Mērķtiecīgas zāles, piemēram, cetuksimabs un panitumumabs, ir plaši izmantotas klīnikā kā efektīvas terapeitiskās zāles kolorektālā vēža ārstēšanai. Klīniskie dati liecina, ka pacientiem ar KRAS mutācijām nav būtiskas ietekmes uz šo monoklonālo antivielu medikamentu, un tikai savvaļas tipa pacienti var gūt labumu no tā. Tāpēc KRAS gēna mutācijas statuss klīniski tiek uzskatīts par svarīgu terapeitisko marķieri, kam ir spēcīga korelācija ar kolorektālā vēža prognozi un ārstēšanas efektu. 2009. gada Nacionālā vēža visaptverošā tīkla (NCCN) kolorektālā vēža klīniskās prakses vadlīnijas nosaka, ka visiem pacientiem ar metastātisku kolorektālo vēzi ir jānosaka KRAS gēna mutācijas statuss, un tikai KRAS savvaļas tipam ir ieteicams saņemt EGFR mērķterapiju. Tajā pašā gadā Amerikas Klīniskās onkoloģijas biedrība (ASCO) arī izdeva tādus pašus klīniskās ārstēšanas ieteikumus kā molekulāro marķieri audzēju mērķtiecīgai terapijai, kas parāda tā svarīgo vadošo nozīmi. Pašlaik KRAS ģenētiskā testēšana ir plaši veikta klīniski. Mēs galvenokārt novērtējam vietējās KRAS gēnu mutāciju noteikšanas metodes atsaucei klīniskajā atlasē.
1. KRAS gēna mutācijas pozitīvais ātrums kolorektālā vēža gadījumā
Kolorektālā vēža gadījumā KRAS gēna mutācijas ātrums ir no 35% līdz 45%, un augsta riska mutācijas vieta ir eksona 12 kodoni 13 un 2, un joprojām ir reti sastopami, piemēram, 61. un 146. mutācija. vietne. KRAS gēnu mutācijām ir daudz noteikšanas metožu, ieskaitot tiešu sekvencēšanu, augstas izšķirtspējas kušanas līknes analīzi (HRM), pirosekvenēšanu, kvantitatīvu PCR, mutācijas amplifikācijas bloku sistēmu (amplinc atio) nrefraktorimutācijas sistēmu (ARMS), restrikcijas fragmenta garuma polimorfismu (RFLP) polimerāzes ķēdes reakcijas - vienas virknes konformācijas polimorfisma analīze (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), kopēja amplifikācija pie zemākas denaturācijas temperatūras PCR (COLD-PCR) un augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas analīze utt.
2. KRAS mutācijas noteikšanas metožu novērtēšana
1. Tiešās sekvencēšanas metode: tā ir visklasiskākā metode KRAS gēnu mutāciju noteikšanai, kā arī zelta standarts gēnu mutāciju noteikšanai. Tiešās sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir dideoksi sekvencēšanas princips, intuitīvāk var parādīt gēnu secības izmaiņas bāzes pīķa kartes veidā. Atklāšanas veids ir visaptverošāks, un tā ir arī agrākā mutācijas noteikšanas metode. Neskatoties uz jaunās paaudzes sekvencēšanas platformu parādīšanos, gan vietējie, gan ārzemju zinātnieki joprojām izmanto tiešās sekvencēšanas rezultātus kā skalu, lai izmērītu un noteiktu jaunās metodes uzticamību. Gao Jing u.c. Pielietota tieša sekvencēšana KRAS un BRAF gēnu mutāciju noteikšanai 966 pacientiem ar kolorektālo vēzi. Šī ir arī KRAS gēna mutācijas analīze ar lielāko vietējā parauga daudzumu, kas ziņots literatūrā. Lings Juns un citi uzskata, ka tiešā sekvencēšanas metode ir vistiešākā un efektīvākā noteikšanas metode katra gēna mutācijas stāvokļa izpratnei, kas var precizēt mutācijas