Zielgerichtete Medikamente wie Cetuximab und Panitumumab werden in der Klinik häufig als wirksame Therapeutika gegen Darmkrebs eingesetzt. Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit KRAS-Mutationen keinen signifikanten Einfluss auf dieses monoklonale Antikörpermedikament haben und nur Wildtyp-Patienten davon profitieren können. Daher wird der Mutationsstatus des KRAS-Gens klinisch als wichtiger therapeutischer Marker angesehen, der in starkem Zusammenhang mit der Prognose und dem Behandlungseffekt von Darmkrebs steht. Die Richtlinien für die klinische Praxis des National Cancer Comprehensive Network (NCCN) für kolorektales Karzinom aus dem Jahr 2009 legen fest, dass alle Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom den KRAS-Genmutationsstatus nachweisen müssen und nur der KRAS-Wildtyp für eine zielgerichtete EGFR-Therapie empfohlen wird. Im selben Jahr gab auch die American Society of Clinical Oncology (ASCO) die gleichen klinischen Behandlungsempfehlungen als molekularer Marker für die gezielte Tumortherapie heraus, was ihre wichtige Leitbedeutung zeigt. Derzeit werden KRAS-Gentests in großem Umfang klinisch durchgeführt. Wir bewerten hauptsächlich die inländischen KRAS-Genmutationsnachweismethoden als Referenz für die klinische Auswahl.
1. Die positive Rate der KRAS-Genmutation bei Darmkrebs
Bei Darmkrebs liegt die Mutationsrate des KRAS-Gens bei 35% bis 45%, und die Mutationsstelle mit hohem Risiko sind die Codons 12 und 13 auf Exon 2, und es gibt immer noch seltene wie 61 und 146. Mutation Seite? ˅. Es gibt viele Nachweismethoden für KRAS-Genmutationen, einschließlich direkter Sequenzierung, hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (HRM), Pyrosequenzierung, quantitativer PCR, Nrefraktärmutationssystem (ARMS), Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), Polymerasekettenreaktion - Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (PCR-Singlestrand-Konfomationspolymorphismus (PCR-SSCP), Co-Amplifikation bei niedriger Denaturierungstemperatur-PCR (COLD-PCR) und Hochleistungsflüssigchromatographieanalyse usw.
2. Bewertung der KRAS-Mutationsnachweismethoden
1. Direkte Sequenzierungsmethode: Es ist die klassischste Methode zum Nachweis von KRAS-Genmutationen und der Goldstandard zum Nachweis von Genmutationen. Das direkte Sequenzierungsverfahren, das auf dem Prinzip der Didesoxy-Sequenzierung basiert, kann die Änderung der Gensequenz am intuitivsten in Form einer Basenpeakkarte zeigen. Der Detektionstyp ist umfassender und auch die früheste angewandte Mutationserkennungsmethode. Trotz des Aufkommens von Sequenzierungsplattformen der neuen Generation verwenden Wissenschaftler im In- und Ausland die Ergebnisse der direkten Sequenzierung weiterhin als Skala, um die Zuverlässigkeit der neuen Methode zu messen und zu bestimmen. Gao Jinget al. Angewandte direkte Sequenzierung zum Nachweis von KRAS- und BRAF-Genmutationen bei 966 Patienten mit Darmkrebs. Dies ist auch die Analyse der KRAS-Genmutation mit der größten in der Literatur angegebenen inländischen Probe. Ling Yun und andere glauben, dass die direkte Sequenzierungsmethode die direkteste und effektivste Nachweismethode zum Verständnis des Mutationsstatus jedes Gens ist, wodurch die Art der Mutation geklärt werden kann, insbesondere zum Nachweis unbekannter Mutationen. Obwohl die Empfindlichkeit dieses Verfahrens relativ gering ist, kann es durch Verfahren wie Mikrodissektion zur Anreicherung von Tumorzellen verbessert werden. Die direkte Sequenzierungsmethode wurde auch auf den KRAS-Nachweis größerer Probengrößen in anderen inländischen Forschungsgruppen angewendet. Eine geringere Empfindlichkeit ist jedoch der größte Nachteil der direkten Sequenzierung. Nach den in China gemeldeten Ergebnissen zu urteilen, ist die Mutationserkennungsrate durch direkte Sequenzierung nicht niedrig. Liu Xiaojinget al. Verglichen mit direkter Sequenzierung und Peptidnukleinsäure-Clamp-PCR (PNA-PCR) und fanden heraus, dass 43 Fälle von KRAS-Genmutationen durch direkte Sequenzierung nachgewiesen wurden. Zusätzlich zu diesen Mutationen wurde die PNA-PCR auch durch direkte Sequenzierung nachgewiesen. Im Wildtyp wurden zehn Mutationen gefunden, und es wurden Vorschläge