Az olyan célzott gyógyszereket, mint a cetuximab és a panitumumab, széles körben alkalmazzák a klinikákon a vastag- és végbélrák hatékony terápiás gyógyszereiként. A klinikai adatok azt mutatják, hogy a KRAS-mutációval rendelkező betegeknek nincs jelentős hatása erre a monoklonális antitest-gyógyszerre, és csak a vad típusú betegek profitálhatnak belőle. Ezért a KRAS génmutációs státusz klinikailag fontos terápiás markernek számít, amely szoros összefüggésben van a vastagbélrák prognózisával és kezelési hatásával. A 2009-es National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectalis Cancer Clinical Practice Guidelines (National Cancer Comprehensive Network) kolorektális rák klinikai gyakorlati irányelvei előírják, hogy minden áttétes vastagbélrákban szenvedő betegnek ki kell mutatnia a KRAS génmutációs státuszt, és csak a KRAS vad típus javasolt EGFR célzott terápiában részesülni. Ugyanebben az évben az Amerikai Klinikai Onkológiai Társaság (ASCO) is kiadta ugyanazokat a klinikai kezelési ajánlásokat a daganatos célzott terápia molekuláris markereként, ami megmutatja annak fontos irányadó jelentőségét. Jelenleg a KRAS genetikai tesztelését széles körben végzik klinikailag. Elsősorban a hazai KRAS génmutáció kimutatási módszereket értékeljük referenciaként a klinikai szelekcióban.
1. A KRAS génmutáció pozitív aránya vastagbélrákban
A vastagbélrákban a KRAS gén mutációs rátája eléri a 35–45% -ot, és a magas kockázatú mutáció helye a 12. és 13. exon 2. és 61. kodonja, és még mindig vannak ritkák, például a 146. és a XNUMX. mutáció. webhely. Számos kimutatási módszer létezik a KRAS génmutációk számára, beleértve a közvetlen szekvenálást, a nagy felbontású olvadási görbe elemzést (HRM), a piroszekvenálást, a kvantitatív PCR-t, a mutáció-amplifikációs blokkrendszert (amplinc atio) nrefractorymutation rendszert (ARMS), a restrikciós fragmens hosszának polimorfizmusát (RFLP) polimeráz láncreakció - egyszálú konformáció polimorfizmus elemzés (PCR-szinglestrand konfomációs polimorfizmus (PCR-SSCP), ko-amplifikáció alacsonyabb denaturációs hőmérsékleten PCR (COLD-PCR) és nagy teljesítményű folyadékkromatográfia elemzés stb.
2. A KRAS mutációs detektálási módszerek értékelése
1. Közvetlen szekvenálási módszer: Ez a legklasszikusabb módszer a KRAS génmutációk kimutatására, és ez egyben a génmutációk kimutatásának arany standardja is. A dideoxiszekvenálás elvén alapuló közvetlen szekvenálási módszer leginkább intuitív módon képes megmutatni a génszekvencia változását bázis csúcstérkép formájában. A detektálás típusa átfogóbb, és ez a legkorábban alkalmazott mutációs detektálási módszer is. Az új generációs szekvenálási platformok megjelenése ellenére a hazai és külföldi tudósok továbbra is a közvetlen szekvenálás eredményeit használják skálaként az új módszer megbízhatóságának mérésére és meghatározására. Gao Jing és mtsai. Közvetlen szekvenálást alkalmazott KRAS és BRAF génmutációk kimutatására 966 vastagbélrákos betegnél. Ez egyben a KRAS génmutáció elemzése az irodalomban közölt legnagyobb hazai mintával. Ling Yun és mások úgy vélik, hogy a közvetlen szekvenálási módszer a legközvetlenebb és leghatékonyabb detektálási módszer az egyes gének mutációs állapotának megértéséhez, amely tisztázhatja a