veidu, īpaši nezināmu mutāciju noteikšanai. Lai gan šīs metodes jutīgums ir salīdzinoši zems, to var uzlabot ar tādām metodēm kā mikrodisekcija, lai bagātinātu audzēja šūnas. Tiešās sekvencēšanas metode ir piemērota arī lielākas izlases lieluma KRAS noteikšanai citās vietējās pētniecības grupās. Tomēr zemāka jutība ir tiešās sekvencēšanas lielākais trūkums. Spriežot pēc Ķīnā ziņotajiem rezultātiem, mutāciju noteikšanas līmenis, izmantojot tiešu sekvencēšanu, nav zems. Liu Xiaojing un citi. Salīdzināja tiešo sekvencēšanu un peptīdu nukleīnskābju skavas PCR (PNA-PCR) un atklāja, ka ar tiešu sekvencēšanu tika atklāti 43 KRAS gēnu mutāciju gadījumi. Papildus šīm mutācijām PNA-PCR tika atklāts arī ar tiešu sekvencēšanu. Savvaļas tipā tika atklātas desmit mutācijas, un tika veikti ieteikumi savvaļas tipa pacientu noteikšanai ar PCR un tiešās sekvencēšanas metodi mutantu pacientu noteikšanai. Qiu Tian un citi. Atklāti 131 kolorektālā vēža paraugi ar fluorescējošu PCR optimizētu oligonukleotīdu zondes metodi un tiešās sekvencēšanas metodi, un KRAS gēnu mutāciju pozitīvais rādītājs bija 41.2% (54/131) un 40.5% (53/131). Bai Dongyu arī apsprieda dažādu metožu noteikšanas jutīgumu. No 200 kolorektālā vēža slimniekiem 63 tika atklāti ar RT-qPCR mutācijām, un mutācijas noteikšanas līmenis bija 31.5%; 169 paraugi tika veiksmīgi sekvencēti, tieši sekvencējot 50 mutācijas gadījumus, mutācijas noteikšanas ātrums 29.6%. Lai gan ar tiešās sekvenēšanas metodi var precīzi, objektīvi un specifiski noteikt KRAS gēnu mutācijas statusu, ļoti trūkumi, piemēram, augstas tehniskās prasības, sarežģītas darbības procedūras, viegli izraisīt savstarpēju piesārņojumu, kā arī laikietilpīga un darbietilpīga rezultātu interpretācija, acīmredzams. Bieži vien nav sekvencēšanas aprīkojuma, un paraugs ir jānosūta attiecīgajam uzņēmumam testēšanai, kas prasa ilgu laiku un kuram ir lielas izmaksas, tāpēc tam ir lieli ierobežojumi.
Pirosekvensēšanas metode:
Pirosekvenēšanas metode ir arī ērtāka metode KRAS gēnu mutāciju noteikšanai attiecībā uz sekvencēšanas jutīgumu, noteikšanas izmaksām un ziņojumu sniegšanas laiku. Šīs metodes atkārtojamība ir labāka. Saskaņā ar iegūto pīķa karti Kvantitatīvs noteiktas vietas mutācijas biežuma pētījums un dažādu vietu mutāciju biežumu salīdzinājums ir skaidri redzami. Pēdējos gados Ogino et al., Hutchins et al. Izmantojuši pirosekvenēšanas tehnoloģiju, lai pārbaudītu KRAS mutācijas pacientiem ar lieliem kolorektālā vēža paraugiem. Rezultāti norāda, ka pirosekvenēšanas tehnoloģija ir spēcīgs līdzeklis pacientu skrīnēšanai mērķtiecīgai terapijai. Audzēja molekulārajai diagnostikai ir plašas iespējas. Iekšzemes zinātnieki ir izmantojuši arī pirosekvenēšanas tehnoloģiju, lai klīniski atklātu KRAS mutācijas taisnās zarnas vēzī, ar labu precizitāti un uzticamību. Šai metodei ir labāka specifika un lielāka jutība. SundstrÖm et al. Salīdzinot aleliskajam specifiskajam PCR un pirozsekvenāciju klīniskajos pielietojumos, tika konstatēts, ka 314 KRAS mutāciju gadījumos kolorektālā vēža slimniekiem