gemacht, die Wildtyp-Patienten durch PCR und die direkte Sequenzierungsmethode zur Bestimmung der mutierten Patienten zu bestimmen. Qiu Tianet al. Nachweis von 131 Darmkrebs-Proben durch fluoreszenz-PCR-optimierte Oligonukleotid-Sondenmethode und direkte Sequenzierungsmethode, und die positiven Raten von KRAS-Genmutationen betrugen 41.2% (54/131) und 40.5% (53/131)). Bai Dongyu diskutierte auch die Nachweisempfindlichkeit verschiedener Methoden. Von den 200 Darmkrebspatienten wurden 63 durch RT-qPCR-Mutationen nachgewiesen, und die Mutationserkennungsrate betrug 31.5%; 169 Proben wurden erfolgreich durch direkte Sequenzierung von 50 Mutationsfällen sequenziert, Mutationserkennungsrate 29.6%. Obwohl das direkte Sequenzierungsverfahren den KRAS-Genmutationsstatus genau, objektiv und spezifisch erfassen kann, sind seine Mängel wie hohe technische Anforderungen, komplizierte Operationsverfahren, leicht zu verursachende Kreuzkontaminationen und zeitaufwändige und mühsame Interpretation der Ergebnisse ebenfalls sehr offensichtlich. Oft gibt es keine Sequenzierungsausrüstung, und die Probe muss zum Testen an das entsprechende Unternehmen gesendet werden. Dies dauert lange und ist mit hohen Kosten verbunden, sodass große Einschränkungen bestehen.
Pyrosequenzierungsmethode:
Die Pyrosequenzierungsmethode ist auch eine bequemere Methode für den Nachweis von KRAS-Genmutationen in Bezug auf Sequenzierungsempfindlichkeit, Nachweiskosten und Berichtszeit. Die Wiederholbarkeit dieser Methode ist besser. Gemäß der erhaltenen Peakkarte Die quantitative Untersuchung der Mutationshäufigkeit einer bestimmten Stelle und der Vergleich zwischen den Mutationshäufigkeiten verschiedener Stellen sind auf einen Blick klar. In den letzten Jahren haben Ogino et al., Hutchins et al. Haben die Pyrosequenzierungstechnologie verwendet, um KRAS-Mutationen bei Patienten mit großen Proben von Darmkrebs zu testen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Pyrosequenzierungstechnologie ein leistungsstarkes Instrument für das Screening von Patienten auf gezielte Therapie ist. Die molekulare Tumordiagnostik hat breite Anwendungsaussichten. Inländische Wissenschaftler haben auch die Pyrosequenzierungstechnologie verwendet, um KRAS-Mutationen bei Darmkrebs mit guter Genauigkeit und Zuverlässigkeit klinisch nachzuweisen. Diese Methode hat eine bessere Spezifität und eine höhere Empfindlichkeit. SundstrÖm et al. Im Vergleich der allelspezifischen PCR und Pyrosequenzierung in klinischen Anwendungen wurde festgestellt, dass in 314 Fällen von KRAS-Mutationen bei Darmkrebspatienten die Spezifität der Pyrosequenzierung der von Allelen überlegen war. PCR und hat eine gute Empfindlichkeit gegenüber Geweben mit geringem Tumorzellgehalt. Verdünnen Sie den Anteil der Tumorzellen auf 1.25% bis 2.5%. Pyrosequenzierung kann immer noch Mutationssignale erkennen. Wenn der Mindestgehalt an mutierten Allelen in der Probe 20% erreichen muss, um durch Sanger-Sequenzierung nachgewiesen zu werden, kann er durch die HRM-Methode nachgewiesen werden, wenn er 10% erreicht, und für die Pyrosequenzierung können nur Mutationen um 5% nachgewiesen werden. Allele. Wir verwendeten Pyrosequenzierung, um KRAS-Mutationen bei 717 Patienten mit Darmkrebs nachzuweisen, und stellten fest, dass die Häufigkeit von KRAS-Mutationen 40.9% betrug. Die Mutationsrate von Codon 12 betrug 30.1%, die Mutationsrate von Codon 13 betrug 9.8% und die Mutationsrate von Codon 61 betrug 1.0%. Wir haben die Gewebe vor dem Test durch manuelle Mikrodissektion mit einem höheren Tumorgehalt angereichert, um die Ergebnisse zuverlässiger zu machen. Die Methode weist eine gute Sensitivität und Spezifität auf und ist in der klinischen Praxis leicht zu entwickeln. Der Nachteil der Pyrosequenzierung sind die hohen Detektionskosten, und das Verfahren zur Herstellung einzelsträngiger DNA für die Sequenzierung von Proben ist umständlich. In Zukunft kann die Pyrosequenzierung der Entwicklung von Technologien zum direkten Nachweis doppelsträngiger PCR-Produkte gewidmet werden, die den Betrieb erheblich vereinfachen werden. Reduzieren Sie effektiv die Kosten für die Sequenzierung, um eine umfassende Förderung der klinischen Tests zu erreichen.