mutáció típusát, különösen az ismeretlen mutációk kimutatására. Bár ennek a módszernek az érzékenysége viszonylag alacsony, javítható olyan módszerekkel, mint például a mikrodisszekció a daganatsejtek dúsítására. A közvetlen szekvenálási módszert alkalmazták nagyobb mintanagyság KRAS kimutatására más hazai kutatócsoportokban is. A közvetlen szekvenálás legnagyobb hátránya azonban az alacsonyabb érzékenység. A Kínában beszámolt eredmények alapján a mutációk kimutatási aránya közvetlen szekvenálással nem alacsony. Liu Xiaojing és mtsai. Összehasonlítva a közvetlen szekvenálást és a peptid-nukleinsav-szorító PCR-t (PNA-PCR), és azt találtuk, hogy 43 KRAS-génmutáció esetét detektáltuk közvetlen szekvenálással. Ezen mutációk mellett a PNA-PCR-t direkt szekvenálással is kimutatták. Tíz mutációt találtak a vad típusban, és javaslatokat tettek a vad típusú betegek meghatározására PCR-rel és a közvetlen szekvenálási módszerrel a mutáns betegek meghatározására. Qiu Tian és mtsai. Fluoreszcens PCR-re optimalizált oligonukleotid próba módszerrel és közvetlen szekvenálási módszerrel detektáltunk 131 vastagbélrákos mintát, és a KRAS génmutációk pozitív aránya 41.2% (54/131) és 40.5% (53/131) volt. Bai Dongyu a különböző módszerek kimutatási érzékenységét is megvitatta. A 200 vastagbélrákos beteg közül 63-at mutattak ki RT-qPCR mutációkkal, a mutációk kimutatási aránya 31.5% volt; 169 mintát sikerült sikeresen szekvenálni 50 mutáció közvetlen szekvenálásával, a mutáció kimutatási aránya 29.6%. Bár a közvetlen szekvenálási módszer pontosan, objektíven és specifikusan képes detektálni a KRAS génmutációs státust, hiányosságai, például a magas technikai követelmények, a bonyolult működési eljárások, a keresztkontamináció könnyen kiváltható, és az eredmények időigényes és fáradságos értelmezése szintén nagyon fontos. nyilvánvaló. Gyakran nincs szekvenáló berendezés, és a mintát a megfelelő vállalatnak kell elküldeni tesztelésre, ami sokáig tart és magas költségekkel jár, ezért nagy korlátai vannak.
Piroszekvenálási módszer:
A piroszekvenálási módszer szintén kényelmesebb módszer a KRAS génmutáció kimutatására a szekvenálás érzékenysége, a kimutatási költség és a jelentésre fordított idő szempontjából. A módszer megismételhetősége jobb. A kapott csúcstérkép szerint Egy adott hely mutációs gyakoriságának kvantitatív vizsgálata és a különböző helyek mutációs gyakoriságainak összehasonlítása egy pillanat alatt világos. Az elmúlt években Ogino és mtsai, Hutchins és mtsai. Piroszekvenálási technológiát alkalmaztak a vastagbélrák nagy mintáival rendelkező betegek KRAS-mutációinak tesztelésére. Az eredmények azt mutatják, hogy a piroszekvenálási technológia hatékony eszköz a betegek célzott terápiás szűrésére. A tumor molekuláris diagnózisának széleskörű alkalmazási lehetőségei vannak. A hazai tudósok piroszekvenálási technológiát is alkalmaztak a vastagbélrák KRAS mutációinak klinikai kimutatására, jó pontossággal és megbízhatósággal. Ez a módszer jobb specifitással és nagyobb érzékenységgel rendelkezik. SundstrÖm és mtsai. Összehasonlítva az allélspecifikus PCR-t és a piróz-szekvenálást a klinikai alkalmazásokban, és azt tapasztalták, hogy 314 KRAS-mutáció esetén vastagbélrákos betegeknél a piroszekvenálás specifitása magasabb volt, mint az alléleké. PCR, és jó érzékenységgel bír az alacsony tumorsejt-tartalmú szövetek iránt. Hígítsa a daganatsejtek arányát 1.25% -ra és 2.5% -ra. A piroszekvenálás továbbra is képes detektálni a mutációs jeleket. Amikor a mintában a mutáns allélek minimális tartalmának el kell érnie a 20% -ot, hogy Sanger-szekvenálással kimutatható legyen, akkor HRM-módszerrel detektálható, amikor az eléri a 10% -ot, és a pyrosequencing-hez csak mutációkat lehet kimutatni 5% -kal. Allélek. Piros szekvenálást alkalmaztunk a KRAS mutációk kimutatására 717 vastagbélrákos betegnél, és azt találtuk, hogy a KRAS mutációk gyakorisága 40.9% volt. A 12. kodon mutációs sebessége 30.1%, a 13. kodon mutációs sebessége 9.8%, a 61 kodon mutációs sebessége pedig 1.0% volt. A tesztet megelőzően kézi mikrodisszekcióval dúsítottuk a szöveteket nagyobb daganattartalommal, így az eredmények megbízhatóbbak lettek. A módszer jó érzékenységű és specifikus, a klinikai gyakorlatban könnyen kifejleszthető. A piroszekvenálás hátránya a kimutatás magas költsége, és az egyszálú DNS előállításának folyamata a minták szekvenálásához nehézkes. A jövőben a piroszekvenálást a kettős szálú PCR-termékek közvetlen kimutatására szolgáló technológia fejlesztésére lehet fordítani, ami jelentősen leegyszerűsíti a műveletet. És hatékonyan csökkentse a szekvenálás költségeit a klinikai tesztek átfogó népszerűsítése érdekében.
3. Fegyverkezési módszer:
Ez a technológia primereket használ a vad típusú és a mutáns gének megkülönböztetésére, wh
már az 1980-as években jelentették. A módszer legnagyobb előnye, hogy érzékenysége legfeljebb 1.0%, és a mutáns géneket akár 1.0% -ban is képes kimutatni. A tervezés során a céltermék hossza a legnagyobb mértékben lerövidíthető, és az a probléma, hogy a pontos kimutatási eredmények nem érhetők el, mert a paraffinba ágyazott szövetmintából kivont DNS nagy része széttöredezett. Ez a technológia ötvözi a valós idejű PCR platformot a zárt csöves működés elérése érdekében az erősítés során. A művelet egyszerű és nem igényli a termék utólagos feldolgozását, amely a legnagyobb mértékben elkerülheti az amplifikált termék szennyeződését. Jelenleg a skorpion-ARMS módszert, amely egyesíti a skorpió szondát és az amplifikációs blokk mutációs rendszert, a világon gyakrabban használják. A két technológia kombinációja maximalizálhatja mindkét fél érzékenységét és specifitását. Gao Jie és mtsai. Ezt a módszert alkalmazta a KRAS génmutációs állapotának kimutatására 167 vastagbélrákban szenvedő betegben, ami arra utal, hogy ez a módszer megbízható és pontos. Wang Hui és mtsai. Az ARMS-t 151 formaldehid-fixált és paraffinba ágyazott szövet KRAS-mutációjának kimutatására is alkalmazták. Az Egyesült Államokban az FDA által a KRAS klinikai vizsgálatához jóváhagyott COBAS készlet (Roche) és az Európai Unió in vitro diagnosztikája (CE-IVD) által hitelesített Therascreen RGQ készlet (Qiagen) egyaránt használja az ARMS elvét. A gyakori módszerek közül az ARMS módszer a legérzékenyebb, a költségek pedig viszonylag ésszerűek. Ezért a KRAS gének itthon és külföldön történő klinikai kimutatásának nagy része az ARMS módszert használja, de mivel a módszer PCR technológiára épül, hiányossága, hogy csak Ismert hely mutációi mutathatók ki.
