Leki celowane, takie jak cetuksymab i panitumumab, są szeroko stosowane w klinice jako skuteczne leki terapeutyczne w leczeniu raka jelita grubego. Dane kliniczne pokazują, że pacjenci z mutacjami KRAS nie mają znaczącego wpływu na ten lek będący przeciwciałem monoklonalnym i jedynie pacjenci z typem dzikim mogą z niego skorzystać. Dlatego status mutacji genu KRAS jest klinicznie uważany za ważny marker terapeutyczny, który ma silną korelację z rokowaniem i efektem leczenia raka jelita grubego. Wytyczne dotyczące praktyki klinicznej raka jelita grubego opracowane przez National Cancer Comprehensive Network (NCCN) z 2009 r. stanowią, że wszyscy pacjenci z rakiem jelita grubego z przerzutami muszą wykryć status mutacji w genie KRAS, a terapię celowaną EGFR zaleca się wyłącznie dla genu KRAS typu dzikiego. W tym samym roku Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (ASCO) również wydało takie same zalecenia dotyczące leczenia klinicznego, jak marker molekularny w terapii celowanej na nowotwór, co pokazuje jego istotne znaczenie przewodnie. Obecnie badania genetyczne KRAS są szeroko stosowane klinicznie. Oceniamy głównie krajowe metody wykrywania mutacji genu KRAS jako odniesienie w selekcji klinicznej.
1. Dodatni odsetek mutacji genu KRAS w raku jelita grubego
W raku jelita grubego częstość mutacji genu KRAS sięga od 35% do 45%, a miejscem mutacji wysokiego ryzyka są kodony 12 i 13 w eksonie 2, a wciąż istnieją rzadkie, takie jak 61 i 146. Mutacja teren. Istnieje wiele metod wykrywania mutacji genu KRAS, w tym sekwencjonowanie bezpośrednie, analiza krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM), pirosekwencjonowanie, ilościowy PCR, system blokowania amplifikacji mutacji (amplinc atio), system refractorymutation (ARMS), polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), reakcja łańcuchowa polimerazy - analiza polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (polimorfizm jednoniciowej reakcji PCR (PCR-SSCP), współamplifikacja w temperaturze niższej denaturacji PCR (COLD-PCR) i wysokosprawna analiza chromatografii cieczowej itp.
2. Ocena metod wykrywania mutacji KRAS
1. Metoda bezpośredniego sekwencjonowania: Jest to najbardziej klasyczna metoda wykrywania mutacji genu KRAS, a także złoty standard wykrywania mutacji genów. Metoda bezpośredniego sekwencjonowania oparta na zasadzie sekwencjonowania dideoksy może w najbardziej intuicyjny sposób pokazać zmianę sekwencji genów w postaci mapy pików zasad. Typ wykrywania jest bardziej wszechstronny i jest również najwcześniej stosowaną metodą wykrywania mutacji. Pomimo pojawienia się platform sekwencjonowania nowej generacji, uczeni w kraju i za granicą nadal wykorzystują wyniki bezpośredniego sekwencjonowania jako skalę do pomiaru i określania wiarygodności nowej metody. Gao Jing i in. Zastosowano bezpośrednie sekwencjonowanie do wykrywania mutacji genów KRAS i BRAF u 966 pacjentów z rakiem jelita grubego. Jest to również analiza mutacji genu KRAS na podstawie największej krajowej próbki opisywanej w literaturze. Ling Yun i inni uważają, że metoda bezpośredniego sekwencjonowania jest najbardziej bezpośrednią i skuteczną metodą wykrywania pozwalającą na zrozumienie statusu mutacji każdego genu, która może wyjaśnić rodzaj mutacji, zwłaszcza w celu wykrycia nieznanych mutacji. Chociaż czułość tej metody jest