Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Kadar positif mutasi gen KRAS pada barah kolorektal
Pada barah kolorektal, kadar mutasi gen KRAS setinggi 35% hingga 45%, dan laman mutasi berisiko tinggi adalah kodon 12 dan 13 pada ekson 2, dan masih terdapat yang jarang seperti 61 dan 146. tapak. Terdapat banyak kaedah pengesanan untuk mutasi gen KRAS, termasuk penjujukan langsung, analisis keluk peleburan resolusi tinggi (HRM), pyrosequencing, PCR kuantitatif, sistem blok penguat mutasi (amplinc atio) sistem nrefractorymutation (ARMS), polimorfisme panjang fragmen sekatan (RFLP), analisis rantai polimerase reaksi-polimorfisme konformasi sehelai (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), ko-amplifikasi pada suhu denaturasi bawah PCR (COLD-PCR) dan analisis kromatografi cecair berprestasi tinggi, dll.
2. Penilaian kaedah pengesanan mutasi KRAS
1. Kaedah penjujukan langsung: Ini adalah kaedah yang paling klasik untuk mengesan mutasi gen KRAS, dan juga merupakan standard emas untuk mengesan mutasi gen. Kaedah penjujukan langsung berdasarkan prinsip urutan dideoksi secara intuitif dapat menunjukkan perubahan urutan gen dalam bentuk peta puncak asas. Jenis pengesanan lebih komprehensif, dan ini juga merupakan kaedah pengesanan mutasi yang paling awal digunakan. Walaupun munculnya platform penjujukan generasi baru, para sarjana di dalam dan luar negara masih menggunakan hasil penjujukan langsung sebagai skala untuk mengukur dan menentukan kebolehpercayaan kaedah baru. Gao Jing et al. Penjujukan langsung yang berlaku untuk pengesanan mutasi gen KRAS dan BRAF pada 966 pesakit dengan barah kolorektal. Ini juga merupakan analisis mutasi gen KRAS dengan sampel domestik terbesar yang dilaporkan dalam literatur. Ling Yun dan yang lain percaya bahawa kaedah penjujukan langsung adalah kaedah pengesanan yang paling langsung dan berkesan untuk memahami status mutasi setiap gen, yang dapat menjelaskan jenis mutasi, terutama untuk pengesanan mutasi yang tidak diketahui. Walaupun kepekaan kaedah ini relatif rendah, ia dapat ditingkatkan dengan kaedah seperti mikrodisseksi untuk memperkaya sel-sel tumor. Kaedah penjujukan langsung juga telah diterapkan pada pengesanan KRAS dengan ukuran sampel yang lebih besar dalam kumpulan penyelidikan domestik yang lain. Walau bagaimanapun, kepekaan yang lebih rendah adalah kelemahan terbesar penjujukan langsung. Berdasarkan hasil yang dilaporkan di China, kadar pengesanan mutasi dengan penjujukan langsung tidak rendah. Liu Xiaojing et al. Membandingkan penjujukan langsung dan penjepit asid nukleik peptida PCR (PNA-PCR) dan mendapati bahawa 43 kes mutasi gen KRAS dikesan oleh penjujukan langsung. Selain mutasi ini, PNA-PCR juga dikesan dengan penjujukan langsung. Sepuluh mutasi ditemukan pada jenis liar, dan cadangan dibuat untuk menentukan pesakit jenis liar dengan PCR dan kaedah penjujukan langsung untuk menentukan pesakit mutan. Qiu Tian et al. Mengesan 131 spesimen barah kolorektal dengan kaedah probe oligonukleotida dioptimumkan PCR pendarfluor dan kaedah penjujukan langsung, dan kadar positif mutasi gen KRAS adalah 41.2% (54/131) dan 40.5% (53/131)). Bai Dongyu juga membincangkan kepekaan pengesanan kaedah yang berbeza. Dari 200 pesakit barah kolorektal, 63 dikesan oleh mutasi RT-qPCR, dan kadar pengesanan mutasi adalah 31.5%; 169 sampel berjaya diuraikan dengan urutan langsung 50 kes mutasi, kadar pengesanan mutasi 29.6%. Walaupun kaedah penjujukan langsung dapat mengesan status mutasi gen KRAS secara tepat, objektif dan khusus, kekurangannya seperti keperluan teknikal yang tinggi, prosedur operasi yang rumit, mudah menyebabkan pencemaran silang, dan penafsiran hasil yang memakan masa dan sukar juga sangat jelas. Selalunya tidak ada peralatan penjujukan, dan spesimen perlu dihantar ke syarikat yang sesuai untuk diuji, yang memerlukan waktu lama dan mempunyai biaya yang tinggi, sehingga memiliki batasan yang besar.