4. Valós idejű fluoreszcencia kvantitatív PCR módszer:
Ez egy PCR-alapú kimutatási módszer a mutáció Ct érték alapján történő meghatározására. Előnyei: erős specificitás, nagy érzékenység, pontos mennyiségi meghatározás, könnyű kezelhetőség és teljesen zárt reakció. Számos kísérleti csoport alkalmazta ezt a módszert a KRAS-mutációk kimutatására vastag- és végbélrákban. A direkt szekvenálási módszerhez képest a kvantitatív PCR nagyobb érzékenységi előnnyel rendelkezik. A két módszert összehasonlító tudósok többsége úgy véli, hogy a kvantitatív PCR érzékenyebb. Liu Wei et al. 280 vastagbélrák KRAS génmutáció, 94 KRAS génszekvenáló mutáció kimutatási eredményeinek részletes elemzése két módszerrel készült, a pozitív arány 33.57% (94/280), ebből valós idejű fluoreszcencia kvantitatív. A PCR pozitív 91 esetben 96.8%-os volt az érzékenység (91/94). A 186 génszekvenáló vad típusú esetből 184 volt negatív valós idejű kvantitatív PCR-rel, 98.9%-os specificitással (184/186). A valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR módszer és a direkt génszekvenálási módszer közötti egybeesési arány 98.2% volt. A két kimutatási módszerben az egyes mutációs helyek pozitív és negatív koincidenciája 90% felett volt, négy hely koincidenciája pedig elérte a 100%-ot. A két módszer kimutatási eredménye nagyon konzisztens volt, ami azt jelzi, hogy a fluoreszcens kvantitatív PCR Ez egy megbízhatóbb módszer a mutációk kimutatására. A PCR-alapú módszereknek azonban ismert mutációtípusok alapján kell primereket és próbákat tervezniük, így nem lehet minden lehetséges mutációt kimutatni, és csak meghatározott helyeket lehet kimutatni. Ha egy bizonyos hely nem szerepel a készlet kimutatási tartományában, még akkor is, ha valóban van mutáció, a kit eredménye továbbra is negatív. Ezen túlmenően, bár a kvantitatív PCR érzékenysége magas, még mindig ellenőrizni kell, hogy vannak-e téves pozitív eredmények DNS-szekvenálási technológiával, vagy retrospektív és prospektív klinikai kísérletekkel nagy mintamérettel, hogy megerősítsék a KRAS-mutáció állapota és a célzott kezelés hatékonysága közötti összefüggést. drogok. Ezért a mutációdetektálás nagy érzékenységét nem szabad vakon követni, miközben figyelmen kívül kell hagyni a kimutatás specifitását és pontosságát. Különböző laboratóriumi körülmények között a minták mutációinak kimutatására szolgáló optimális módszer is eltérő lehet. A nagyobb arányú mutációt tartalmazó mintáknál a Sanger szekvenálási módszer nagyobb pontosságú a génmutációk kimutatásában, míg az alacsonyabb mutációk arányú mintáknál a Sanger szekvenálási módszer Hamis negatívok fordulhatnak elő, valamint a fluoreszcens PCR-t használó kimutatási módszer technikai platformként. nagy érzékenységgel jellemezhető.
5. HRM módszer:
Ez az utóbbi években az egyik leggyakrabban használt géndetektálási módszer. Ennek előnyei az egyszerű, gyors, érzékeny és egycsövesek a szennyezés elkerülése érdekében. A klinikai vizsgálatokban való felhasználásának megvalósíthatóságának feltárása érdekében Liu Liqin és mások HRM-módszert alkalmaztak a KRAS génmutációk kimutatására 64 vastagbélrákban szenvedő betegnél, majd közvetlen szekvenálást alkalmaztak az eredmények igazolására. A HRM és a közvetlen szekvenálás eredményei konzisztensek. A közvetlen szekvenálással összehasonlítva a KRAS génmutációk HRM-mel történő kimutatása egyszerű és pontos, ami arra utal, hogy megbízható módszer alkalmas klinikai tesztelésre. Chen Zhihong et al. HRM módszerrel tesztelték a különböző arányú KRAS mutáns plazmidokat tartalmazó kevert minták sorozatát érzékenységük értékelésére. Megállapították, hogy a vegyes mintákban a plazmid mutációk aránya 10% volt, az érzékenység elérte a 10% -ot. Ezt követően a módszert a KRAS génmutációk kimutatására használták 60 vastagbélrák szövetmintában. A közvetlen szekvenálási módszerrel összehasonlítva a HRM módszer érzékenysége 100%, a specificitás 96% (43/45). A HRM módszer hátránya, hogy lehetetlen pontosan megadni a specifikus mutációtípust és azt, hogy melyik kodon mutálódott. Ha rendellenességet találunk az olvadási görbén, szekvenálási módszerre van szükség a mutáció típusának meghatározásához. A Harlé kutatócsoport 156 vastagbélrák szöveti esetet használt fel a fluoreszcens PCR, ARMS és HRM módszerek összehasonlítására. Az eredmények arra utalnak, hogy bár a három módszer alkalmas klinikai tesztelésre, a HRM megbízhatósága nem olyan jó, mint a másik két módszer.
