ยากำหนดเป้าหมาย เช่น cetuximab และ panitumumab มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในคลินิกในฐานะยารักษาที่มีประสิทธิภาพสำหรับมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก ข้อมูลทางคลินิกแสดงให้เห็นว่าผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ KRAS ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อยาโมโนโคลนอลแอนติบอดีนี้ และมีเพียงผู้ป่วยประเภทป่าเท่านั้นที่จะได้รับประโยชน์จากยานี้ ดังนั้นสถานะการกลายพันธุ์ของยีน KRAS จึงถือเป็นตัวบ่งชี้การรักษาที่สำคัญในทางการแพทย์ ซึ่งมีความสัมพันธ์อย่างมากกับการพยากรณ์โรคและผลการรักษาของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก แนวทางปฏิบัติทางคลินิกสำหรับมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักของเครือข่าย National Cancer Comprehensive Network (NCCN) ปี 2009 กำหนดว่าผู้ป่วยทุกรายที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่ระยะลุกลามจะต้องตรวจพบสถานะการกลายพันธุ์ของยีน KRAS และแนะนำให้ใช้ KRAS ชนิด wild เท่านั้นเพื่อรับการบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย EGFR ในปีเดียวกันนั้น American Society of Clinical Oncology (ASCO) ยังได้ออกคำแนะนำการรักษาทางคลินิกแบบเดียวกับเครื่องหมายระดับโมเลกุลสำหรับการรักษาแบบมุ่งเป้าไปที่เนื้องอก ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสำคัญที่เป็นแนวทางที่สำคัญ ปัจจุบัน การทดสอบทางพันธุกรรมของ KRAS ดำเนินการอย่างกว้างขวางในทางคลินิก เราประเมินวิธีการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในประเทศเป็นหลักเพื่อใช้อ้างอิงในการคัดเลือกทางคลินิก
1. อัตราบวกของการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก
ในมะเร็งลำไส้ใหญ่ อัตราการกลายพันธุ์ของยีน KRAS สูงถึง 35% ถึง 45% และตำแหน่งการกลายพันธุ์ที่มีความเสี่ยงสูงคือ codons 12 และ 13 ใน exon 2 และยังคงมียีนที่หายากเช่น 61 และ 146 เว็บไซต์. มีวิธีการตรวจจับหลายวิธีสำหรับการกลายพันธุ์ของยีน KRAS รวมถึงการหาลำดับโดยตรง การวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมละลายที่มีความละเอียดสูง (HRM), การจัดลำดับไพโรเซชัน, PCR เชิงปริมาณ, ระบบบล็อกการขยายการกลายพันธุ์ (amplinc atio)nระบบการหักเหของแสง (ARMS), ความแตกต่างของความยาวชิ้นส่วนที่จำกัด (RFLP), ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส - การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงรูปแบบโครงสร้างเส้นใยเดี่ยว (PCR- ความหลากหลายทางสัณฐานวิทยาของสายเดี่ยว (PCR-SSCP), การขยายร่วมที่ PCR อุณหภูมิการทำให้เสียสภาพที่ต่ำกว่า (COLD-PCR) และการวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง ฯลฯ
2. การประเมินวิธีการตรวจหาการกลายพันธุ์ของ KRAS