Kaedah Pyrosequencing:
Kaedah Pyrosequencing juga merupakan kaedah yang lebih mudah untuk pengesanan mutasi gen KRAS dari segi kepekaan penjujukan, kos pengesanan dan masa untuk dilaporkan. Kebolehulangan kaedah ini lebih baik. Menurut peta puncak yang diperoleh Kajian kuantitatif frekuensi mutasi laman web tertentu dan perbandingan antara frekuensi mutasi laman web yang berbeza jelas sekali. Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, Ogino et al., Hutchins et al. Telah menggunakan teknologi pyrosequencing untuk menguji mutasi KRAS pada pesakit dengan sampel besar kanser kolorektal. Hasilnya menunjukkan bahawa teknologi pyrosequencing adalah alat yang ampuh untuk pemeriksaan pesakit untuk terapi yang disasarkan. Diagnosis molekul tumor mempunyai prospek aplikasi yang luas. Para sarjana domestik juga telah menggunakan teknologi pyrosequencing untuk secara klinikal mengesan mutasi KRAS pada barah kolorektal, dengan ketepatan dan kebolehpercayaan yang baik. Kaedah ini mempunyai kekhususan yang lebih baik dan kepekaan yang lebih tinggi. SundstrÖm et al. Membandingkan PCR spesifik alel dan pyrosequencing dalam aplikasi klinikal dan mendapati bahawa dalam 314 kes mutasi KRAS pada pesakit barah kolorektal, kekhususan pyrosequencing lebih tinggi daripada alel. PCR, dan mempunyai kepekaan yang baik terhadap tisu dengan kandungan sel tumor rendah. Cairkan bahagian sel tumor hingga 1.25% hingga 2.5%. Pyrosequencing masih dapat mengesan isyarat mutasi. Apabila kandungan minimum alel mutan dalam sampel perlu mencapai 20% untuk dikesan oleh penjujukan Sanger, ia dapat dikesan dengan metode HRM ketika mencapai 10%, dan untuk pyrosequencing hanya mutasi yang dapat dikesan sebanyak 5%. Alel. Kami menggunakan pyrosequencing untuk mengesan mutasi KRAS pada 717 pesakit dengan barah kolorektal dan mendapati bahawa frekuensi mutasi KRAS adalah 40.9%. Kadar mutasi kodon 12 adalah 30.1%, kadar mutasi kodon 13 adalah 9.8%, dan kadar mutasi kodon 61 adalah 1.0%. Kami memperkayakan tisu dengan kandungan tumor yang lebih tinggi dengan pemeriksaan mikro manual sebelum melakukan ujian, menjadikan hasilnya lebih dipercayai. Kaedah ini mempunyai kepekaan dan kekhususan yang baik, dan mudah dikembangkan dalam praktik klinikal. Kelemahan pyrosequencing adalah kos pengesanan yang tinggi, dan proses penyediaan DNA helai tunggal untuk urutan sampel adalah rumit. Di masa depan, pyrosequencing dapat dikhaskan untuk pengembangan teknologi untuk pengesanan langsung produk PCR untai dua, yang akan sangat memudahkan operasi. Dan mengurangkan kos penjujukan dengan berkesan untuk mencapai promosi ujian klinikal yang komprehensif.