6. Egyéb módszerek:
A fent említett módszerek mellett más detektálási módszereknek is megvannak a maguk előnyei és hátrányai az alkalmazás során, például PCR-SSCP, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, fluoreszcens PCR-re optimalizált oligonukleotid szondamódszer, Beágyazott PCR és ARMS kombináció módszere, COLD-PCR módszer, stb. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia erős specifitással rendelkezik, de a minták iránti igény nagy; A PCR-SSCP költsége alacsony és gazdaságos, de a művelet bonyolult; a fluoreszcens PCR-en alapuló mutációs detektálási technológia erős specifikussággal, nagy érzékenységgel és pontos kvantitatív, könnyű kezelhetőséggel, teljesen blokkolt reakcióval és egyéb előnyökkel rendelkezik, de mindezeknek meg kell tervezniük a primereket és a próbákat az ismert mutációs típus szerint, ezért csak meghatározott helyek lehetnek kimutatható, és az összes lehetséges mutáció nem detektálható.
3. összefoglalás
Összefoglalva, mivel a mutációk helyei és a kimutatási módszerek a különböző laboratóriumokban nem egységesek, az elemzett tumorminták mérete és a DNS-kivonás minősége is egyenetlen, ami nagy vagy kicsi kísérleti eredmények létezését eredményezi a laboratóriumok között. A KRAS génmutáció kimutatásának klinikai kimutatása számos országban aggodalomra ad okot. Jelenleg számos módszer létezik a KRAS gén mutációinak kimutatására. Az érzékenység magasról alacsonyra ARMS, piroszekvenálás, HRM, valós idejű kvantitatív PCR és közvetlen szekvenálás. A klinikai valóságból kiindulva az alacsony érzékenység nem kedvez a klinikai kezelésnek, de a túl érzékeny módszerek miatt a kimutatási specifitás csökken, és felesleges hamis pozitív eredmények is előfordulhatnak, és befolyásolhatják a beteg későbbi gyógyszeres kezelését. Figyelembe véve a fenti szempontokat, az FDA által jóváhagyott módszerrel kombinálva, az ARMS módszer ajánlott. Természetesen piaci szempontból a molekuláris diagnosztikának nem szabad hangsúlyoznia
thods, de összpontosítson a végső helyes eredményekre. A különböző laboratóriumok a tényleges helyzetnek megfelelően alkalmazhatják a megfelelő vizsgálati módszereket, de csak akkor, ha megfelelő kezelői képesítéssel és belső minőségellenőrzési rendszerrel rendelkeznek. A jelenlegi hazai laboratóriumi környezeti feltételek mellett a megbízható laboratóriumi vizsgálati minőség biztosítása érdekében szükséges a szabványosított PCR laboratóriumban végzett vizsgálatok elvégzése, valamint a hazai és nemzetközi helyiségek közötti minőségellenőrzési tevékenységekben való részvétel. A szabványosított menedzsment elengedhetetlen feltétele az állandó eredmények biztosításának. Kínában sürgősen szükség van a KRAS gén klinikai vizsgálatának egységesítésére és szabványosítására, valamint a különböző igényeknek megfelelő szabványosított és szabványosított tesztelési program létrehozására, amely kiterjeszthető a BRAF, PIK23450_3CA, EGFR, ill. egyéb gének a klinikai molekuláris patológiai vizsgálatok elősegítésére.
