Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Den positive frekvensen av KRAS-genmutasjon i tykktarmskreft
I kolorektal kreft er mutasjonsraten til KRAS-genet så høy som 35% til 45%, og høyrisiko-mutasjonsstedet er kodon 12 og 13 på exon 2, og det er fremdeles sjeldne som 61 og 146. Mutasjon nettstedet. Det er mange påvisningsmetoder for KRAS-genmutasjoner, inkludert direkte sekvensering, høyoppløselig smeltekurveanalyse (HRM), pyrosekvensering, kvantitativ PCR, mutasjonsforsterkningsblokksystem (amplink atio) nrefraktorisk mutasjonssystem (ARMS), begrensningsfragmentlengde polymorfisme (RFLP), polymerasekjedereaksjon-enkeltstrengs konformasjons polymorfismeanalyse (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), ko-amplifikasjon ved lavere denatureringstemperatur PCR (COLD-PCR) og høyytelses væskekromatografianalyse, etc.
2. Evaluering av KRAS-mutasjonsdeteksjonsmetoder
1. Direkte sekvenseringsmetode: Det er den mest klassiske metoden for å oppdage KRAS-genmutasjoner, og det er også gullstandarden for påvisning av genmutasjoner. Den direkte sekvenseringsmetoden basert på prinsippet om dideoxy-sekvensering kan mest intuitivt vise endringen av gensekvensen i form av basetoppkart. Deteksjonstypen er mer omfattende, og det er også den tidligste anvendte mutasjonsdeteksjonsmetoden. Til tross for fremveksten av nye generasjons sekvenseringsplattformer, bruker forskere i inn- og utland fortsatt resultatene av direkte sekvensering som en skala for å måle og bestemme påliteligheten til den nye metoden. Gao Jing et al. Brukte direkte sekvensering til påvisning av KRAS- og BRAF-genmutasjoner hos 966 pasienter med kolorektal kreft. Dette er også analysen av KRAS-genmutasjonen med den største innenlandske prøven rapportert i litteraturen. Ling Yun og andre mener at metoden med direkte sekvensering er den mest direkte og effektive deteksjonsmetoden for å forstå mutasjonsstatusen til hvert gen, noe som kan avklare mutasjonstypen, spesielt for påvisning av ukjente mutasjoner. Selv om følsomheten til denne metoden er relativt lav, kan den forbedres ved hjelp av metoder som mikrodisseksjon for å berike tumorceller. Den direkte sekvenseringsmetoden har også blitt brukt på KRAS-påvisning av større prøvestørrelser i andre innenlandske forskningsgrupper. Imidlertid er lavere følsomhet den største ulempen ved direkte sekvensering. Bedømt ut fra resultatene rapportert i Kina er mutasjonsdeteksjonsgraden ved direkte sekvensering ikke lav. Liu Xiaojing et al. Sammenlignet direkte sekvensering og peptidnukleinsyreklemme PCR (PNA-PCR) og fant at 43 tilfeller av KRAS-genmutasjoner ble påvist ved direkte sekvensering. I tillegg til disse mutasjonene ble PNA-PCR også påvist ved direkte sekvensering. Ti mutasjoner ble funnet i villtypen, og forslag ble gitt for å bestemme villtypepasientene ved PCR og den direkte sekvenseringsmetoden for å bestemme mutantpasientene. Qiu Tian et al. Detekterte 131 kolorektal kreftprøver ved hjelp av fluorescerende PCR-optimalisert oligonukleotid-probe-metode og direkte sekvenseringsmetode, og de positive frekvensene av KRAS-genmutasjoner var 41.2% (54/131) og 40.5% (53/131)). Bai Dongyu diskuterte også deteksjonsfølsomheten til forskjellige metoder. Av de 200 kolorektale kreftpasientene ble 63 påvist ved RT-qPCR-mutasjoner, og mutasjonsdeteksjonsgraden var 31.5%; 169 prøver ble vellykket sekvensert av direkte sekvensering 50 tilfeller av mutasjon, mutasjonsdeteksjonsrate 29.6%. Selv om den direkte sekvenseringsmetoden kan oppdage KRAS-genmutasjonsstatusen nøyaktig, objektivt og spesifikt, er dens mangler som høye tekniske krav, kompliserte operasjonsprosedyrer, enkle å forårsake krysskontaminering og tidkrevende og arbeidskrevende tolkning av resultatene også veldig åpenbart. Ofte er det ikke noe sekvenseringsutstyr, og prøven må sendes til det aktuelle selskapet for testing, noe som tar lang tid og har høye kostnader, så det har store begrensninger.