3. ARMS-Methode:
Diese Technologie verwendet Primer, um zwischen Wildtyp- und mutierten Genen zu unterscheiden
Ich wurde bereits in den 1980er Jahren gemeldet. Der größte Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine Empfindlichkeit von bis zu 1.0% aufweist und mutierte Gene in Proben von nur 1.0% nachweisen kann. Beim Design kann die Länge des Zielprodukts in höchstem Maße verkürzt werden, und das Problem, dass keine genauen Detektionsergebnisse erzielt werden können, weil der größte Teil der aus der in Paraffin eingebetteten Gewebeprobe extrahierten DNA fragmentiert ist. Diese Technologie kombiniert die Echtzeit-PCR-Plattform, um während der Amplifikation einen Betrieb mit geschlossenem Röhrchen zu erreichen. Die Bedienung ist einfach und erfordert keine Nachbearbeitung des Produkts, wodurch die Kontamination des amplifizierten Produkts weitgehend vermieden werden kann. Gegenwärtig wird die Skorpion-ARMS-Methode, die Skorpionsonde und Amplifikationsblockmutationssystem kombiniert, weltweit häufiger verwendet. Die Kombination der beiden Technologien kann die Empfindlichkeit und Spezifität beider Seiten maximieren. Gao Jie et al. Verwendete diese Methode, um den KRAS-Genmutationsstatus bei 167 Patienten mit Darmkrebs festzustellen, was darauf hindeutet, dass diese Methode zuverlässig und genau ist. Wang Hui et al. Verwendete ARMS auch zum Nachweis von KRAS-Mutationen in 151 Fällen von Formaldehyd-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben. In den USA verwenden das von der FDA für klinische Tests von KRAS zugelassene COBAS-Kit (Roche) und das von der Europäischen Union für In-Vitro-Diagnostik (CE-IVD) zertifizierte Therascreen RGQ-Kit (Qiagen) das ARMS-Prinzip. Unter den gängigen Methoden ist die ARMS-Methode die empfindlichste und die Kosten sind relativ vernünftig. Daher verwendet ein großer Teil des klinischen Nachweises von KRAS-Genen im In- und Ausland die ARMS-Methode. Da die Methode jedoch auf der PCR-Technologie basiert, besteht ihr Nachteil darin, dass nur Mutationen an bekannten Stellen nachgewiesen werden können.
4. Quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Methode:
Es handelt sich um eine PCR-basierte Nachweismethode zur Bestimmung der Mutation anhand des Ct-Werts. Es bietet die Vorteile einer starken Spezifität, einer hohen Empfindlichkeit, einer genauen Quantifizierung, einer einfachen Bedienung und einer vollständig geschlossenen Reaktion. Viele experimentelle Gruppen haben diese Methode zum Nachweis von KRAS-Mutationen bei Darmkrebs übernommen. Im Vergleich zur direkten Sequenzierungsmethode weist die quantitative PCR einen größeren Empfindlichkeitsvorteil auf. Die meisten Wissenschaftler, die die beiden Methoden vergleichen, glauben, dass die quantitative PCR empfindlicher ist. Liu Wei et al. Mit zwei Methoden wurde eine detaillierte Analyse der Nachweisergebnisse von 280 Fällen von KRAS-Genmutationen bei Darmkrebs und 94 Fällen von KRAS-Gensequenzierungsmutationen durchgeführt. Die positive Rate betrug 33.57 % (94/280), davon Echtzeit-Fluoreszenz quantitativ Die PCR war positiv, 91 Fälle hatten eine Sensitivität von 96.8 % (91/94). Von den 186 Gensequenzierungs-Wildtyp-Fällen waren 184 in der quantitativen Echtzeit-PCR negativ, mit einer Spezifität von 98.9 % (184/186). Die Übereinstimmungsrate zwischen der quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Methode und der direkten Gensequenzierungsmethode betrug 98.2 %. Bei den beiden Nachweismethoden lagen die positiven und negativen Übereinstimmungsraten jeder Mutationsstelle über 90 %, und die Übereinstimmungsrate von vier Stellen erreichte 100 %. Die Nachweisergebnisse der beiden Methoden waren sehr konsistent, was darauf hindeutet, dass es sich bei der quantitativen Fluoreszenz-PCR um eine zuverlässigere Methode zum Nachweis von Mutationen handelt. Bei PCR-basierten Methoden müssen jedoch Primer und Sonden auf der Grundlage bekannter Mutationstypen entwickelt werden, sodass nicht alle möglichen Mutationen erkannt werden können, sondern nur bestimmte Stellen. Wenn eine bestimmte Stelle nicht im Nachweisbereich des Kits enthalten ist, ist das Kit-Ergebnis auch dann negativ, wenn tatsächlich eine Mutation vorliegt. Obwohl die Empfindlichkeit der quantitativen PCR hoch ist, muss darüber hinaus noch durch DNA-Sequenzierungstechnologie oder retrospektive und prospektive klinische Experimente mit großen Probengrößen überprüft werden, ob falsch positive Ergebnisse vorliegen, um die Korrelation zwischen dem KRAS-Mutationsstatus und der Wirksamkeit der gezielten PCR zu bestätigen Drogen. Daher sollte die hohe Empfindlichkeit des Mutationsnachweises nicht blind verfolgt werden, während die Spezifität und Genauigkeit des Nachweises ignoriert werden sollten. Unter unterschiedlichen Laborbedingungen kann auch die optimale Methode zum Nachweis von Mutationen in Proben unterschiedlich sein. Bei Proben mit einem höheren Anteil an Mutationen bietet die Sanger-Sequenzierungsmethode eine höhere Genauigkeit beim Nachweis von Genmutationen, während bei Proben mit einem geringeren Anteil an Mutationen die Sanger-Sequenzierungsmethode zu falsch negativen Ergebnissen führen kann und die Nachweismethode Fluoreszenz-PCR als technische Plattform verwendet kann durch eine hohe Empfindlichkeit gekennzeichnet sein.
5. HRM-Methode:
Es ist eine der in den letzten Jahren am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von Genen. Es hat die Vorteile einer einfachen, schnellen, empfindlichen und einzelnen Röhre, um Verschmutzung zu vermeiden. Um die Machbarkeit seiner Verwendung in klinischen Tests zu untersuchen, verwendeten Liu Liqin und andere die HRM-Methode zum Nachweis von KRAS-Genmutationen bei 64 Patienten mit Darmkrebs und verwendeten dann eine direkte Sequenzierung, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Ergebnisse von HRM und direkter Sequenzierung sind konsistent. Im Vergleich zur direkten Sequenzierung ist der Nachweis von KRAS-Genmutationen durch HRM einfach und genau, was darauf hindeutet, dass es sich um eine zuverlässige Methode handelt, die für klinische Tests geeignet ist. Chen Zhihong et al. Verwendete die HRM-Methode, um eine Reihe gemischter Proben zu testen, die unterschiedliche Anteile an KRAS-Mutantenplasmiden enthielten, um ihre Empfindlichkeit zu bewerten. Es wurde gefunden, dass der Anteil der Plasmidmutationen in den gemischten Proben 10% betrug und die Empfindlichkeit 10% erreichte. Anschließend wurde das Verfahren verwendet, um KRAS-Genmutationen in 60 Darmkrebs-Gewebeproben nachzuweisen. Im Vergleich zur direkten Sequenzierungsmethode betrug die Sensitivität der HRM-Methode 100% und die Spezifität 96% (43/45). Der Nachteil der HRM-Methode besteht darin, dass es unmöglich ist, den spezifischen Mutationstyp und das mutierte Codon genau anzugeben. Wenn auf der Schmelzkurve eine Abnormalität festgestellt wird, ist eine Sequenzierungsmethode erforderlich, um den Mutationstyp zu bestimmen. Die Harlé-Forschungsgruppe verwendete 156 Fälle von Darmkrebsgewebe, um fluoreszierende PCR-, ARMS- und HRM-Methoden zu vergleichen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die drei Methoden zwar für klinische Tests geeignet sind, die Zuverlässigkeit von HRM jedoch nicht so gut ist wie bei den beiden anderen Methoden.
