Medicamentele țintite precum cetuximab și panitumumab au fost utilizate pe scară largă în clinică ca medicamente terapeutice eficiente pentru cancerul colorectal. Datele clinice arată că pacienții cu mutații KRAS nu au niciun efect semnificativ asupra acestui medicament cu anticorpi monoclonali și doar pacienții de tip sălbatic pot beneficia de el. Prin urmare, starea mutației genei KRAS este privită clinic ca un marker terapeutic important, care are o puternică corelație cu efectul de prognostic și tratament al cancerului colorectal. Ghidurile de practică clinică pentru cancerul colorectal din 2009 din National Cancer Comprehensive Network (NCCN) stipulează că toți pacienții cu cancer colorectal metastatic trebuie să detecteze starea de mutație a genei KRAS și numai tipul sălbatic KRAS este recomandat să primească terapie țintită EGFR. În același an, Societatea Americană de Oncologie Clinică (ASCO) a emis, de asemenea, aceleași recomandări de tratament clinic ca un marker molecular pentru terapia țintită a tumorii, ceea ce arată importanța sa de ghidare. În prezent, testarea genetică KRAS a fost efectuată pe scară largă clinic. Evaluăm în principal metodele interne de detectare a mutațiilor genei KRAS pentru referință în selecția clinică.
1. Rata pozitivă a mutației genei KRAS în cancerul colorectal
În cancerul colorectal, rata mutației genei KRAS este de până la 35% până la 45%, iar locul mutației cu risc ridicat este codonii 12 și 13 la exonul 2 și există încă rare, cum ar fi 61 și 146. site. Există multe metode de detecție pentru mutațiile genei KRAS, incluzând secvențierea directă, analiza curbei de topire de înaltă rezoluție (HRM), pirozecvenția, PCR cantitativă, sistemul de blocare a amplificării mutației (amplinc atio), sistemul de mutare nerefractară (ARMS), polimorfismul de lungime a fragmentului de restricție (RFLP), analiza polimorfismului de reacție în lanț a polimerazei - conformare monocatenară (PCR-polimorfism de confomare singlestrand (PCR-SSCP), co-amplificare la temperatura de denaturare mai mică PCR (COLD-PCR) și analiză de cromatografie lichidă de înaltă performanță etc.)
2. Evaluarea metodelor de detectare a mutației KRAS
1. Metoda secvențierii directe: este cea mai clasică metodă de detectare a mutațiilor genei KRAS și este, de asemenea, standardul de aur pentru detectarea mutațiilor genetice. Metoda secvențierii directe bazată pe principiul secvențierii dideoxi poate arăta cel mai intuitiv schimbarea secvenței genetice sub forma unei hărți de vârf de bază. Tipul de detectare este mai cuprinzător și este, de asemenea, cea mai veche metodă de detectare a mutației aplicată. În ciuda apariției unor platforme de secvențiere de nouă generație, cercetătorii din țară și străinătate folosesc în continuare rezultatele secvențierii directe ca o scară pentru a măsura și a determina fiabilitatea noii metode. Gao Jing și colab. Aplicarea secvențierii directe la detectarea mutațiilor genelor KRAS și BRAF la 966 de pacienți cu cancer colorectal. Aceasta este, de asemenea, analiza mutației genei KRAS cu cel mai mare eșantion intern raportat în literatură. Ling Yun și alții consideră că metoda de secvențiere directă este cea mai directă și mai eficientă metodă de detectare pentru înțelegerea stării mutației fiecărei gene, care poate clarifica tipul mutației, în special pentru detectarea mutațiilor necunoscute. Deși sensibilitatea acestei metode este relativ scăzută, ea poate fi îmbunătățită prin metode precum microdisecția pentru a îmbogăți celulele tumorale. Metoda secvențierii directe a fost, de asemenea, aplicată pentru detectarea KRAS a unor dimensiuni mai mari de probe în alte grupuri de cercetare interne. Cu toate acestea, sensibilitatea mai mică este cel mai mare dezavantaj al secvențierii directe. Judecând după rezultatele raportate în China, rata de detectare a mutațiilor prin secvențierea directă nu este scăzută. Liu Xiaojing și colab. Au comparat secvențierea directă și peptida acidului nucleic cu clemă PCR (PNA-PCR) și au constatat că 43 de cazuri de mutații ale genei KRAS au fost detectate prin secvențierea directă. În plus față de aceste mutații, PNA-PCR a fost, de asemenea, detectată prin secvențierea directă. Zece mutații au fost găsite în tipul sălbatic și s-au făcut sugestii pentru a determina pacienții de tip sălbatic prin PCR și metoda de secvențiere directă pentru a determina pacienții mutanți. Qiu Tian și colab. S-au detectat 131 de probe de cancer colorectal prin metoda fluorescentă a sondei oligonucleotidice optimizate prin PCR și metoda de secvențiere directă, iar ratele pozitive ale mutațiilor genei KRAS au fost de 41.2% (54/131) și 40.5% (53/131)). Bai Dongyu a discutat și despre sensibilitatea de detectare a diferitelor metode. Dintre cei 200 de pacienți cu cancer colorectal, 63 au fost detectați prin mutații RT-qPCR, iar rata de detectare a mutației a fost de 31.5%; 169 de probe au fost secvențiate cu succes prin secvențierea directă a 50 de cazuri de mutație, rata de detectare a mutației cu 29.6%. Deși metoda de secvențiere directă poate detecta cu acuratețe, obiectivitate și în mod specific starea mutației genei KRAS, neajunsurile sale, cum ar fi cerințe tehnice ridicate, proceduri de operare complicate, ușor de provocat contaminarea încrucișată și o interpretare laborioasă și consumatoare de timp a rezultatelor sunt, de asemenea, foarte evident. De multe ori nu există echipamente de secvențiere, iar specimenul trebuie trimis la compania corespunzătoare pentru testare, ceea ce durează mult timp și are un cost ridicat, deci are limitări mari.