pirosekvences specifika bija augstāka nekā alēlēm. PCR, un tai ir laba jutība pret audiem ar zemu audzēja šūnu saturu. Atšķaida audzēja šūnu daļu līdz 1.25% līdz 2.5%. Pirosekvenēšana joprojām var noteikt mutācijas signālus. Kad minimālajam mutantu alēļu saturam paraugā jāsasniedz 20%, lai to varētu noteikt ar Sangera sekvencēšanu, to var noteikt ar HRM metodi, kad tas sasniedz 10%, un pirosekvenēšanai tikai 5% var noteikt mutācijas. Alēles. Mēs izmantojām pirosekvenēšanu, lai noteiktu KRAS mutācijas 717 pacientiem ar kolorektālo vēzi un konstatējām, ka KRAS mutāciju biežums bija 40.9%. 12. kodona mutācijas ātrums bija 30.1%, 13. kodona mutācijas ātrums bija 9.8% un 61. kodona mutācijas ātrums bija 1.0%. Pirms testēšanas mēs bagātinājām audus ar lielāku audzēja saturu, veicot manuālu mikrodisekciju, padarot rezultātus ticamākus. Metodei ir laba jutība un specifika, un to ir viegli attīstīt klīniskajā praksē. Pirosekvenēšanas trūkums ir augstās noteikšanas izmaksas, un vienas virknes DNS sagatavošanas process paraugu sekvencēšanai ir apgrūtinošs. Nākotnē pirozsekvenēšanu var veltīt tehnoloģiju izstrādei, lai tiešā veidā atklātu divšķautņainus PCR produktus, kas ievērojami vienkāršos darbību. Un efektīvi samaziniet sekvencēšanas izmaksas, lai panāktu visaptverošu klīnisko testu veicināšanu.
3. Ieroču metode:
Šī tehnoloģija izmanto primerus, lai atšķirtu savvaļas tipa un mutantu gēnus, wh
par kuru ziņots jau 1980. gados. Šīs metodes lielākā priekšrocība ir tā, ka tās jutība ir līdz 1.0%, un tā var noteikt mutantu gēnus pat 1.0% paraugos. Projektējot mērķa produkta garumu var saīsināt vislielākajā mērā, un problēmu, ka precīzus noteikšanas rezultātus nevar iegūt, jo lielākā daļa no parafīnā ievietotajiem audu paraugiem ekstrahētās DNS ir sadrumstalota. Šī tehnoloģija apvieno reālā laika PCR platformu, lai amplifikācijas laikā panāktu slēgtas caurules darbību. Darbība ir vienkārša, un tai nav nepieciešama produkta pēcapstrāde, kas maksimāli var novērst pastiprinātā produkta piesārņošanu. Pašlaik pasaulē biežāk tiek izmantota skorpiona-ARMS metode, kas apvieno skorpiona zondi un amplifikācijas bloku mutāciju sistēmu. Abu tehnoloģiju kombinācija var maksimāli palielināt abu pušu jutīgumu un specifiku. Gao Jie et al. Izmantoja šo metodi, lai noteiktu KRAS gēna mutācijas statusu 167 pacientiem ar kolorektālo vēzi, kas liecina, ka šī metode ir uzticama un precīza. Wang Hui et al. Izmanto arī ARMS KRAS mutāciju noteikšanai 151 formaldehīdā fiksētu un parafīnā iestrādātu audu gadījumā. Amerikas Savienotajās Valstīs FDA apstiprinātais COBAS komplekts (Roche) KRAS klīniskai pārbaudei un Therascreen RGQ komplekts (Qiagen), ko sertificējusi Eiropas Savienības In vitro diagnostika (CE-IVD), izmanto ARMS principu. Starp izplatītākajām metodēm visjutīgākā ir ARMS metode, un izmaksas ir samērā saprātīgas. Tāpēc liela daļa KRAS gēnu klīniskās noteikšanas mājās un ārzemēs izmanto ARMS metodi, taču, tā kā šī metode ir balstīta uz PCR tehnoloģiju, tās trūkums ir tāds, ka to var atklāt tikai zināmās vietas mutācijas.