3. Kaedah ARMS:
Teknologi ini menggunakan primer untuk membezakan antara gen jenis liar dan mutan, wh
telah dilaporkan seawal 1980-an. Kelebihan terbesar kaedah ini ialah ia mempunyai kepekaan hingga 1.0% dan dapat mengesan gen mutan dalam sampel serendah 1.0%. Dalam reka bentuk, panjang produk sasaran dapat dipendekkan sejauh mungkin, dan masalah hasil pengesanan yang tepat tidak dapat diperolehi kerana kebanyakan DNA yang diekstrak dari spesimen tisu yang dilekatkan dengan parafin berpecah-belah. Teknologi ini menggabungkan platform PCR masa nyata untuk mencapai operasi tiub tertutup semasa penguatan. Operasinya mudah dan tidak memerlukan pasca pemprosesan produk, yang dapat mengelakkan pencemaran produk yang diperkuat secara maksimum. Pada masa ini, kaedah scorpion-ARMS menggabungkan probe kalajengking dan sistem mutasi blok amplifikasi lebih sering digunakan di dunia. Gabungan kedua-dua teknologi dapat memaksimumkan kepekaan dan kekhususan kedua-dua belah pihak. Gao Jie et al. Menggunakan kaedah ini untuk mengesan status mutasi gen KRAS pada 167 pesakit dengan barah kolorektal, menunjukkan bahawa kaedah ini boleh dipercayai dan tepat. Wang Hui et al. Juga menggunakan ARMS untuk mengesan mutasi KRAS dalam 151 kes tisu formaldehid-tetap dan parafin. Di Amerika Syarikat, kit COBAS (Roche) yang diluluskan oleh FDA untuk ujian klinikal KRAS dan kit Therascreen RGQ (Qiagen) yang diperakui oleh European Union In Vitro Diagnostics (CE-IVD) semuanya menggunakan prinsip ARMS. Di antara kaedah biasa, kaedah ARMS adalah yang paling sensitif dan kosnya agak berpatutan. Oleh itu, sebahagian besar pengesanan klinikal gen KRAS di dalam dan luar negara menggunakan kaedah ARMS, tetapi kerana kaedah ini didasarkan pada teknologi PCR, kekurangannya adalah bahawa ia hanya dapat dikesan mutasi laman web yang diketahui.
4. Kaedah PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. Kaedah HRM:
Ini adalah salah satu kaedah pengesanan gen yang sering digunakan dalam beberapa tahun kebelakangan. Ia mempunyai kelebihan tiub sederhana, cepat, sensitif, dan tunggal untuk mengelakkan pencemaran. Untuk mengetahui kemungkinan penggunaannya dalam ujian klinikal, Liu Liqin dan yang lain menggunakan kaedah HRM untuk mengesan mutasi gen KRAS pada 64 pesakit dengan barah kolorektal, dan kemudian menggunakan penjujukan langsung untuk mengesahkan hasilnya. Hasil HRM dan penjujukan langsung didapati konsisten. Berbanding dengan penjujukan langsung, pengesanan mutasi gen KRAS oleh HRM adalah sederhana dan tepat, menunjukkan bahawa ia adalah kaedah yang boleh dipercayai yang sesuai untuk ujian klinikal. Chen Zhihong et al. Menggunakan kaedah HRM untuk menguji sebilangan sampel campuran yang mengandungi bahagian yang berlainan dari plasid mutan KRAS untuk menilai kepekaannya. Didapati bahawa bahagian mutasi plasmid pada sampel campuran adalah 10%, dan kepekaannya mencapai 10%. Selepas itu, kaedah tersebut digunakan untuk mengesan mutasi gen KRAS dalam 60 sampel tisu barah kolorektal. Berbanding dengan kaedah penjujukan langsung, kepekaan kaedah HRM adalah 100%, dan kekhususannya adalah 96% (43/45). Kelemahan kaedah HRM adalah mustahil untuk memberikan jenis mutasi spesifik secara tepat dan kodon mana yang bermutasi. Sekiranya terdapat kelainan pada lekukan lebur, kaedah penjujukan diperlukan untuk menentukan jenis mutasi. Kumpulan penyelidikan Harlé menggunakan 156 kes tisu barah kolorektal untuk membandingkan kaedah PCR, ARMS dan HRM pendarfluor. Hasilnya menunjukkan bahawa walaupun ketiga kaedah tersebut sesuai untuk ujian klinikal, kebolehpercayaan HRM tidak sebaik dua kaedah lain.