Metoda pirozecventarii:
Metoda pirosecvențării este, de asemenea, o metodă mai convenabilă pentru detectarea mutației genei KRAS în ceea ce privește sensibilitatea secvențierii, costul de detectare și timpul de raportare. Repetabilitatea acestei metode este mai bună. Conform hărții de vârf obținute Studiul cantitativ al frecvenței mutației unui anumit sit și comparația dintre frecvențele mutației diferitelor situri sunt clare dintr-o privire. În ultimii ani, Ogino și colab., Hutchins și colab. Au folosit tehnologia pirosequencing pentru a testa mutațiile KRAS la pacienții cu probe mari de cancer colorectal. Rezultatele indică faptul că tehnologia pirosequencing este un instrument puternic pentru screening-ul pacienților în vederea tratamentului țintit. Diagnosticul molecular al tumorii are perspective largi de aplicare. Savanții interni au folosit, de asemenea, tehnologia pirosequencing pentru a detecta clinic mutațiile KRAS în cancerul colorectal, cu o bună precizie și fiabilitate. Această metodă are o specificitate mai bună și o sensibilitate mai mare. SundstrÖm și colab. Au comparat PCR-ul alelic-specific și piroseqüențierea în aplicații clinice și a constatat că în 314 de cazuri de mutații KRAS la pacienții cu cancer colorectal, specificitatea pirosecvenței a fost superioară celei a alelelor. PCR și are o bună sensibilitate la țesuturile cu conținut scăzut de celule tumorale. Diluați proporția celulelor tumorale la 1.25% la 2.5%. Pirosecvențierea poate detecta în continuare semnale de mutație. Atunci când conținutul minim de alele mutante din eșantion trebuie să ajungă la 20% pentru a fi detectat prin secvențierea Sanger, acesta poate fi detectat prin metoda HRM când ajunge la 10%, iar pentru pirosecvențierea numai mutațiile pot fi detectate cu 5%. Alele. Am folosit pirosecvențierea pentru a detecta mutațiile KRAS la 717 pacienți cu cancer colorectal și am constatat că frecvența mutațiilor KRAS a fost de 40.9%. Rata de mutație a codonului 12 a fost de 30.1%, rata de mutație a codonului 13 a fost de 9.8%, iar rata de mutație a codonului 61 a fost de 1.0%. Am îmbogățit țesuturile cu un conținut mai mare de tumori prin microdisecție manuală înainte de testare, făcând rezultatele mai fiabile. Metoda are o bună sensibilitate și specificitate și este ușor de dezvoltat în practica clinică. Dezavantajul pirozecvențării este costul ridicat al detectării, iar procesul de preparare a ADN-ului monocatenar pentru secvențierea probelor este greoi. În viitor, piroza secvențierea poate fi dedicată dezvoltării tehnologiei pentru detectarea directă a produselor PCR dublu catenare, ceea ce va simplifica foarte mult funcționarea. Și reduceți eficient costul secvențierii pentru a realiza o promovare cuprinzătoare a testelor clinice.
3. Metoda ARMS:
Această tehnologie folosește primeri pentru a distinge între genele sălbatice și genele mutante, wh
Ich a fost raportat încă din anii 1980. Cel mai mare avantaj al acestei metode este că are o sensibilitate de până la 1.0% și poate detecta gene mutante în probe de până la 1.0%. În proiectare, lungimea produsului țintă poate fi scurtată în cea mai mare măsură și problema că rezultatele exacte ale detectării nu pot fi obținute deoarece majoritatea ADN-ului extras din specimenul de țesut încorporat în parafină este fragmentat. Această tehnologie combină platforma PCR în timp real pentru a realiza funcționarea cu tub închis în timpul amplificării. Operațiunea este simplă și nu necesită post-procesare a produsului, ceea ce poate evita contaminarea produsului amplificat în cea mai mare măsură. În prezent, metoda scorpion-ARMS care combină sonda scorpionului și sistemul de mutație bloc de amplificare este mai frecvent utilizată în lume. Combinația celor două tehnologii poate maximiza sensibilitatea și specificitatea ambelor părți. Gao Jie și colab. S-a folosit această metodă pentru a detecta starea mutației genei KRAS la 167 de pacienți cu cancer colorectal, sugerând că această metodă este fiabilă și precisă. Wang Hui și colab. S-a folosit, de asemenea, ARMS pentru a detecta mutațiile KRAS în 151 de cazuri de țesuturi fixate în formaldehidă și înglobate în parafină. În Statele Unite, kitul COBAS (Roche) aprobat de FDA pentru testarea clinică a KRAS și kitul Therascreen RGQ (Qiagen) certificat de Uniunea Europeană In Vitro Diagnostics (CE-IVD) utilizează principiul ARMS. Dintre metodele comune, metoda ARMS este cea mai sensibilă, iar costul este relativ rezonabil. Prin urmare, o mare parte din detectarea clinică a genelor KRAS la domiciliu și în străinătate utilizează metoda ARMS, dar deoarece metoda se bazează pe tehnologia PCR, neajunsul acesteia este că poate fi detectată doar mutații cunoscute ale site-ului.
4. Metoda PCR cantitativă în fluorescență în timp real:
Este o metodă de detectare bazată pe PCR pentru a determina mutația după valoarea Ct. Are avantajele unei specificități puternice, sensibilitate ridicată, cuantificare precisă, operare ușoară și reacție complet închisă. Multe grupuri experimentale au adoptat această metodă pentru detectarea mutațiilor KRAS în cancerul colorectal. Comparativ cu metoda de secvențiere directă, PCR cantitativă ocupă un avantaj mai mare în sensibilitate. Majoritatea cercetătorilor care compară cele două metode consideră că PCR-ul cantitativ este mai sensibil. Liu Wei și colab. S-au folosit două metode pentru a face o analiză detaliată a rezultatelor detectării a 280 de cazuri de mutații ale genei KRAS de cancer colorectal, 94 de cazuri de mutații de secvențiere a genei KRAS, rata pozitivă a fost de 33.57% (94/280), dintre care, fluorescență în timp real cantitativă PCR a fost pozitiv 91 de cazuri au avut o sensibilitate de 96.8% (91/94). Din cele 186 de cazuri de tip sălbatic de secvențiere a genelor, 184 au fost negative prin PCR cantitativă în timp real, cu o specificitate de 98.9% (184/186). Rata de coincidență între metoda PCR cantitativă cu fluorescență în timp real și metoda de secvențiere directă a genelor a fost de 98.2%. În cele două metode de detectare, ratele de coincidență pozitive și negative ale fiecărui loc de mutație au fost peste 90%, iar rata de coincidență a patru situsuri a ajuns la 100%. Rezultatele de detecție ale celor două metode au fost foarte consistente, indicând PCR cantitativ fluorescent. Este o metodă mai fiabilă pentru detectarea mutațiilor. Cu toate acestea, metodele bazate pe PCR trebuie să proiecteze primeri și sonde pe baza unor tipuri de mutații cunoscute, astfel încât toate mutațiile posibile nu pot fi detectate și pot fi detectate doar situsuri specifice. Dacă un anumit loc nu este inclus în raza de detectare a trusei, chiar dacă există de fapt o mutație, rezultatul trusei este în continuare negativ. În plus, deși sensibilitatea PCR cantitativă este mare, dacă există false pozitive trebuie încă verificat prin tehnologia de secvențiere a ADN-ului sau prin experimente clinice retrospective și prospective cu dimensiuni mari ale eșantionului pentru a confirma corelația dintre starea mutației KRAS și eficacitatea țintă. droguri . Prin urmare, sensibilitatea ridicată a detectării mutațiilor nu trebuie urmărită orbește, în timp ce specificitatea și acuratețea detectării ar trebui ignorate. În diferite condiții de laborator, metoda optimă pentru detectarea mutațiilor în probe poate fi, de asemenea, diferită. Pentru specimenele cu o proporție mai mare de mutații, metoda de secvențiere Sanger are o acuratețe mai mare în detectarea mutațiilor genetice, în timp ce pentru specimenele cu o proporție mai mică de mutații, metoda de secvențiere Sanger pot apărea fals negative, iar metoda de detectare folosind PCR fluorescentă ca platformă tehnică poate fi caracterizată prin sensibilitate ridicată.
