahko poveča občutljivost in specifičnost obeh strani. Gao Jie idr. To metodo so uporabili za odkrivanje statusa mutacije gena KRAS pri 1.0 bolnikih s kolorektalnim rakom, kar kaže na zanesljivost in natančnost te metode. Wang Hui et al. Uporabil tudi ARMS za odkrivanje mutacij KRAS v 167 primerih v formaldehid fiksiranih tkiv in tkiv, vdelanih v parafin. V Združenih državah Amerike komplet COBAS (Roche), ki ga je odobrila FDA za klinično preskušanje KRAS, in komplet Therascreen RGQ (Qiagen), certificiran s strani Evropske unije za in vitro diagnostiko (CE-IVD), uporabljajo načelo ARMS. Med običajnimi metodami je metoda ARMS najbolj občutljiva in stroški so razmeroma sprejemljivi. Zato velik del kliničnega odkrivanja genov KRAS doma in v tujini uporablja metodo ARMS, ker pa metoda temelji na tehnologiji PCR, je njena pomanjkljivost ta, da jo je mogoče zaznati le na znanih mutacijah mesta.
4. Kvantitativna metoda PCR v realnem času s fluorescenco:
Je detekcijska metoda, ki temelji na PCR za določanje mutacije z vrednostjo Ct. Ima prednosti močne specifičnosti, visoke občutljivosti, natančne kvantifikacije, enostavnega upravljanja in popolnoma zaprte reakcije. Številne eksperimentalne skupine so sprejele to metodo za odkrivanje mutacij KRAS pri kolorektalnem raku. V primerjavi z metodo neposrednega sekvenciranja ima kvantitativna PCR večjo prednost pri občutljivosti. Večina znanstvenikov, ki primerja obe metodi, meni, da je kvantitativna PCR bolj občutljiva. Liu Wei et al. Uporabili smo dve metodi za podrobno analizo rezultatov odkrivanja 280 primerov mutacij gena KRAS raka debelega črevesa in danke, 94 primerov mutacij sekvenciranja gena KRAS, pozitivna stopnja je bila 33.57 % (94/280), od tega kvantitativna fluorescenca v realnem času PCR je bil pozitiven, 91 primerov je imelo občutljivost 96.8 % (91/94). Od 186 primerov divjega tipa genskega sekvenciranja jih je bilo 184 negativnih s kvantitativno PCR v realnem času s specifičnostjo 98.9 % (184/186). Stopnja sovpadanja med metodo kvantitativne PCR s fluorescenco v realnem času in metodo neposrednega sekvenciranja genov je bila 98.2 %. Pri obeh metodah odkrivanja je bila stopnja pozitivne in negativne naključnosti vsakega mutacijskega mesta nad 90 %, stopnja naključnosti štirih mest pa je dosegla 100 %. Rezultati odkrivanja obeh metod so bili zelo skladni, kar kaže na fluorescenčno kvantitativno PCR. Je bolj zanesljiva metoda za odkrivanje mutacij. Vendar morajo metode, ki temeljijo na PCR, oblikovati primerje in sonde na podlagi znanih tipov mutacij, tako da ni mogoče zaznati vseh možnih mutacij in je mogoče zaznati samo določena mesta. Če določeno mesto ni vključeno v obseg zaznavanja kompleta, tudi če dejansko obstaja mutacija, je rezultat kompleta še vedno negativen. Poleg tega, čeprav je občutljivost kvantitativnega PCR visoka, je treba, ali obstajajo lažno pozitivni rezultati, še vedno preveriti s tehnologijo sekvenciranja DNK ali retrospektivnih in prospektivnih kliničnih poskusov z velikimi velikostmi vzorcev, da se potrdi korelacija med statusom mutacije KRAS in učinkovitostjo ciljnih droge. Zato visoke občutljivosti detekcije mutacij ne bi smeli slepo slediti, medtem ko bi morali zanemariti specifičnost in natančnost detekcije. V različnih laboratorijskih pogojih je lahko tudi optimalna metoda za odkrivanje mutacij v vzorcih drugačna. Pri vzorcih z večjim deležem mutacij ima Sangerjeva metoda sekvenciranja večjo natančnost pri odkrivanju genskih mutacij, pri vzorcih z nižjim deležem mutacij pa Sangerjeva metoda sekvenciranja Lahko pride do lažno negativnih rezultatov in metoda odkrivanja s fluorescentno PCR kot tehnično platformo je lahko značilna visoka občutljivost.