1. วิธีการจัดลำดับโดยตรง: เป็นวิธีการคลาสสิกที่สุดในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีน KRAS และยังเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีนอีกด้วย วิธีการจัดลำดับโดยตรงตามหลักการของการจัดลำดับของไดดีออกซีสามารถแสดงการเปลี่ยนแปลงของลำดับยีนอย่างสังหรณ์ใจที่สุดในรูปแบบของแผนผังพีคฐาน ประเภทการตรวจจับมีความครอบคลุมมากขึ้นและยังเป็นวิธีการตรวจหาการกลายพันธุ์ที่เร็วที่สุดอีกด้วย แม้จะมีการเกิดขึ้นของแพลตฟอร์มการจัดลำดับรุ่นใหม่ นักวิชาการในประเทศและต่างประเทศยังคงใช้ผลลัพธ์ของการจัดลำดับโดยตรงเป็นมาตราส่วนในการวัดและกำหนดความน่าเชื่อถือของวิธีการใหม่ เกาจิงและคณะ ใช้การจัดลำดับโดยตรงในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน KRAS และ BRAF ในผู้ป่วย 966 รายที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่ นี่เป็นการวิเคราะห์การกลายพันธุ์ของยีน KRAS ด้วยตัวอย่างในประเทศที่ใหญ่ที่สุดที่รายงานในวรรณคดี Ling Yun และคนอื่นๆ เชื่อว่าวิธีการจัดลำดับโดยตรงเป็นวิธีการตรวจจับที่ตรงและมีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับการทำความเข้าใจสถานะการกลายพันธุ์ของยีนแต่ละชนิด ซึ่งสามารถอธิบายประเภทของการกลายพันธุ์ได้ชัดเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ที่ไม่รู้จัก แม้ว่าความไวของวิธีนี้จะค่อนข้างต่ำ แต่ก็สามารถปรับปรุงได้ด้วยวิธีการต่างๆ เช่น microdissection เพื่อเสริมสร้างเซลล์เนื้องอก วิธีการหาลำดับโดยตรงยังถูกนำไปใช้กับการตรวจจับ KRAS ของขนาดตัวอย่างที่ใหญ่ขึ้นในกลุ่มการวิจัยในประเทศอื่นๆ อย่างไรก็ตาม ความไวที่ต่ำกว่านั้นเป็นข้อเสียที่ใหญ่ที่สุดของการจัดลำดับโดยตรง ตัดสินจากผลลัพธ์ที่รายงานในประเทศจีน อัตราการตรวจหาการกลายพันธุ์โดยการจัดลำดับโดยตรงไม่ต่ำ หลิวเสี่ยวจิงและคณะ เปรียบเทียบการหาลำดับโดยตรงและ PCR ของแคลมป์กรดนิวคลีอิกเปปไทด์ (PNA-PCR) และพบว่า 43 กรณีของการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ถูกตรวจพบโดยการจัดลำดับโดยตรง นอกจากการกลายพันธุ์เหล่านี้แล้ว PNA-PCR ยังตรวจพบโดยการจัดลำดับโดยตรง พบการกลายพันธุ์สิบครั้งในประเภทไวด์และมีข้อเสนอแนะเพื่อกำหนดผู้ป่วยประเภทไวด์โดย PCR และวิธีการจัดลำดับโดยตรงเพื่อกำหนดผู้ป่วยที่กลายพันธุ์ Qiu Tian และคณะ ตรวจพบตัวอย่างมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก 131 ตัวอย่างโดยวิธีโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ปรับด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์และวิธีการหาลำดับโดยตรง และอัตราบวกของการกลายพันธุ์ของยีน KRAS เท่ากับ 41.2% (54/131) และ 40.5% (53/131)) Bai Dongyu ยังกล่าวถึงความไวในการตรวจจับของวิธีการต่างๆ ในผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก 200 ราย ตรวจพบ 63 รายโดยการกลายพันธุ์ของ RT-qPCR และอัตราการตรวจหาการกลายพันธุ์เท่ากับ 31.5%; 169 ตัวอย่างถูกจัดลำดับได้สำเร็จโดยการหาลำดับโดยตรง 50 กรณีของการกลายพันธุ์ อัตราการตรวจจับการกลายพันธุ์ 29.6% แม้ว่าวิธีการจัดลำดับโดยตรงสามารถตรวจจับสถานะการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ได้อย่างแม่นยำ เป็นกลางและเฉพาะเจาะจง แต่ข้อบกพร่อง เช่น ข้อกำหนดทางเทคนิคระดับสูง ขั้นตอนการดำเนินงานที่ซับซ้อน ง่ายต่อการทำให้เกิดการปนเปื้อนข้าม และการตีความผลลัพธ์ที่ใช้เวลานานและลำบากก็เช่นกัน ชัดเจน. บ่อยครั้งไม่มีอุปกรณ์จัดลำดับ และตัวอย่างต้องถูกส่งไปยังบริษัทที่เกี่ยวข้องเพื่อทำการทดสอบ ซึ่งใช้เวลานานและมีค่าใช้จ่ายสูง ดังนั้นจึงมีข้อจำกัดอย่างมาก
วิธีการ Pyrosequencing:
วิธีการ Pyrosequencing เป็นวิธีที่สะดวกกว่าสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในแง่ของความไวในการจัดลำดับ ค่าใช้จ่ายในการตรวจจับ และเวลาในการรายงาน ความสามารถในการทำซ้ำของวิธีนี้จะดีกว่า ตามแผนที่สูงสุดที่ได้รับ การศึกษาเชิงปริมาณของความถี่การกลายพันธุ์ของไซต์บางแห่งและการเปรียบเทียบระหว่างความถี่การกลายพันธุ์ของไซต์ต่างๆ มีความชัดเจนในทันที ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา Ogino et al., Hutchins et al. ได้ใช้เทคโนโลยี pyrosequencing เพื่อทดสอบการกลายพันธุ์ของ KRAS ในผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่ที่มีตัวอย่างขนาดใหญ่ ผลการวิจัยระบุว่าเทคโนโลยีไพโรซิเควนซ์เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการตรวจคัดกรองผู้ป่วยสำหรับการรักษาแบบตรงเป้าหมาย การวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเนื้องอกมีแนวโน้มการใช้งานในวงกว้าง นักวิชาการในประเทศยังได้ใช้เทคโนโลยี pyrosequencing เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของ KRAS ในมะเร็งลำไส้ใหญ่ด้วยความแม่นยำและความน่าเชื่อถือที่ดี วิธีนี้มีความจำเพาะและความไวสูงกว่า SundstrÖm และคณะ เมื่อเปรียบเทียบ PCR ที่จำเพาะต่ออัลลีลิกและไพโรเซเควนซิ่งในการใช้งานทางคลินิก และพบว่าใน 314 กรณีของการกลายพันธุ์ของ KRAS ในผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก ความจำเพาะของไพโรซิเควนซิ่งเหนือกว่าอัลลีล PCR และมีความไวต่อเนื้อเยื่อที่มีเซลล์เนื้องอกต่ำ เจือจางสัดส่วนของเซลล์เนื้องอกเป็น 1.25% ถึง 2.5% Pyrosequencing ยังสามารถตรวจจับสัญญาณการกลายพันธุ์ได้ เมื่อเนื้อหาขั้นต่ำของอัลลีลที่กลายพันธุ์ในตัวอย่างต้องถึง 20% เพื่อตรวจพบโดยการจัดลำดับแซงเจอร์ จะสามารถตรวจพบได้โดยวิธี HRM เมื่อถึง 10% และสำหรับการไพโรซิเควนซิ่งเพียงการกลายพันธุ์เท่านั้นที่สามารถตรวจพบได้ 5% อัลลีล เราใช้ pyrosequencing เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของ KRAS ในผู้ป่วย 717 รายที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก และพบว่าความถี่ของการกลายพันธุ์ของ KRAS เท่ากับ 40.9% อัตราการกลายพันธุ์ของ codon 12 คือ 30.1% อัตราการกลายพันธุ์ของ codon 13 คือ 9.8% และอัตราการกลายพันธุ์ของ codon 61 เท่ากับ 1.0% เราเพิ่มคุณค่าให้กับเนื้อเยื่อที่มีเนื้อหาเนื้องอกที่สูงขึ้นด้วย microdissection แบบแมนนวลก่อนทำการทดสอบ ทำให้ผลลัพธ์มีความน่าเชื่อถือมากขึ้น วิธีการนี้มีความไวและความจำเพาะที่ดีและง่ายต่อการพัฒนาในการปฏิบัติทางคลินิก ข้อเสียของ pyrosequencing คือค่าใช้จ่ายในการตรวจหาที่สูง และกระบวนการในการเตรียม DNA แบบสายเดี่ยวสำหรับการจัดลำดับตัวอย่างนั้นยุ่งยาก ในอนาคต ไพโรเควนซิ่งสามารถทุ่มเทให้กับการพัฒนาเทคโนโลยีสำหรับการตรวจจับผลิตภัณฑ์ PCR แบบสองสายโดยตรง ซึ่งจะทำให้การดำเนินการง่ายขึ้นอย่างมาก และลดต้นทุนการจัดลำดับได้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อให้เกิดการส่งเสริมการทดสอบทางคลินิกอย่างครอบคลุม
3. วิธี ARMS:
เทคโนโลยีนี้ใช้ไพรเมอร์เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างยีนป่าและยีนกลายพันธุ์ wh
ich ได้รับรายงานตั้งแต่ช่วงปี 1980 ข้อได้เปรียบที่ใหญ่ที่สุดของวิธีนี้คือมีความไวสูงถึง 1.0% และสามารถตรวจจับยีนกลายพันธุ์ในตัวอย่างได้ต่ำถึง 1.0% ในการออกแบบ ความยาวของผลิตภัณฑ์เป้าหมายสามารถสั้นลงได้มากที่สุด และปัญหาที่ไม่สามารถหาผลการตรวจจับที่แม่นยำได้ เนื่องจาก DNA ส่วนใหญ่ที่สกัดจากตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ฝังด้วยพาราฟินนั้นกระจัดกระจาย เทคโนโลยีนี้รวมแพลตฟอร์ม PCR แบบเรียลไทม์เพื่อให้การทำงานของหลอดปิดในระหว่างการขยายสัญญาณ การดำเนินการนั้นเรียบง่ายและไม่ต้องการกระบวนการหลังการแปรรูปของผลิตภัณฑ์ ซึ่งสามารถหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์ที่ขยายเสียงได้ในระดับสูงสุด ในปัจจุบัน วิธีการ scorpion-ARMS ที่รวมโพรบแมงป่องและระบบการกลายพันธุ์ของบล็อกขยายกำลังเป็นที่นิยมใช้กันมากในโลก การรวมกันของเทคโนโลยีทั้งสองสามารถเพิ่มความไวและความจำเพาะของทั้งสองฝ่ายได้สูงสุด Gao Jie และคณะ ใช้วิธีนี้เพื่อตรวจหาสถานะการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในผู้ป่วย 167 รายที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก ซึ่งแสดงให้เห็นว่าวิธีนี้เชื่อถือได้และแม่นยำ วังฮุยและคณะ นอกจากนี้ยังใช้ ARMS เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของ KRAS ใน 151 กรณีของเนื้อเยื่อที่ตรึงฟอร์มาลดีไฮด์และเนื้อเยื่อที่ฝังด้วยพาราฟิน ในสหรัฐอเมริกา ชุด COBAS (โรช) ที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA สำหรับการทดสอบทางคลินิกของ KRAS และชุด Therascreen RGQ (Qiagen) ที่รับรองโดย European Union In Vitro Diagnostics (CE-IVD) ล้วนใช้หลักการ ARMS ในบรรดาวิธีการทั่วไป วิธี ARMS เป็นวิธีที่ละเอียดอ่อนที่สุดและมีราคาค่อนข้างสมเหตุสมผล ดังนั้นการตรวจหายีน KRAS ทางคลินิกในประเทศและต่างประเทศส่วนใหญ่จึงใช้วิธี ARMS แต่เนื่องจากวิธีการดังกล่าวใช้เทคโนโลยี PCR ข้อบกพร่องของวิธีนี้คือตรวจพบได้เฉพาะการกลายพันธุ์ของไซต์ที่รู้จักเท่านั้น