5. Metoda HRM:
Este una dintre cele mai frecvent utilizate metode de detectare a genelor din ultimii ani. Are avantajele unui tub simplu, rapid, sensibil și unic, pentru a evita poluarea. Pentru a explora fezabilitatea utilizării sale în testarea clinică, Liu Liqin și alții au folosit metoda HRM pentru a detecta mutațiile genei KRAS la 64 de pacienți cu cancer colorectal și apoi au folosit secvențierea directă pentru a verifica rezultatele. Rezultatele HRM și secvențierea directă sunt consecvente. Comparativ cu secvențierea directă, detectarea mutațiilor genei KRAS de către HRM este simplă și precisă, sugerând că este o metodă fiabilă adecvată pentru testarea clinică. Chen Zhihong și colab. S-a folosit metoda HRM pentru a testa o serie de probe mixte care conțin diferite proporții de plasmide mutante KRAS pentru a evalua sensibilitatea acestora. S-a constatat că proporția mutațiilor plasmidice în probele mixte a fost de 10%, iar sensibilitatea a ajuns la 10%. Ulterior, metoda a fost utilizată pentru a detecta mutațiile genei KRAS în 60 de probe de țesut de cancer colorectal. Comparativ cu metoda secvențierii directe, sensibilitatea metodei HRM a fost de 100%, iar specificitatea a fost de 96% (43/45). Dezavantajul metodei HRM este că este imposibil să se furnizeze cu precizie tipul de mutație specific și care codon este mutat. Dacă se constată o anomalie pe curba de topire, este necesară o metodă de secvențiere pentru a determina tipul mutației. Grupul de cercetare Harlé a folosit 156 de cazuri de țesut cu cancer colorectal pentru a compara metodele fluorescente PCR, ARMS și HRM. Rezultatele sugerează că, deși cele trei metode sunt adecvate pentru testarea clinică, fiabilitatea HRM nu este la fel de bună ca celelalte două metode.
6. Alte metode:
În plus față de metodele menționate mai sus, alte metode de detectare au propriile avantaje și dezavantaje în aplicare, cum ar fi PCR-SSCP, cromatografie lichidă de înaltă performanță, metodă de sondă oligonucleotidică fluorescentă optimizată prin PCR, metodă de combinație PCR imbricată și combinație ARMS, COLD-PCR metoda etc. Cromatografia lichidă de înaltă performanță are o specificitate puternică, dar cererea de probe este mare; PCR-SSCP are un cost redus și este economic, dar funcționarea este complicată; tehnologia de detectare a mutațiilor bazată pe PCR fluorescentă are o specificitate puternică, o sensibilitate ridicată și o cantitate precisă, funcționare ușoară, reacție complet blocată și alte avantaje, dar toate trebuie să proiecteze grunduri și sonde în funcție de tipul de mutație cunoscut, astfel încât numai site-urile specifice pot fi detectate și toate mutațiile posibile nu pot fi detectate.
3. Rezumat
Pe scurt, deoarece siturile de mutație și metodele de detectare din diferite laboratoare nu sunt uniforme, dimensiunea specimenelor tumorale analizate și calitatea extracției ADN sunt, de asemenea, neuniforme, rezultând existența unor rezultate experimentale mari sau mici între laboratoare Diferențe, standardizarea de detectare a mutației genei KRAS a devenit o problemă de detectare clinică care preocupă în diferite țări. În prezent, există multe metode de detectare a mutațiilor genei KRAS. Sensibilitatea de la mare la scăzută este ARMS, pirosequencing, HRM, PCR cantitativă în timp real și secvențierea directă. Din realitatea clinică, sensibilitatea scăzută nu este favorabilă tratamentului clinic, dar metodele prea sensibile vor determina scăderea specificității detecției și pot apărea rezultate fals pozitive inutile care afectează regimul de medicare ulterior al pacientului. Având în vedere aspectele de mai sus, combinate cu metoda aprobată de FDA, se recomandă metoda ARMS. Desigur, din perspectiva pieței, diagnosticul molecular nu ar trebui să mă sublinieze
metode, dar concentrați-vă pe rezultatele corecte finale. Diferite laboratoare pot adopta metode de testare adecvate în funcție de situația actuală, dar numai dacă au calificări bune de operator și sisteme interne de control al calității. În condițiile actuale de mediu de laborator intern, este necesar să se efectueze teste într-un laborator PCR standard și să se participe la activități interne și internaționale de control al calității între camere pentru a asigura o calitate fiabilă a testelor de laborator. Managementul standardizat este o condiție necesară pentru a asigura rezultate constante. În China, există o nevoie urgentă de a unifica și standardiza testarea clinică a genei KRAS și de a genera un program de testare standardizat și standardizat în funcție de diferite nevoi, iar acest program poate fi extins la detectarea BRAF, PIK23450_3CA, EGFR și alte gene pentru a promova testarea clinică a patologiei moleculare.