6. Kaedah lain:
Sebagai tambahan kepada kaedah yang disebutkan di atas, kaedah pengesanan lain mempunyai kelebihan dan kekurangan tersendiri dalam aplikasi, seperti PCR-SSCP, kromatografi cecair berprestasi tinggi, kaedah probe oligonukleotida dioptimumkan PCR pendarfluor, Kaedah gabungan PCR bersarang dan ARMS, COLD-PCR kaedah, dll. Kromatografi cecair berprestasi tinggi mempunyai kekhususan yang kuat, tetapi permintaan untuk sampel adalah besar; PCR-SSCP murah dan menjimatkan, tetapi operasinya rumit; teknologi pengesanan mutasi berdasarkan PCR pendarfluor mempunyai kekhususan yang kuat, kepekaan tinggi, dan kuantitatif yang tepat, Operasi mudah, reaksi tersekat sepenuhnya dan kelebihan lain, tetapi semua perlu merancang primer dan probe mengikut jenis mutasi yang diketahui, jadi hanya laman web tertentu yang dapat dikesan, dan semua kemungkinan mutasi tidak dapat dikesan.
3. Ringkasan
Ringkasnya, kerana lokasi mutasi dan kaedah pengesanan di makmal yang berlainan tidak seragam, ukuran spesimen tumor yang dianalisis dan kualiti pengekstrakan DNA juga tidak merata, yang mengakibatkan adanya hasil eksperimen besar atau kecil antara makmal Perbezaan, standardisasi pengesanan mutasi gen KRAS telah menjadi masalah pengesanan klinikal yang menjadi perhatian di pelbagai negara. Pada masa ini, terdapat banyak kaedah untuk mengesan mutasi pada gen KRAS. Sensitiviti dari tinggi ke rendah adalah ARMS, pyrosequencing, HRM, PCR kuantitatif masa nyata, dan penjujukan langsung. Dari kenyataan klinikal, kepekaan rendah tidak kondusif untuk rawatan klinikal, tetapi kaedah yang terlalu sensitif akan menyebabkan kekhususan pengesanan menurun, dan hasil positif palsu yang tidak perlu dapat terjadi dan mempengaruhi rejimen ubat pesakit seterusnya. Dengan mempertimbangkan aspek di atas, digabungkan dengan kaedah yang diluluskan oleh FDA, kaedah ARMS adalah disyorkan. Sudah tentu, dari perspektif pasaran, diagnostik molekul tidak boleh memberi penekanan kepada saya
thods, tetapi fokus pada hasil akhir yang betul. Makmal yang berbeza boleh menggunakan kaedah ujian yang sesuai mengikut situasi sebenar, tetapi hanya jika mereka mempunyai kelayakan pengendali yang baik dan sistem kawalan kualiti dalaman. Di bawah keadaan persekitaran makmal domestik semasa, adalah perlu untuk menjalankan ujian dalam makmal PCR piawai dan mengambil bahagian dalam aktiviti kawalan kualiti antara bilik domestik dan antarabangsa untuk memastikan kualiti ujian makmal yang boleh dipercayai. Pengurusan standard adalah syarat yang diperlukan untuk memastikan hasil yang berterusan. Di China, terdapat keperluan mendesak untuk menyatukan dan menyeragamkan ujian klinikal gen KRAS, dan untuk menjana program ujian piawai dan piawai mengikut keperluan yang berbeza, dan program ini boleh diperluaskan kepada pengesanan BRAF, PIK23450_3CA, EGFR dan gen lain untuk menggalakkan ujian patologi molekul klinikal.