4. วิธี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์:
เป็นวิธีการตรวจจับที่ใช้ PCR เพื่อระบุการกลายพันธุ์ด้วยค่า Ct มีข้อดีคือมีความจำเพาะสูง ความไวสูง ปริมาณที่แม่นยำ ใช้งานง่าย และปฏิกิริยาปิดสนิท กลุ่มทดลองจำนวนมากได้นำวิธีนี้มาใช้ในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของ KRAS ในมะเร็งลำไส้ใหญ่ เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการจัดลำดับโดยตรง PCR เชิงปริมาณจะมีข้อได้เปรียบด้านความไวมากกว่า นักวิชาการส่วนใหญ่เปรียบเทียบทั้งสองวิธีเชื่อว่า PCR เชิงปริมาณมีความละเอียดอ่อนมากกว่า หลิว เว่ย และคณะ ใช้สองวิธีเพื่อทำการวิเคราะห์โดยละเอียดเกี่ยวกับผลการตรวจพบผู้ป่วยการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่จำนวน 280 ราย, การกลายพันธุ์ของลำดับยีน KRAS จำนวน 94 ราย อัตราบวกอยู่ที่ 33.57% (94/280) ซึ่งในจำนวนดังกล่าวเป็นเชิงปริมาณการเรืองแสงแบบเรียลไทม์ PCR เป็นบวก 91 ราย มีความไว 96.8% (91/94) ในกรณีของการจัดลำดับยีน 186 กรณีที่เป็นประเภท wild มี 184 กรณีที่ให้ผลลบโดย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ โดยมีความจำเพาะที่ 98.9% (184/186) อัตราความบังเอิญระหว่างวิธี PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์กับวิธีจัดลำดับยีนโดยตรงคือ 98.2% ในวิธีการตรวจจับทั้งสองวิธี อัตราความบังเอิญทั้งเชิงบวกและเชิงลบของแต่ละตำแหน่งการกลายพันธุ์นั้นสูงกว่า 90% และอัตราความบังเอิญของสี่ตำแหน่งนั้นสูงถึง 100% ผลการตรวจจับของทั้งสองวิธีมีความสอดคล้องกันสูง ซึ่งบ่งชี้ถึง PCR เชิงปริมาณเรืองแสง ซึ่งเป็นวิธีการที่เชื่อถือได้มากกว่าสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ใช้ PCR จำเป็นต้องออกแบบไพรเมอร์และโพรบตามประเภทการกลายพันธุ์ที่ทราบ ดังนั้นจึงไม่สามารถตรวจพบการกลายพันธุ์ที่เป็นไปได้ทั้งหมด และสามารถตรวจพบได้เฉพาะบางตำแหน่งเท่านั้น หากไซต์บางแห่งไม่รวมอยู่ในระยะการตรวจจับของชุดอุปกรณ์ แม้ว่าจะมีการกลายพันธุ์จริง ๆ แต่ผลลัพธ์ของชุดก็ยังคงเป็นลบ นอกจากนี้ แม้ว่าความไวของ PCR เชิงปริมาณจะสูง แต่ไม่ว่าจะมีผลบวกลวงยังคงต้องได้รับการตรวจสอบโดยเทคโนโลยีการจัดลำดับ DNA หรือการทดลองทางคลินิกแบบย้อนหลังและในอนาคตด้วยขนาดตัวอย่างขนาดใหญ่เพื่อยืนยันความสัมพันธ์ระหว่างสถานะการกลายพันธุ์ของ KRAS และประสิทธิภาพของเป้าหมาย ยาเสพติด