stosunkowo niska, można ją poprawić metodami takimi jak mikrodysekcja w celu wzbogacenia komórek nowotworowych. Metoda bezpośredniego sekwencjonowania została również zastosowana do wykrywania KRAS w większych próbach w innych krajowych grupach badawczych. Jednak mniejsza czułość jest największą wadą bezpośredniego sekwencjonowania. Sądząc po wynikach zgłoszonych w Chinach, wskaźnik wykrywania mutacji przez bezpośrednie sekwencjonowanie nie jest niski. Liu Xiaojing i in. W porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem i PCR z klamrami peptydowego kwasu nukleinowego (PNA-PCR) i stwierdzono, że 43 przypadki mutacji genu KRAS wykryto przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Oprócz tych mutacji PNA-PCR wykryto również przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Dziesięć mutacji znaleziono w typie dzikim i zasugerowano określenie pacjentów typu dzikiego za pomocą PCR i metody bezpośredniego sekwencjonowania w celu określenia zmutowanych pacjentów. Qiu Tian i in. Wykryto 131 próbek raka jelita grubego i odbytnicy metodą fluorescencyjnej sondy oligonukleotydowej zoptymalizowanej pod kątem PCR i metodą bezpośredniego sekwencjonowania, a dodatnie wskaźniki mutacji genu KRAS wyniosły 41.2% (54/131) i 40.5% (53/131)). Bai Dongyu omówił również czułość wykrywania różnych metod. Spośród 200 pacjentów z rakiem jelita grubego 63 wykryto mutacjami RT-qPCR, a wskaźnik wykrywania mutacji wyniósł 31.5%; 169 próbek zostało z powodzeniem zsekwencjonowanych przez bezpośrednie sekwencjonowanie 50 przypadków mutacji, współczynnik wykrywania mutacji 29.6%. Chociaż metoda bezpośredniego sekwencjonowania może dokładnie, obiektywnie i konkretnie wykryć status mutacji genu KRAS, jej wady, takie jak wysokie wymagania techniczne, skomplikowane procedury operacyjne, łatwe do spowodowania zanieczyszczenia krzyżowego oraz czasochłonna i pracochłonna interpretacja wyników, są również bardzo oczywisty. Często nie ma sprzętu do sekwencjonowania, a próbkę należy przesłać do odpowiedniej firmy w celu przetestowania, co zajmuje dużo czasu i wiąże się z dużymi kosztami, więc ma duże ograniczenia.
Metoda pirosekwencjonowania:
Metoda pirosekwencjonowania jest również wygodniejszą metodą wykrywania mutacji genu KRAS pod względem czułości sekwencjonowania, kosztu wykrywania i czasu na zgłoszenie. Powtarzalność tej metody jest lepsza. Zgodnie z uzyskaną mapą pików Ilościowe badanie częstości mutacji w określonym miejscu i porównanie częstości mutacji w różnych miejscach jest już na pierwszy rzut oka jasne. W ostatnich latach Ogino i wsp., Hutchins i wsp. Wykorzystali technologię pirosekwencjonowania do testowania mutacji KRAS u pacjentów z dużymi próbkami raka jelita grubego. Wyniki wskazują, że technologia pirosekwencjonowania jest potężnym narzędziem do badań przesiewowych pacjentów pod kątem terapii celowanej. Diagnostyka molekularna nowotworów ma szerokie perspektywy zastosowania. Krajowi uczeni wykorzystali również technologię pirosekwencjonowania do klinicznego wykrywania mutacji KRAS w raku jelita grubego, z dużą dokładnością i niezawodnością. Ta metoda ma lepszą specyficzność i wyższą czułość. Sundström i in. Porównując specyficzne dla alleli PCR i pirosekwencjonowanie w zastosowaniach klinicznych i stwierdzono, że w 314 przypadkach mutacji KRAS u pacjentów z rakiem jelita