Pyrosekvenseringsmetode:
Pyrosekvenseringsmetoden er også en mer praktisk metode for KRAS-genmutasjonsdeteksjon når det gjelder sekvenseringsfølsomhet, deteksjonskostnad og tid til å rapportere. Repeterbarheten til denne metoden er bedre. I følge det oppnådde toppkartet Den kvantitative studien av mutasjonsfrekvensen til et bestemt sted og sammenligningen mellom mutasjonsfrekvensene til forskjellige steder er tydelig med et øyeblikk. De siste årene har Ogino et al., Hutchins et al. Har brukt pyrosekvenseringsteknologi for å teste KRAS-mutasjoner hos pasienter med store prøver av kolorektal kreft. Resultatene indikerer at pyrosekvenseringsteknologi er et kraftig verktøy for screening av pasienter for målrettet terapi. Tumormolekylær diagnose har store bruksområder. Innenlandske forskere har også brukt pyrosekvenseringsteknologi for å klinisk oppdage KRAS-mutasjoner i tykktarmskreft, med god nøyaktighet og pålitelighet. Denne metoden har bedre spesifisitet og høyere følsomhet. SundstrÖm et al. Sammenlignet allelspesifikk PCR og pyrosekvensering i kliniske applikasjoner og fant at i 314 tilfeller av KRAS-mutasjoner hos pasienter med kolorektal kreft, var spesifisiteten til pyrosekvensering bedre enn for alleler. PCR, og har god følsomhet for vev med lavt tumorinnhold. Fortynn andelen tumorceller til 1.25% til 2.5%. Pyrosekvensering kan fremdeles oppdage mutasjonssignaler. Når minimumsinnholdet av mutante alleler i prøven må nå 20% for å bli oppdaget av Sanger-sekvensering, kan det påvises ved hjelp av HRM-metoden når den når 10%, og for pyrosekvensering kan bare mutasjoner oppdages med 5%. Alleler. Vi brukte pyrosekvensering for å oppdage KRAS-mutasjoner hos 717 pasienter med tykktarmskreft og fant at frekvensen av KRAS-mutasjoner var 40.9%. Mutasjonsraten for kodon 12 var 30.1%, mutasjonshastigheten for kodon 13 var 9.8%, og mutasjonsraten for kodon 61 var 1.0%. Vi beriket vevene med høyere tumorinnhold ved manuell mikrodisseksjon før testing, noe som gjør resultatene mer pålitelige. Metoden har god sensitivitet og spesifisitet, og er enkel å utvikle i klinisk praksis. Ulempen med pyrosekvensering er de høye kostnadene ved påvisning, og prosessen med å fremstille enkeltstrenget DNA for sekvenseringsprøver er tungvint. I fremtiden kan pyrosekvensering vies til utvikling av teknologi for direkte deteksjon av dobbeltstrengede PCR-produkter, noe som i stor grad vil forenkle driften. Og effektivt redusere kostnadene ved sekvensering for å oppnå omfattende markedsføring av klinisk testing.
3. ARMS-metode:
Denne teknologien bruker primere for å skille mellom vill-type og mutante gener, wh
som er rapportert så tidlig som på 1980-tallet. Den største fordelen med denne metoden er at den har en følsomhet på opptil 1.0% og kan oppdage mutante gener i prøver så lave som 1.0%. I design kan lengden på målproduktet forkortes i størst grad, og problemet med at nøyaktige påvisningsresultater ikke kan oppnås fordi det meste av DNA ekstrahert fra det parafininnebygde vevsprøven er fragmentert. Denne teknologien kombinerer sanntids PCR-plattformen for å oppnå drift med lukket rør under forsterkning. Operasjonen er enkel og krever ikke etterbehandling av produktet, noe som i størst grad kan unngå forurensning av det forsterkede produktet. For tiden er scorpion-ARMS-metoden som kombinerer scorpion-probe og amplifikasjonsblokkmutasjonssystem, mer vanlig brukt i verden. Kombinasjonen av de to teknologiene kan maksimere følsomheten og spesifisiteten til begge sider. Gao Jie et al. Brukte denne metoden for å oppdage KRAS-genmutasjonsstatus hos 167 pasienter med kolorektal kreft, noe som tyder på at denne metoden er pålitelig og nøyaktig. Wang Hui et al. Brukte også ARMS for å oppdage KRAS-mutasjoner i 151 tilfeller av formaldehydfiksert og parafininnebygd vev. I USA bruker COBAS-settet (Roche) godkjent av FDA for klinisk testing av KRAS og Therascreen RGQ-settet (Qiagen) sertifisert av European In In vitro Diagnostics (CE-IVD), alle ARMS-prinsippet. Blant de vanlige metodene er ARMS-metoden den mest følsomme og kostnaden er relativt rimelig. Derfor bruker en stor del av den kliniske påvisningen av KRAS-gener hjemme og i utlandet ARMS-metoden, men fordi metoden er basert på PCR-teknologi, er dens mangel at den bare kan oppdages Kjente stedsmutasjoner.
