Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. വൻകുടൽ കാൻസറിലെ KRAS ജീൻ പരിവർത്തനത്തിന്റെ പോസിറ്റീവ് നിരക്ക്
വൻകുടൽ കാൻസറിൽ, കെആർഎസ് ജീനിന്റെ മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് 35% മുതൽ 45% വരെ ഉയർന്നതാണ്, ഉയർന്ന അപകടസാധ്യതയുള്ള മ്യൂട്ടേഷൻ സൈറ്റ് എക്സോൺ 12 ന് 13 ഉം 2 ഉം കോഡണുകളാണ്, 61, 146 പോലുള്ള അപൂർവങ്ങളായവ ഇപ്പോഴും ഉണ്ട്. സൈറ്റ്. നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ്, ഹൈ റെസല്യൂഷൻ മെലിറ്റിംഗ് കർവ് അനാലിസിസ് (എച്ച്ആർ‌എം), പൈറോക്യുസെൻസിംഗ്, ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ, മ്യൂട്ടേഷൻ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബ്ലോക്ക് സിസ്റ്റം (ആംപ്ലിങ്ക് ആറ്റിയോ) നെഫ്രാക്ടറിമ്യൂട്ടേഷൻ സിസ്റ്റം (ആർ‌എം‌എസ്), നിയന്ത്രണ ശകലം നീളം പോളിമോർഫിസം (ആർ‌എഫ്‌എൽ‌പി), പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ-സിംഗിൾ-സ്ട്രാന്റ് കൺഫർമേഷൻ പോളിമോർഫിസം വിശകലനം (പിസിആർ-സിംഗിൾസ്ട്രാന്റ് കോൺഫോമേഷൻ പോളിമോർഫിസം (പിസിആർ-എസ്എസ്സിപി), ലോവർ ഡിനാറ്ററേഷൻ ടെമ്പറേറ്ററിൽ പി-കോ-ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ (കോൾഡ്-പിസിആർ), ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി വിശകലനം തുടങ്ങിയവ.
2. KRAS മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ രീതികളുടെ വിലയിരുത്തൽ
1. ഡയറക്റ്റ് സീക്വൻസിംഗ് രീതി: കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും ക്ലാസിക് രീതിയാണിത്, കൂടാതെ ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള സ്വർണ്ണ മാനദണ്ഡം കൂടിയാണിത്. ഡിഡിയോക്സി സീക്വൻസിംഗിന്റെ തത്വത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിക്ക് അടിസ്ഥാന പീക്ക് മാപ്പിന്റെ രൂപത്തിൽ ജീൻ സീക്വൻസിന്റെ മാറ്റം വളരെ അവബോധപൂർവ്വം കാണിക്കാൻ കഴിയും. കണ്ടെത്തൽ തരം കൂടുതൽ സമഗ്രമാണ്, മാത്രമല്ല ഇത് നേരത്തെ പ്രയോഗിച്ച മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ രീതി കൂടിയാണ്. പുതിയ തലമുറ സീക്വൻസിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകൾ ഉയർന്നുവന്നിട്ടും, സ്വദേശത്തും വിദേശത്തുമുള്ള പണ്ഡിതന്മാർ പുതിയ രീതിയുടെ വിശ്വാസ്യത അളക്കുന്നതിനും നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിന്റെ ഫലങ്ങൾ ഒരു സ്കെയിലായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഗാവോ ജിംഗ് തുടങ്ങിയവർ. വൻകുടൽ കാൻസർ ബാധിച്ച 966 രോഗികളിൽ KRAS, BRAF ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് പ്രയോഗിച്ചു. സാഹിത്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ടുചെയ്‌ത ഏറ്റവും വലിയ ആഭ്യന്തര സാമ്പിളുള്ള KRAS ജീൻ പരിവർത്തനത്തിന്റെ വിശകലനം കൂടിയാണിത്. ഓരോ ജീനിന്റെയും മ്യൂട്ടേഷൻ നില മനസിലാക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും നേരിട്ടുള്ളതും ഫലപ്രദവുമായ കണ്ടെത്തൽ രീതിയാണ് നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിയെന്ന് ലിംഗ് യുനും മറ്റുള്ളവരും വിശ്വസിക്കുന്നു, ഇത് മ്യൂട്ടേഷന്റെ തരം വ്യക്തമാക്കും, പ്രത്യേകിച്ച് അജ്ഞാത മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന്. ഈ രീതിയുടെ സംവേദനക്ഷമത താരതമ്യേന