4. Reālā laika fluorescences kvantitatīvā PCR metode:
Tā ir uz PCR balstīta noteikšanas metode, lai noteiktu mutāciju pēc Ct vērtības. Tā priekšrocības ir spēcīga specifika, augsta jutība, precīza kvantitatīva noteikšana, vienkārša darbība un pilnībā slēgta reakcija. Daudzas eksperimentālās grupas ir pieņēmušas šo metodi KRAS mutāciju noteikšanai kolorektālā vēža gadījumā. Salīdzinot ar tiešās sekvencēšanas metodi, kvantitatīvā PCR ir lielāka jutības priekšrocība. Lielākā daļa zinātnieku, kas salīdzina abas metodes, uzskata, ka kvantitatīvā PCR ir jutīgāka. Liu Vei et al. Izmantotas divas metodes, lai veiktu detalizētu analīzi par 280 kolorektālā vēža KRAS gēnu mutāciju gadījumiem, 94 KRAS gēnu sekvencēšanas mutāciju gadījumiem, pozitīvais rādītājs bija 33.57% (94/280), no kuriem reālā laika fluorescences kvantitatīvā. PCR bija pozitīvs 91 gadījumam jutība bija 96.8% (91/94). No 186 savvaļas tipa gēnu sekvencēšanas gadījumiem 184 bija negatīvi ar reāllaika kvantitatīvo PCR, ar specifiku 98.9% (184/186). Sakritības koeficients starp reālā laika fluorescences kvantitatīvo PCR metodi un tiešās gēnu sekvencēšanas metodi bija 98.2%. Abās noteikšanas metodēs katras mutācijas vietas pozitīvās un negatīvās sakritības līmenis bija virs 90%, un četru vietu sakritības līmenis sasniedza 100%. Abu metožu noteikšanas rezultāti bija ļoti konsekventi, norādot uz fluorescējošu kvantitatīvo PCR. Tā ir uzticamāka metode mutāciju noteikšanai. Tomēr uz PCR balstītām metodēm ir jāizstrādā praimeri un zondes, pamatojoties uz zināmiem mutāciju veidiem, tāpēc visas iespējamās mutācijas nevar noteikt un var noteikt tikai noteiktas vietas. Ja noteikta vieta nav iekļauta komplekta noteikšanas diapazonā, pat ja tajā faktiski ir mutācija, komplekta rezultāts joprojām ir negatīvs. Turklāt, lai gan kvantitatīvās PCR jutīgums ir augsts, joprojām ir jāpārbauda, vai ir kļūdaini pozitīvi rezultāti, izmantojot DNS sekvencēšanas tehnoloģiju vai retrospektīvus un perspektīvus klīniskos eksperimentus ar lielu paraugu skaitu, lai apstiprinātu korelāciju starp KRAS mutācijas statusu un mērķa efektivitāti. narkotikas. Tāpēc mutāciju noteikšanas augstajai jutībai nevajadzētu akli tiekties, savukārt noteikšanas specifika un precizitāte ir jāignorē. Dažādos laboratorijas apstākļos optimālā metode mutāciju noteikšanai paraugos var arī atšķirties. Paraugiem ar lielāku mutāciju īpatsvaru Sangera sekvencēšanas metodei ir lielāka precizitāte gēnu mutāciju noteikšanā, savukārt paraugiem ar mazāku mutāciju īpatsvaru Sangera sekvencēšanas metode var rasties viltus negatīvi, un noteikšanas metode, kurā kā tehnisko platformu izmanto fluorescējošu PCR. var raksturot ar augstu jutību.
5. HRM metode:
Tā ir viena no pēdējos gados biežāk izmantotajām gēnu noteikšanas metodēm. Tam ir vienkāršas, ātras, jutīgas un vienas caurules priekšrocības, lai izvairītos no piesārņojuma. Lai izpētītu tā izmantošanas iespējamību klīniskajos testos, Liu Liqin un citi izmantoja HRM metodi, lai atklātu KRAS gēnu mutācijas 64 pacientiem ar kolorektālo vēzi, un pēc tam rezultātu pārbaudei izmantoja tiešu sekvencēšanu. HRM un tiešās sekvencēšanas rezultāti ir atzīti par konsekventiem. Salīdzinot ar tiešu sekvencēšanu, KRAS gēnu mutāciju noteikšana ar HRM ir vienkārša un precīza, kas liek domāt, ka tā ir uzticama metode, kas piemērota klīniskām pārbaudēm. Chen Zhihong et al. Izmantoja HRM metodi, lai pārbaudītu jauktu paraugu sēriju, kas satur dažādas KRAS mutantu plazmīdu proporcijas, lai novērtētu to jutīgumu. Tika konstatēts, ka jaukto paraugu plazmīdu mutāciju īpatsvars bija 10%, bet jutība sasniedza 10%. Pēc tam metodi izmantoja KRAS gēnu mutāciju noteikšanai 60 kolorektālā vēža audu paraugos. Salīdzinot ar tiešās sekvencēšanas metodi, HRM metodes jutīgums bija 100%, un specifiskums bija 96% (43/45). HRM metodes trūkums ir tāds, ka nav iespējams precīzi noteikt konkrēto mutācijas tipu un kuru kodonu ir mutēts. Ja kušanas līknē tiek konstatēta novirze, mutācijas veida noteikšanai ir nepieciešama sekvencēšanas metode. Harlé pētījumu grupa izmantoja 156 kolorektālā vēža audu gadījumus, lai salīdzinātu fluorescējošas PCR, ARMS un HRM metodes. Rezultāti liecina, ka, lai gan trīs metodes ir piemērotas klīniskai pārbaudei, HRM uzticamība nav tik laba kā pārējās divas metodes.