grubego specyficzność pirosekwencjonowania była wyższa niż alleli. PCR i ma dobrą wrażliwość na tkanki o niskiej zawartości komórek nowotworowych. Rozcieńczyć część komórek nowotworowych do 1.25% do 2.5%. Pirosekwencjonowanie może nadal wykrywać sygnały mutacji. Gdy minimalna zawartość zmutowanych alleli w próbce musi osiągnąć 20%, aby została wykryta przez sekwencjonowanie Sangera, można ją wykryć metodą HRM, gdy osiągnie 10%, a dla pirosekwencjonowania tylko mutacje można wykryć z 5%. Allele. Zastosowaliśmy pirosekwencjonowanie do wykrycia mutacji KRAS u 717 pacjentów z rakiem jelita grubego i stwierdziliśmy, że częstość występowania mutacji KRAS wynosiła 40.9%. Częstość mutacji kodonu 12 wynosiła 30.1%, częstość mutacji kodonu 13 wynosiła 9.8%, a częstość mutacji kodonu 61 wynosiła 1.0%. Wzbogaciliśmy tkanki o wyższej zawartości guza poprzez ręczną mikrodysekcję przed badaniem, dzięki czemu wyniki są bardziej wiarygodne. Metoda ma dobrą czułość i swoistość oraz jest łatwa do opracowania w praktyce klinicznej. Wadą pirosekwencjonowania jest wysoki koszt wykrywania, a proces przygotowania jednoniciowego DNA do sekwencjonowania próbek jest uciążliwy. W przyszłości pirosekwencjonowanie można poświęcić na rozwój technologii bezpośredniego wykrywania dwuniciowych produktów PCR, co znacznie uprości operację. I skutecznie obniżaj koszty sekwencjonowania, aby uzyskać wszechstronną promocję testów klinicznych.
3. Metoda ARMS:
Ta technologia wykorzystuje startery do rozróżnienia genów typu dzikiego od zmutowanych, wh
zostały zgłoszone już w latach 1980-tych XX wieku. Największą zaletą tej metody jest to, że ma czułość do 1.0% i może wykrywać zmutowane geny w próbkach już od 1.0%. W projektowaniu długość produktu docelowego może zostać w największym stopniu skrócona, a problem polega na tym, że nie można uzyskać dokładnych wyników wykrywania, ponieważ większość DNA ekstrahowanego z próbki tkanki zatopionej w parafinie jest fragmentaryczna. Technologia ta łączy platformę PCR w czasie rzeczywistym w celu uzyskania pracy w zamkniętej probówce podczas amplifikacji. Operacja jest prosta i nie wymaga dalszej obróbki produktu, co pozwala w największym stopniu uniknąć zanieczyszczenia amplifikowanego produktu. Obecnie metoda skorpion-ARMS łącząca sondę skorpiona z systemem mutacji blokowej amplifikacji jest coraz powszechniej stosowana na świecie. Połączenie tych dwóch technologii może zmaksymalizować czułość i specyficzność obu stron. Gao Jie i in. Zastosowano tę metodę do wykrycia statusu mutacji genu KRAS u 167 pacjentów z rakiem jelita grubego, co sugeruje, że ta metoda jest wiarygodna i dokładna. Wang Hui i in. Wykorzystano również ARMS do wykrycia mutacji KRAS w 151 przypadkach tkanek utrwalonych w formaldehydzie i zatopionych w parafinie. W Stanach Zjednoczonych zestaw COBAS (Roche) zatwierdzony przez FDA do badań klinicznych KRAS oraz zestaw Therascreen RGQ (Qiagen) certyfikowany przez Unię Europejską w diagnostyce in vitro (CE-IVD) wykorzystują zasadę ARMS. Spośród powszechnych metod metoda ARMS jest najbardziej wrażliwa, a koszt jest stosunkowo rozsądny. Dlatego duża część klinicznego wykrywania genów KRAS w kraju i za granicą wykorzystuje metodę ARMS, ale ponieważ metoda ta jest oparta na technologii PCR, jej wadą jest to, że można ją wykryć tylko w znanych mutacjach miejscowych.