കുറവാണെങ്കിലും, ട്യൂമർ കോശങ്ങളെ സമ്പുഷ്ടമാക്കുന്നതിന് മൈക്രോ ഡിസെക്ഷൻ പോലുള്ള മാർഗ്ഗങ്ങളിലൂടെ ഇത് മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയും. മറ്റ് ആഭ്യന്തര ഗവേഷണ ഗ്രൂപ്പുകളിലെ വലിയ സാമ്പിൾ വലുപ്പങ്ങൾ KRAS കണ്ടെത്തുന്നതിനും നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതി പ്രയോഗിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, കുറഞ്ഞ സംവേദനക്ഷമതയാണ് നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിന്റെ ഏറ്റവും വലിയ പോരായ്മ. ചൈനയിൽ റിപ്പോർട്ടുചെയ്‌ത ഫലങ്ങളിൽ നിന്ന് നോക്കുമ്പോൾ, നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിലൂടെ മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് കുറവല്ല. ലിയു സിയാവോജിംഗ് തുടങ്ങിയവർ. നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗും പെപ്റ്റൈഡ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ക്ലാമ്പ് പി‌സി‌ആറും (പി‌എൻ‌എ-പിസിആർ) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ 43 കേസുകൾ നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിലൂടെ കണ്ടെത്തിയതായി കണ്ടെത്തി. ഈ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ‌ക്ക് പുറമേ, നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിലൂടെയും പി‌എൻ‌എ-പിസിആർ കണ്ടെത്തി. കാട്ടുതീയിൽ പത്ത് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ പിസിആർ വഴി കാട്ടുതീ രോഗികളെ നിർണ്ണയിക്കാൻ നിർദ്ദേശങ്ങളും മ്യൂട്ടൻറ് രോഗികളെ നിർ‌ണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിയും നിർദ്ദേശിച്ചു. ക്യു ടിയാൻ തുടങ്ങിയവർ. ഫ്ലൂറസെന്റ് പിസിആർ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രോബ് രീതിയും നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിയും ഉപയോഗിച്ച് 131 വൻകുടൽ കാൻസർ മാതൃകകൾ കണ്ടെത്തി, കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ പോസിറ്റീവ് നിരക്ക് 41.2% (54/131), 40.5% (53/131) എന്നിവയാണ്. വ്യത്യസ്ത രീതികളുടെ കണ്ടെത്തൽ സംവേദനക്ഷമതയെക്കുറിച്ചും ബായ് ഡോങ്‌യു ചർച്ച ചെയ്തു. 200 വൻകുടൽ കാൻസർ രോഗികളിൽ 63 പേരെ ആർടി-ക്യുപിസിആർ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തി, മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് 31.5%; മ്യൂട്ടേഷന്റെ 169 കേസുകൾ, മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് 50% നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിലൂടെ 29.6 സാമ്പിളുകൾ വിജയകരമായി ക്രമീകരിച്ചു. നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിക്ക് KRAS ജീൻ മ്യൂട്ടേഷൻ നില കൃത്യമായും വസ്തുനിഷ്ഠമായും പ്രത്യേകമായും കണ്ടെത്താനാകുമെങ്കിലും, ഉയർന്ന സാങ്കേതിക ആവശ്യകതകൾ, സങ്കീർണ്ണമായ പ്രവർത്തന നടപടിക്രമങ്ങൾ, ക്രോസ്-മലിനീകരണത്തിന് എളുപ്പമുള്ളത്, ഫലങ്ങളുടെ സമയമെടുക്കുന്നതും അധ്വാനിക്കുന്നതുമായ വ്യാഖ്യാനം എന്നിവ വളരെ കുറവാണ് വ്യക്തമാണ്. മിക്കപ്പോഴും സീക്വൻസിംഗ് ഉപകരണങ്ങളില്ല, കൂടാതെ മാതൃക പരിശോധിക്കുന്നതിനായി അനുബന്ധ കമ്പനിയിലേക്ക് അയയ്‌ക്കേണ്ടതുണ്ട്, ഇത് വളരെയധികം സമയമെടുക്കുകയും ഉയർന്ന ചിലവ് നേടുകയും ചെയ്യുന്നു, അതിനാൽ ഇതിന് വലിയ പരിമിതികളുണ്ട്.