ดังนั้นจึงไม่ควรติดตามความไวสูงของการตรวจจับการกลายพันธุ์โดยสุ่มสี่สุ่มห้า ในขณะที่ควรมองข้ามความจำเพาะและความแม่นยำของการตรวจจับ ภายใต้สภาวะห้องปฏิบัติการที่แตกต่างกัน วิธีการที่เหมาะสมที่สุดในการตรวจหาการกลายพันธุ์ในสิ่งส่งตรวจอาจแตกต่างกันด้วย สำหรับตัวอย่างที่มีสัดส่วนการกลายพันธุ์ที่สูงกว่า วิธีการเรียงลำดับแซงเจอร์จะมีความแม่นยำมากกว่าในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีน ในขณะที่ตัวอย่างที่มีสัดส่วนการกลายพันธุ์ที่ต่ำกว่า วิธีการเรียงลำดับแซงเจอร์อาจเกิดผลลบลวง และวิธีการตรวจจับโดยใช้ PCR เรืองแสงเป็นแพลตฟอร์มทางเทคนิค สามารถมีความไวสูงได้
5. วิธีการ HRM:
เป็นหนึ่งในวิธีการตรวจหายีนที่ใช้กันทั่วไปในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีข้อดีคือง่าย เร็ว ไว และหลอดเดียวเพื่อหลีกเลี่ยงมลภาวะ เพื่อสำรวจความเป็นไปได้ของการใช้งานในการทดสอบทางคลินิก Liu Liqin และคนอื่นๆ ใช้วิธี HRM เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก 64 ราย และใช้การจัดลำดับโดยตรงเพื่อตรวจสอบผลลัพธ์ ผลลัพธ์ของ HRM และการจัดลำดับโดยตรงพบว่ามีความสอดคล้องกัน เมื่อเทียบกับการจัดลำดับโดยตรง การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน KRAS โดย HRM นั้นเรียบง่ายและแม่นยำ ซึ่งแนะนำว่าเป็นวิธีการที่เชื่อถือได้ซึ่งเหมาะสำหรับการทดสอบทางคลินิก เฉิน Zhihong และคณะ ใช้วิธี HRM เพื่อทดสอบชุดตัวอย่างผสมที่มีสัดส่วนของพลาสมิดกลายพันธุ์ KRAS ที่แตกต่างกันเพื่อประเมินความไวของพวกมัน พบว่าสัดส่วนของการกลายพันธุ์ของพลาสมิดในตัวอย่างผสมคือ 10% และความไวถึง 10% ต่อจากนั้น ใช้วิธีนี้เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ในตัวอย่างเนื้อเยื่อมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก 60 ตัวอย่าง เมื่อเทียบกับวิธีการจัดลำดับโดยตรง ความไวของวิธี HRM คือ 100% และความจำเพาะคือ 96% (43/45) ข้อเสียของวิธี HRM คือเป็นไปไม่ได้ที่จะให้ประเภทการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงและ codon ใดที่กลายพันธุ์ได้อย่างแม่นยำ หากพบความผิดปกติบนเส้นโค้งการหลอมเหลว จำเป็นต้องใช้วิธีการหาลำดับเพื่อกำหนดประเภทการกลายพันธุ์ กลุ่มวิจัยของ Harlé ใช้เนื้อเยื่อมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก 156 กรณีเพื่อเปรียบเทียบวิธี PCR เรืองแสง ARMS และ HRM ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าแม้ว่าวิธีการทั้ง XNUMX วิธีจะเหมาะสำหรับการทดสอบทางคลินิก แต่ความน่าเชื่อถือของ HRM นั้นไม่ดีเท่ากับอีกสองวิธี
6. วิธีอื่นๆ:
นอกจากวิธีการดังกล่าวแล้ว วิธีการตรวจจับอื่นๆ ยังมีข้อดีและข้อเสียในการใช้งาน เช่น PCR-SSCP, โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง, วิธีโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ปรับด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์ด้วย PCR , วิธีการรวม PCR และ ARMS ที่ซ้อนกัน, COLD-PCR วิธีการ ฯลฯ โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงมีความจำเพาะสูง แต่ความต้องการตัวอย่างมีขนาดใหญ่ PCR-SSCP มีต้นทุนต่ำและประหยัด แต่การดำเนินการนั้นซับซ้อน เทคโนโลยีการตรวจจับการกลายพันธุ์โดยใช้ PCR เรืองแสงมีความจำเพาะสูง ความไวสูงและปริมาณที่แม่นยำ ใช้งานง่าย ปฏิกิริยาที่ถูกบล็อกอย่างสมบูรณ์และข้อดีอื่นๆ แต่ทั้งหมดจำเป็นต้องออกแบบไพรเมอร์และโพรบตามประเภทการกลายพันธุ์ที่รู้จัก ดังนั้นเฉพาะไซต์เท่านั้นที่สามารถ ตรวจพบและไม่สามารถตรวจพบการกลายพันธุ์ที่เป็นไปได้ทั้งหมด
3 สรุป
โดยสรุป เนื่องจากไซต์การกลายพันธุ์และวิธีการตรวจหาในห้องปฏิบัติการต่างๆ ไม่เหมือนกัน ขนาดของตัวอย่างเนื้องอกที่วิเคราะห์และคุณภาพของการสกัดดีเอ็นเอก็ไม่เท่ากัน ส่งผลให้มีผลการทดลองขนาดใหญ่หรือเล็กระหว่างห้องปฏิบัติการ ความแตกต่าง มาตรฐาน ของการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน KRAS ได้กลายเป็นปัญหาการตรวจหาทางคลินิกที่น่ากังวลในหลายประเทศ ในปัจจุบัน มีหลายวิธีในการตรวจหาการกลายพันธุ์ในยีน KRAS ความไวจากสูงไปต่ำคือ ARMS, pyrosequencing, HRM, PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ และการจัดลำดับโดยตรง จากความเป็นจริงทางคลินิก ความไวต่ำไม่เอื้อต่อการรักษาทางคลินิก แต่วิธีการที่ละเอียดอ่อนเกินไปจะทำให้ความจำเพาะในการตรวจหาลดลง และผลบวกที่ผิดพลาดโดยไม่จำเป็นอาจเกิดขึ้นและส่งผลต่อระบบการรักษาของผู้ป่วยในภายหลัง เมื่อพิจารณาจากแง่มุมข้างต้น ร่วมกับวิธีการที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA แนะนำให้ใช้วิธี ARMS แน่นอน จากมุมมองของตลาด การวินิจฉัยระดับโมเลกุลไม่ควรเน้นฉัน
thods แต่มุ่งเน้นไปที่ผลลัพธ์สุดท้ายที่ถูกต้อง ห้องปฏิบัติการต่างๆ สามารถใช้วิธีการทดสอบที่เหมาะสมตามสถานการณ์จริงได้ แต่ต้องมีคุณสมบัติของผู้ปฏิบัติงานที่ดีและระบบควบคุมคุณภาพภายในเท่านั้น ภายใต้สภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการภายในประเทศในปัจจุบัน จำเป็นต้องดำเนินการทดสอบในห้องปฏิบัติการ PCR ที่ได้มาตรฐาน และมีส่วนร่วมในกิจกรรมการควบคุมคุณภาพระหว่างห้องทั้งในและต่างประเทศ เพื่อให้มั่นใจในคุณภาพการทดสอบในห้องปฏิบัติการที่เชื่อถือได้ การจัดการที่ได้มาตรฐานเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นเพื่อให้มั่นใจถึงผลลัพธ์ที่คงที่ ในประเทศจีน มีความจำเป็นเร่งด่วนในการรวมและสร้างมาตรฐานการทดสอบทางคลินิกของยีน KRAS และเพื่อสร้างโปรแกรมการทดสอบที่ได้มาตรฐานและได้มาตรฐานตามความต้องการที่แตกต่างกัน และโปรแกรมนี้สามารถขยายไปถึงการตรวจหา BRAF, PIK23450_3CA, EGFR และยีนอื่นๆ เพื่อส่งเสริมการทดสอบพยาธิวิทยาระดับโมเลกุลทางคลินิก