4. Metoda ilościowego PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym:
Jest to metoda wykrywania oparta na PCR, służąca do określenia mutacji na podstawie wartości Ct. Ma zalety dużej specyficzności, wysokiej czułości, dokładnego oznaczania ilościowego, łatwej obsługi i całkowicie zamkniętej reakcji. Wiele grup eksperymentalnych przyjęło tę metodę do wykrywania mutacji KRAS w raku jelita grubego. W porównaniu z metodą bezpośredniego sekwencjonowania, ilościowa PCR ma większą czułość. Większość badaczy porównujących te dwie metody uważa, że ilościowa PCR jest bardziej czuła. Liu Wei i in. Zastosowano dwie metody w celu szczegółowej analizy wyników wykrywania 280 przypadków mutacji genu KRAS raka jelita grubego i 94 przypadków mutacji sekwencjonowania genu KRAS, odsetek dodatni wyniósł 33.57% (94/280), z czego ilościowa fluorescencja w czasie rzeczywistym PCR dał wynik pozytywny. 91 przypadków miało czułość 96.8% (91/94). Spośród 186 przypadków sekwencjonowania genów typu dzikiego 184 dało wynik negatywny w ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym, ze swoistością 98.9% (184/186). Współczynnik zbieżności pomiędzy ilościową metodą PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym a metodą bezpośredniego sekwencjonowania genów wyniósł 98.2%. W przypadku obu metod wykrywania współczynniki zbieżności dodatniej i ujemnej w każdym miejscu mutacji przekraczały 90%, a współczynnik zbieżności czterech miejsc osiągnął 100%. Wyniki wykrywania obiema metodami były bardzo spójne, co wskazywało na fluorescencyjną ilościową reakcję PCR. Jest to bardziej niezawodna metoda wykrywania mutacji. Jednakże metody oparte na PCR wymagają projektowania starterów i sond w oparciu o znane typy mutacji, tak aby nie można było wykryć wszystkich możliwych mutacji, a jedynie określone miejsca. Jeśli określone miejsce nie znajduje się w zakresie wykrywania zestawu, nawet jeśli w rzeczywistości występuje mutacja, wynik zestawu jest nadal ujemny. Ponadto, chociaż czułość ilościowej reakcji PCR jest wysoka, w dalszym ciągu należy zweryfikować, czy występują fałszywe pozytywne wyniki za pomocą technologii sekwencjonowania DNA lub retrospektywnych i prospektywnych eksperymentów klinicznych z dużymi próbkami w celu potwierdzenia korelacji między statusem mutacji KRAS a skutecznością ukierunkowanych terapii. narkotyki . Dlatego też nie należy dążyć do wysokiej czułości wykrywania mutacji na ślepo, pomijając swoistość i dokładność wykrywania. W różnych warunkach laboratoryjnych optymalna metoda wykrywania mutacji w próbkach może być również inna. W przypadku próbek z większym odsetkiem mutacji metoda sekwencjonowania Sangera charakteryzuje się większą dokładnością w wykrywaniu mutacji genów, natomiast w przypadku próbek z mniejszym odsetkiem mutacji metoda sekwencjonowania Sangera może spowodować wystąpienie fałszywie ujemnych wyników, a metodą detekcji wykorzystującą fluorescencyjny PCR jako platformę techniczną może charakteryzować się dużą wrażliwością.
5. Metoda HRM:
Jest to jedna z częściej stosowanych metod wykrywania genów w ostatnich latach. Ma zalety prostej, szybkiej, czułej i pojedynczej rurki, aby uniknąć zanieczyszczenia. W celu zbadania możliwości jego wykorzystania w badaniach klinicznych, Liu Liqin i inni wykorzystali metodę HRM do wykrycia mutacji genu KRAS u 64 pacjentów z rakiem jelita grubego, a następnie zastosowali bezpośrednie sekwencjonowanie w celu zweryfikowania wyników. Stwierdzono, że wyniki HRM i bezpośredniego sekwencjonowania są spójne. W porównaniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim, wykrywanie mutacji genu KRAS za pomocą HRM jest proste i dokładne, co sugeruje, że jest to wiarygodna metoda odpowiednia do badań klinicznych. Chen Zhihong i in. Zastosowano metodę HRM do przetestowania serii mieszanych próbek zawierających różne proporcje zmutowanych plazmidów KRAS w celu oceny ich czułości. Stwierdzono, że udział mutacji plazmidów w mieszanych próbkach wynosił 10%, a czułość sięgała 10%. Następnie metodę zastosowano do wykrycia mutacji genu KRAS w 60 próbkach tkanki raka jelita grubego. W porównaniu z metodą sekwencjonowania bezpośredniego czułość metody HRM wyniosła 100%, a swoistość 96% (43/45). Wadą metody HRM jest to, że nie można dokładnie określić konkretnego typu mutacji i tego, który kodon jest zmutowany. W przypadku stwierdzenia nieprawidłowości na krzywej topnienia, do określenia typu mutacji potrzebna jest metoda sekwencjonowania. Grupa badawcza Harlé wykorzystała 156 przypadków raka jelita grubego do porównania fluorescencyjnych metod PCR, ARMS i HRM. Wyniki sugerują, że chociaż te trzy metody są odpowiednie do badań klinicznych, wiarygodność HRM nie jest tak dobra, jak pozostałe dwie metody.