4. Sanntids fluorescens kvantitativ PCR-metode:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. HRM-metode:
Det er en av de mer brukte gendeteksjonsmetodene de siste årene. Det har fordelene med enkelt, raskt, følsomt og enkelt rør for å unngå forurensning. For å undersøke muligheten for bruk i klinisk testing, brukte Liu Liqin og andre HRM-metoden for å oppdage KRAS-genmutasjoner hos 64 pasienter med kolorektal kreft, og brukte deretter direkte sekvensering for å verifisere resultatene. Resultatene av HRM og direkte sekvensering er funnet å være konsistente. Sammenlignet med direkte sekvensering er deteksjonen av KRAS-genmutasjoner med HRM enkel og nøyaktig, noe som tyder på at det er en pålitelig metode som er egnet for klinisk testing. Chen Zhihong et al. Brukte HRM-metoden for å teste en serie blandede prøver som inneholder forskjellige proporsjoner av KRAS-mutante plasmider for å evaluere følsomheten. Det ble funnet at andelen plasmidmutasjoner i de blandede prøvene var 10%, og følsomheten nådde 10%. Deretter ble metoden brukt til å oppdage KRAS-genmutasjoner i 60 tykktarmskreftvevsprøver. Sammenlignet med metoden for direkte sekvensering var følsomheten til HRM-metoden 100%, og spesifisiteten var 96% (43/45). Ulempen med HRM-metoden er at det er umulig å gi nøyaktig den spesifikke mutasjonstypen og hvilket kodon som er mutert. Hvis det oppdages en abnormitet på smeltekurven, er det nødvendig med sekvenseringsmetode for å bestemme mutasjonstypen. Forskergruppen Harlé brukte 156 tilfeller av tykktarmskreftvev for å sammenligne fluorescerende PCR-, ARMS- og HRM-metoder. Resultatene antyder at selv om de tre metodene er egnet for klinisk testing, er påliteligheten til HRM ikke like god som de to andre metodene.
6. Andre metoder:
I tillegg til de ovennevnte metodene, har andre påvisningsmetoder sine egne fordeler og ulemper i applikasjonen, som PCR-SSCP, høyytelses væskekromatografi, fluorescerende PCR-optimalisert oligonukleotid-sonemetode, Metode for nestet PCR og ARMS-kombinasjon, KALD-PCR metode osv. Høyytelses væskekromatografi har sterk spesifisitet, men etterspørselen etter prøver er stor; PCR-SSCP har lave kostnader og er økonomisk, men operasjonen er komplisert; mutasjonsdeteksjonsteknologien basert på fluorescerende PCR har sterk spesifisitet, høy følsomhet og nøyaktig kvantitativ, enkel betjening, fullstendig blokkert reaksjon og andre fordeler, men alle trenger å designe primere og sonder i henhold til den kjente mutasjonstypen, så bare spesifikke steder kan være oppdaget, og alle mulige mutasjoner kan ikke oppdages.
3. Sammendrag
Oppsummert, fordi mutasjonsstedene og påvisningsmetodene i forskjellige laboratorier ikke er ensartede, er størrelsen på tumoranalysene analysert og kvaliteten på DNA-ekstraksjon også ujevn, noe som resulterer i eksistensen av store eller små eksperimentelle resultater mellom laboratorier Forskjeller, standardiseringen av KRAS-genmutasjonsdeteksjon har blitt et klinisk påvisningsproblem som er bekymringsfullt i forskjellige land. For tiden er det mange metoder for å oppdage mutasjoner i KRAS-genet. Følsomheten fra høy til lav er ARMS, pyrosekvensering, HRM, sanntids kvantitativ PCR og direkte sekvensering. Fra den kliniske virkeligheten bidrar ikke lav følsomhet til klinisk behandling, men for følsomme metoder vil føre til at deteksjonsspesifisiteten avtar, og unødvendige falske positive resultater kan oppstå og påvirke pasientens påfølgende medisineringsregime. Tatt i betraktning de ovennevnte aspektene, kombinert med metoden godkjent av FDA, anbefales ARMS-metoden. Selvfølgelig, fra et markedsperspektiv, bør molekylær diagnostikk ikke understreke meg
thods, men fokus på de endelige riktige resultatene. Ulike laboratorier kan ta i bruk passende testmetoder i henhold til den faktiske situasjonen, men bare hvis de har gode operatørkvalifikasjoner og interne kvalitetskontrollsystemer. Under gjeldende innenlandske laboratoriemiljøforhold er det nødvendig å utføre testing i et standardisert PCR-laboratorium og delta i nasjonale og internasjonale kvalitetskontrollaktiviteter mellom rom for å sikre pålitelig laboratorietestkvalitet. Standardisert ledelse er en nødvendig forutsetning for å sikre konstante resultater. I Kina er det et presserende behov for å forene og standardisere den kliniske testingen av KRAS-genet, og å generere et standardisert og standardisert testprogram i henhold til ulike behov, og dette programmet kan utvides til påvisning av BRAF, PIK23450_3CA, EGFR og andre gener for å fremme klinisk molekylær patologitesting.