6. Andere Methoden:
Zusätzlich zu den oben genannten Verfahren haben andere Nachweismethoden ihre eigenen Vor- und Nachteile bei der Anwendung, wie PCR-SSCP, Hochleistungsflüssigchromatographie, fluoreszenz-PCR-optimierte Oligonukleotidsondenmethode, Methode der verschachtelten PCR und ARMS-Kombination, COLD-PCR Methode usw. Die Hochleistungsflüssigchromatographie weist eine starke Spezifität auf, aber der Bedarf an Proben ist groß. PCR-SSCP ist kostengünstig und wirtschaftlich, aber die Operation ist kompliziert; Die auf fluoreszierender PCR basierende Mutationendetektionstechnologie weist eine starke Spezifität, eine hohe Empfindlichkeit und eine genaue quantitative, einfache Bedienung, vollständig blockierte Reaktion und andere Vorteile auf. Alle müssen jedoch Primer und Sonden gemäß dem bekannten Mutationstyp entwerfen, sodass nur bestimmte Stellen vorhanden sein können erkannt, und alle möglichen Mutationen können nicht erkannt werden.
3. Zusammenfassung
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Größe der analysierten Tumorproben und die Qualität der DNA-Extraktion ungleichmäßig sind, da die Mutationsstellen und Nachweismethoden in verschiedenen Laboratorien nicht einheitlich sind, was zu großen oder kleinen experimentellen Ergebnissen zwischen Laboratorien führt. Unterschiede, die Standardisierung Der Nachweis von KRAS-Genmutationen ist in verschiedenen Ländern zu einem Problem des klinischen Nachweises geworden, das Anlass zur Sorge gibt. Derzeit gibt es viele Methoden zum Nachweis von Mutationen im KRAS-Gen. Die Empfindlichkeit von hoch nach niedrig ist ARMS, Pyrosequenzierung, HRM, quantitative Echtzeit-PCR und direkte Sequenzierung. Aus klinischer Sicht ist eine geringe Empfindlichkeit für die klinische Behandlung nicht förderlich, aber zu empfindliche Methoden führen zu einer Abnahme der Nachweisspezifität, und unnötige falsch positive Ergebnisse können auftreten und das nachfolgende Medikationsschema des Patienten beeinflussen. In Anbetracht der oben genannten Aspekte wird in Kombination mit der von der FDA zugelassenen Methode die ARMS-Methode empfohlen. Aus Marktsicht sollte mich die molekulare Diagnostik natürlich nicht hervorheben
thods, aber konzentrieren Sie sich auf die endgültigen korrekten Ergebnisse. Verschiedene Labore können entsprechend der tatsächlichen Situation geeignete Testmethoden anwenden, jedoch nur, wenn sie über gute Bedienerqualifikationen und interne Qualitätskontrollsysteme verfügen. Unter den aktuellen Laborumgebungsbedingungen im Inland ist es notwendig, Tests in einem standardisierten PCR-Labor durchzuführen und an nationalen und internationalen Qualitätskontrollaktivitäten zwischen den Räumen teilzunehmen, um eine zuverlässige Qualität der Labortests sicherzustellen. Um konstante Ergebnisse zu gewährleisten, ist ein standardisiertes Management eine notwendige Voraussetzung. In China besteht ein dringender Bedarf, die klinischen Tests des KRAS-Gens zu vereinheitlichen und zu standardisieren und ein standardisiertes und standardisiertes Testprogramm entsprechend den unterschiedlichen Anforderungen zu erstellen. Dieses Programm kann auf den Nachweis von BRAF, PIK23450_3CA, EGFR und erweitert werden andere Gene zur Förderung klinischer molekularpathologischer Tests.