6. Inne metody:
Oprócz wyżej wymienionych metod, inne metody wykrywania mają swoje zalety i wady w zastosowaniu, takie jak PCR-SSCP, wysokosprawna chromatografia cieczowa, metoda fluorescencyjnej sondy oligonukleotydowej zoptymalizowana pod kątem PCR, metoda zagnieżdżonego PCR i kombinacji ARMS, COLD-PCR metoda itp. Wysokosprawna chromatografia cieczowa ma dużą specyficzność, ale zapotrzebowanie na próbki jest duże; PCR-SSCP jest tani i ekonomiczny, ale operacja jest skomplikowana; technologia wykrywania mutacji oparta na fluorescencyjnym PCR ma silną specyficzność, wysoką czułość i dokładność ilościową, łatwą obsługę, w pełni zablokowaną reakcję i inne zalety, ale wszyscy muszą zaprojektować startery i sondy zgodnie ze znanym typem mutacji, aby można było wykryto i nie można wykryć wszystkich możliwych mutacji.
3. Streszczenie
Podsumowując, ponieważ miejsca mutacji i metody wykrywania w różnych laboratoriach nie są jednolite, rozmiar analizowanych próbek guza i jakość ekstrakcji DNA są również nierówne, co skutkuje występowaniem dużych lub małych wyników eksperymentów między laboratoriami.Różnice, standaryzacja wykrywanie mutacji genu KRAS stało się problemem wykrywania klinicznego w różnych krajach. Obecnie istnieje wiele metod wykrywania mutacji w genie KRAS. Czułość od wysokiej do niskiej to ARMS, pirosekwencjonowanie, HRM, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i bezpośrednie sekwencjonowanie. Z rzeczywistości klinicznej niska czułość nie sprzyja leczeniu klinicznemu, ale zbyt czułe metody spowodują spadek specyficzności wykrywania, a niepotrzebne wyniki fałszywie dodatnie mogą wpłynąć na dalszy schemat leczenia pacjenta. Biorąc pod uwagę powyższe aspekty, w połączeniu z metodą zatwierdzoną przez FDA, rekomendowana jest metoda ARMS. Oczywiście z punktu widzenia rynku diagnostyka molekularna nie powinna mnie podkreślać
thods, ale skup się na końcowych poprawnych wynikach. Różne laboratoria mogą przyjąć odpowiednie metody badawcze w zależności od rzeczywistej sytuacji, ale tylko wtedy, gdy mają dobre kwalifikacje operatorów i wewnętrzne systemy kontroli jakości. W obecnych warunkach środowiskowych laboratorium krajowego konieczne jest przeprowadzanie testów w wystandaryzowanym laboratorium PCR oraz uczestnictwo w krajowych i międzynarodowych działaniach kontroli jakości między pomieszczeniami, aby zapewnić wiarygodną jakość badań laboratoryjnych. Standaryzacja zarządzania jest warunkiem koniecznym do zapewnienia stałych wyników. W Chinach istnieje pilna potrzeba ujednolicenia i standaryzacji badań klinicznych genu KRAS oraz stworzenia wystandaryzowanego i wystandaryzowanego programu badań zgodnie z różnymi potrzebami, a program ten można rozszerzyć o wykrywanie BRAF, PIK23450_3CA, EGFR i inne geny w celu promowania klinicznych testów patologii molekularnej.