5. HRM metoda:
Je ena najpogosteje uporabljenih metod za odkrivanje genov v zadnjih letih. Ima prednosti preproste, hitre, občutljive in enojne cevi, da se izogne onesnaženju. Da bi raziskali izvedljivost njegove uporabe v kliničnih testiranjih, so Liu Liqin in drugi uporabili metodo HRM za odkrivanje mutacij genov KRAS pri 64 bolnikih z rakom debelega črevesa in danke, nato pa za preverjanje rezultatov uporabili neposredno zaporedje. Ugotovljeno je, da so rezultati HRM in neposrednega zaporedja skladni. V primerjavi z neposrednim zaporedjem je odkrivanje mutacij genov KRAS s HRM preprosto in natančno, kar kaže na to, da gre za zanesljivo metodo, primerno za klinično testiranje. Chen Zhihong et al. Uporabili smo metodo HRM za testiranje vrste mešanih vzorcev, ki vsebujejo različna razmerja KRAS mutiranih plazmidov, da bi ocenili njihovo občutljivost. Ugotovljeno je bilo, da je bil delež plazmidnih mutacij v mešanih vzorcih 10%, občutljivost pa 10%. Nato je bila metoda uporabljena za odkrivanje genskih mutacij KRAS v 60 vzorcih tkiva raka debelega črevesa in danke. V primerjavi z metodo neposrednega zaporedja je bila občutljivost metode HRM 100%, specifičnost pa 96% (43/45). Pomanjkljivost metode HRM je, da je nemogoče natančno določiti specifično vrsto mutacije in kateri kodon je mutiran. Če se na krivulji taljenja odkrije nepravilnost, je za določitev vrste mutacije potrebna metoda zaporedja. Raziskovalna skupina Harlé je uporabila 156 primerov tkiva raka debelega črevesa in danke za primerjavo fluorescentnih metod PCR, ARMS in HRM. Rezultati kažejo, da čeprav so tri metode primerne za klinično testiranje, zanesljivost HRM ni tako dobra kot drugi dve metodi.
6. Druge metode:
Poleg zgoraj omenjenih metod imajo druge metode odkrivanja tudi svoje prednosti in slabosti pri uporabi, kot so PCR-SSCP, visoko zmogljiva tekočinska kromatografija, fluorescentna metoda oligonukleotidne sonde, optimizirana s PCR, metoda ugnezdene PCR in kombinacija ARMS, COLD-PCR metoda itd. Visoko zmogljiva tekočinska kromatografija ima močno specifičnost, vendar je povpraševanje po vzorcih veliko; PCR-SSCP je poceni in ekonomičen, vendar je delovanje zapleteno; tehnologija zaznavanja mutacij, ki temelji na fluorescentni PCR, ima močno specifičnost, visoko občutljivost in natančno kvantitativno, enostavnost delovanja, popolnoma blokirano reakcijo in druge prednosti, vendar morajo vsi temeljiti primerje in sonde v skladu z znano vrsto mutacije, tako da je mogoče določiti le določena mesta vseh možnih mutacij ni mogoče zaznati.
3. Povzetek
Če povzamemo, ker mesta mutacij in metode odkrivanja v različnih laboratorijih niso enaki, tudi velikost analiziranih vzorcev tumorjev in kakovost ekstrakcije DNK sta neenaki, kar ima za posledico velike ali majhne eksperimentalne rezultate med laboratoriji. Razlike, standardizacija odkrivanja genskih mutacij KRAS je v različnih državah postalo zaskrbljujoče vprašanje kliničnega odkrivanja. Trenutno obstaja veliko metod za odkrivanje mutacij v genu KRAS. Občutljivost od visoke do nizke je ARMS, pirosekvenciranje, HRM, kvantitativni PCR v realnem času in neposredno zaporedje. Glede na klinično resničnost nizka občutljivost ni naklonjena kliničnemu zdravljenju, vendar bodo preobčutljive metode poslabšale specifičnost odkrivanja in lahko pride do nepotrebnih lažno pozitivnih rezultatov, ki bodo vplivali na pacientov nadaljnji režim zdravljenja. Glede na zgornje vidike je v kombinaciji z metodo, ki jo je odobrila FDA, priporočljiva metoda ARMS. Seveda me s tržne perspektive molekularna diagnostika ne bi smela poudarjati
metode, ampak se osredotočite na končne pravilne rezultate. Različni laboratoriji lahko sprejmejo ustrezne preskusne metode glede na dejansko stanje, vendar le, če imajo dobro usposobljenost operaterja in sisteme notranjega nadzora kakovosti. V trenutnih okoljskih razmerah domačega laboratorija je treba izvajati testiranje v standardiziranem laboratoriju za PCR in sodelovati pri domačih in mednarodnih dejavnostih nadzora kakovosti med prostori, da se zagotovi zanesljiva kakovost laboratorijskega testiranja. Standardizirano vodenje je nujen pogoj za zagotavljanje stalnih rezultatov. Na Kitajskem je nujno treba poenotiti in standardizirati klinično testiranje gena KRAS ter ustvariti standardiziran in standardiziran program testiranja glede na različne potrebe, ta program pa je mogoče razširiti na odkrivanje BRAF, PIK23450_3CA, EGFR in drugi geni za spodbujanje testiranja klinične molekularne patologije.