6. Citas metodes:
Papildus iepriekšminētajām metodēm citām noteikšanas metodēm ir savas priekšrocības un trūkumi, piemēram, PCR-SSCP, augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija, fluorescējoša PCR optimizēta oligonukleotīda zondes metode, ligzdotās PCR un ARMS kombinācijas metode, COLD-PCR metode utt. Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijai ir spēcīga specifika, bet pieprasījums pēc paraugiem ir liels; PCR-SSCP ir zemas izmaksas un ekonomisks, taču darbība ir sarežģīta; mutāciju noteikšanas tehnoloģijai, kas balstīta uz fluorescējošu PCR, ir spēcīga specifika, augsta jutība un precīza kvantitatīva, ērta darbība, pilnībā bloķēta reakcija un citas priekšrocības, taču tām visām ir jāveido gruntskrāsas un zondes atbilstoši zināmajam mutācijas tipam, tāpēc var būt tikai noteiktas vietas tiek konstatētas visas iespējamās mutācijas.
3. kopsavilkums
Kopumā, tā kā mutāciju vietas un noteikšanas metodes dažādās laboratorijās nav vienādas, analizēto audzēju paraugu lielums un DNS ekstrakcijas kvalitāte ir arī nevienmērīga, kā rezultātā laboratorijās pastāv lieli vai mazi eksperimentu rezultāti. Atšķirības, standartizācija gēnu mutāciju noteikšana ir kļuvusi par klīnisku atklāšanas problēmu, kas rada bažas dažādās valstīs. Pašlaik KRAS gēna mutāciju noteikšanai ir daudz metožu. Jutība no augstas līdz zemai ir ARMS, pirosekvenēšana, HRM, reāllaika kvantitatīvā PCR un tieša sekvencēšana. No klīniskās realitātes zemā jutība neveicina klīnisko ārstēšanu, bet pārāk jutīgas metodes izraisīs noteikšanas specifiskuma samazināšanos, un var rasties nevajadzīgi kļūdaini pozitīvi rezultāti, kas ietekmē pacienta turpmāko zāļu režīmu. Ņemot vērā iepriekš minētos aspektus apvienojumā ar FDA apstiprināto metodi, ieteicams izmantot ARMS metodi. Protams, no tirgus viedokļa molekulārā diagnostika mani nedrīkst uzsvērt
thods, bet koncentrējieties uz galīgajiem pareizajiem rezultātiem. Dažādas laboratorijas var pieņemt atbilstošas testēšanas metodes atbilstoši faktiskajai situācijai, bet tikai tad, ja tām ir laba operatora kvalifikācija un iekšējās kvalitātes kontroles sistēmas. Pašreizējos vietējos laboratorijas vides apstākļos ir nepieciešams veikt testēšanu standartizētā PCR laboratorijā un piedalīties vietējā un starptautiskā starptelpu kvalitātes kontroles pasākumos, lai nodrošinātu uzticamu laboratorijas testu kvalitāti. Standartizēta vadība ir nepieciešams nosacījums, lai nodrošinātu pastāvīgus rezultātus. Ķīnā ir steidzami jāvieno un jāstandartizē KRAS gēna klīniskā pārbaude, kā arī jāizveido standartizēta un standartizēta testēšanas programma atbilstoši dažādām vajadzībām, un šo programmu var attiecināt arī uz BRAF, PIK23450_3CA, EGFR un citi gēni, lai veicinātu klīniskās molekulārās patoloģijas testēšanu.