പൈറോസെൻസിംഗ് രീതി:
സീക്വൻസിംഗ് സെൻസിറ്റിവിറ്റി, കണ്ടെത്തൽ ചെലവ്, റിപ്പോർട്ടുചെയ്യാനുള്ള സമയം എന്നിവ കണക്കിലെടുത്ത് കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള കൂടുതൽ സൗകര്യപ്രദമായ മാർഗ്ഗമാണ് പൈറോക്യുസെൻസിംഗ് രീതി. ഈ രീതിയുടെ ആവർത്തനക്ഷമത മികച്ചതാണ്. ലഭിച്ച പീക്ക് മാപ്പ് അനുസരിച്ച്, ഒരു പ്രത്യേക സൈറ്റിന്റെ മ്യൂട്ടേഷൻ ഫ്രീക്വൻസിയുടെ അളവ് പഠനവും വ്യത്യസ്ത സൈറ്റുകളുടെ മ്യൂട്ടേഷൻ ആവൃത്തികൾ തമ്മിലുള്ള താരതമ്യവും ഒറ്റനോട്ടത്തിൽ വ്യക്തമാണ്. സമീപ വർഷങ്ങളിൽ, ഒഗിനോ മറ്റുള്ളവരും, ഹച്ചിൻസ് മറ്റുള്ളവരും. വൻകുടലിലെ അർബുദത്തിന്റെ വലിയ സാമ്പിളുകളുള്ള രോഗികളിൽ കെആർഎസ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ പരിശോധിക്കുന്നതിന് പൈറോക്യുസെൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ചു. ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത തെറാപ്പിക്ക് രോഗികളെ സ്‌ക്രീനിംഗ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ശക്തമായ ഉപകരണമാണ് പൈറോക്യുസെൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യയെന്ന് ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ട്യൂമർ മോളിക്യുലർ ഡയഗ്നോസിസിന് വിശാലമായ ആപ്ലിക്കേഷൻ സാധ്യതകളുണ്ട്. നല്ല കൃത്യതയോടും വിശ്വാസ്യതയോടുംകൂടെ വൻകുടലിലെ പണ്ഡിതന്മാർ കൊളോറെക്ടൽ ക്യാൻസറിലെ കെആർഎസ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ക്ലിനിക്കായി കണ്ടെത്തുന്നതിന് പൈറോക്സെൻസിംഗ് സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ചു. ഈ രീതിക്ക് മികച്ച സവിശേഷതയും ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയും ഉണ്ട്. സൺ‌സ്ട്രോം മറ്റുള്ളവരും. അല്ലെലിക്-നിർദ്ദിഷ്ട പി‌സി‌ആറും ക്ലിനിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകളിലെ പൈറോക്യുൻസിംഗും താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, വൻകുടൽ കാൻസർ രോഗികളിൽ 314 കേസുകളിൽ കെആർഎസ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തിയപ്പോൾ, പൈറോക്യുസെൻസിംഗിന്റെ പ്രത്യേകത അല്ലീലുകളേക്കാൾ മികച്ചതാണെന്ന് കണ്ടെത്തി. ട്യൂമർ സെൽ ഉള്ളടക്കമുള്ള ടിഷ്യുകൾക്ക് നല്ല സംവേദനക്ഷമതയുണ്ട്. ട്യൂമർ സെല്ലുകളുടെ അനുപാതം 1.25% മുതൽ 2.5% വരെ നേർപ്പിക്കുക. പൈറോക്യുൻസിംഗിന് ഇപ്പോഴും മ്യൂട്ടേഷൻ സിഗ്നലുകൾ കണ്ടെത്താനാകും. സാമ്പിളിലെ മ്യൂട്ടന്റ് അല്ലീലുകളുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ ഉള്ളടക്കം സാങ്കർ സീക്വൻസിംഗിലൂടെ കണ്ടെത്തുന്നതിന് 20% എത്തേണ്ടിവരുമ്പോൾ, എച്ച്ആർ‌എം രീതി 10% എത്തുമ്പോൾ അത് കണ്ടെത്താനാകും, കൂടാതെ പൈറോക്യുൻസിംഗിനായി 5% മാത്രമേ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്താനാകൂ. അല്ലീലസ്. വൻകുടലിലെ അർബുദം ബാധിച്ച 717 രോഗികളിൽ KRAS മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഞങ്ങൾ പൈറോക്യുസെൻസിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു, KRAS മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ ആവൃത്തി 40.9% ആണെന്ന് കണ്ടെത്തി. കോഡൺ 12 ന്റെ മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് 30.1%, കോഡൺ 13 ന്റെ മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് 9.8%, കോഡൺ 61 ന്റെ മ്യൂട്ടേഷൻ നിരക്ക് 1.0%. പരിശോധനയ്ക്ക് മുമ്പായി മാനുവൽ മൈക്രോ ഡിസെക്ഷൻ വഴി ഉയർന്ന ട്യൂമർ ഉള്ളടക്കമുള്ള ടിഷ്യുകളെ ഞങ്ങൾ സമ്പുഷ്ടമാക്കി, ഫലങ്ങൾ കൂടുതൽ വിശ്വസനീയമാക്കി. ഈ രീതിക്ക് നല്ല സംവേദനക്ഷമതയും സവിശേഷതയുമുണ്ട്, മാത്രമല്ല ക്ലിനിക്കൽ പ്രാക്ടീസിൽ വികസിപ്പിക്കാൻ എളുപ്പമാണ്. പൈറോക്യുസെൻസിംഗിന്റെ പോരായ്മ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഉയർന്ന ചിലവാണ്, കൂടാതെ സാമ്പിളുകൾ ക്രമപ്പെടുത്തുന്നതിന് ഒറ്റ-ഒറ്റപ്പെട്ട ഡിഎൻ‌എ തയ്യാറാക്കുന്ന പ്രക്രിയ ബുദ്ധിമുട്ടാണ്. ഭാവിയിൽ, ഇരട്ട-ഒറ്റപ്പെട്ട പിസിആർ ഉൽ‌പ്പന്നങ്ങൾ നേരിട്ട് കണ്ടെത്തുന്നതിനായി സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ വികസനത്തിനായി പൈറോക്വെൻസിംഗ് നീക്കിവയ്ക്കാം, ഇത് പ്രവർത്തനത്തെ വളരെയധികം ലളിതമാക്കും. ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയുടെ സമഗ്രമായ പ്രമോഷൻ നേടുന്നതിന് സീക്വൻസിംഗിന്റെ ചെലവ് ഫലപ്രദമായി കുറയ്ക്കുക.
3. ARMS രീതി:
ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ്, മ്യൂട്ടന്റ് ജീനുകൾ എന്നിവ വേർതിരിച്ചറിയാൻ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു
ich 1980 കളിൽ തന്നെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഈ രീതിയുടെ ഏറ്റവും വലിയ നേട്ടം ഇതിന് 1.0% വരെ സംവേദനക്ഷമതയുണ്ട്, കൂടാതെ സാമ്പിളുകളിൽ മ്യൂട്ടന്റ് ജീനുകളെ 1.0% വരെ കുറവായി കണ്ടെത്താനാകും എന്നതാണ്. രൂപകൽപ്പനയിൽ, ടാർ‌ഗെറ്റ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർ‌ഘ്യം ഏറ്റവും വലിയ അളവിലേക്ക് ചുരുക്കാൻ കഴിയും, മാത്രമല്ല പാരഫിൻ-ഉൾച്ചേർത്ത ടിഷ്യു മാതൃകയിൽ നിന്നും വേർ‌തിരിച്ചെടുത്ത ഡി‌എൻ‌എയുടെ ഭൂരിഭാഗവും വിഘടിച്ചതിനാൽ കൃത്യമായ കണ്ടെത്തൽ ഫലങ്ങൾ നേടാൻ കഴിയില്ല. ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് അടച്ച-ട്യൂബ് പ്രവർത്തനം നേടുന്നതിന് ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ തത്സമയ പിസിആർ പ്ലാറ്റ്ഫോമിനെ സംയോജിപ്പിക്കുന്നു. പ്രവർത്തനം ലളിതമാണ്, കൂടാതെ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ പോസ്റ്റ് പ്രോസസ്സിംഗ് ആവശ്യമില്ല, ഇത് വിപുലീകരിച്ച ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ മലിനീകരണം ഏറ്റവും വലിയ അളവിൽ ഒഴിവാക്കാനാകും. നിലവിൽ, സ്കോർപിയോൺ പ്രോബും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബ്ലോക്ക് മ്യൂട്ടേഷൻ സിസ്റ്റവും സംയോജിപ്പിക്കുന്ന സ്കോർപിയോൺ-ആർ‌എം‌എസ് രീതി ലോകത്ത് സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. രണ്ട് സാങ്കേതികവിദ്യകളുടെയും സംയോജനത്തിന് ഇരുവശത്തിന്റെയും സംവേദനക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. ഗാവോ ജി തുടങ്ങിയവർ. വൻകുടൽ കാൻസർ ബാധിച്ച 167 രോഗികളിൽ KRAS ജീൻ മ്യൂട്ടേഷൻ നില കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഈ രീതി ഉപയോഗിച്ചു, ഈ രീതി വിശ്വസനീയവും കൃത്യവുമാണെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു. വാങ് ഹുയി തുടങ്ങിയവർ. ഫോർമാൽഡിഹൈഡ്-ഫിക്സഡ്, പാരഫിൻ-ഉൾച്ചേർത്ത ടിഷ്യൂകളുടെ 151 കേസുകളിൽ KRAS മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ARMS ഉപയോഗിച്ചു. അമേരിക്കൻ ഐക്യനാടുകളിൽ, കെ‌ആർ‌എസിന്റെ ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്കായി എഫ്ഡി‌എ അംഗീകരിച്ച കോബാസ് കിറ്റ് (റോച്ചെ), യൂറോപ്യൻ യൂണിയൻ ഇൻ വിട്രോ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ് (സിഇ-ഐവിഡി) സാക്ഷ്യപ്പെടുത്തിയ തെറാസ്‌ക്രീൻ ആർ‌ജിക്യു കിറ്റ് (ക്വിയേഗൻ) എന്നിവയെല്ലാം ആർ‌എം‌എസ് തത്വം ഉപയോഗിക്കുന്നു. സാധാരണ രീതികളിൽ, ARMS രീതി ഏറ്റവും സെൻസിറ്റീവ് ആണ്, ചെലവ് താരതമ്യേന ന്യായമാണ്. അതിനാൽ, സ്വദേശത്തും വിദേശത്തുമുള്ള കെആർഎസ് ജീനുകളുടെ ക്ലിനിക്കൽ കണ്ടെത്തലിന്റെ വലിയൊരു ഭാഗം ആർ‌എം‌എസ് രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നു, പക്ഷേ ഈ രീതി പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതിനാൽ, അതിന്റെ പോരായ്മ അറിയാവുന്ന സൈറ്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ മാത്രമേ കണ്ടെത്താനാകൂ.
4. തത്സമയ ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ രീതി:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. എച്ച്ആർ‌എം രീതി:
അടുത്ത കാലത്തായി സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ജീൻ കണ്ടെത്തൽ രീതികളിൽ ഒന്നാണിത്. മലിനീകരണം ഒഴിവാക്കാൻ ലളിതവും വേഗതയേറിയതും സെൻസിറ്റീവ്, സിംഗിൾ ട്യൂബിന്റെയും ഗുണങ്ങളുണ്ട്. ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയിൽ അതിന്റെ ഉപയോഗത്തിന്റെ സാധ്യതകൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതിനായി, ലിയു ലിക്കിനും മറ്റുള്ളവരും കൊളോറെക്ടൽ കാൻസർ ബാധിച്ച 64 രോഗികളിൽ കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് എച്ച്ആർ‌എം രീതി ഉപയോഗിച്ചു, തുടർന്ന് ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന് നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു. എച്ച്ആർ‌എമ്മിന്റെയും നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗിന്റെയും ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരതയുള്ളതായി കണ്ടെത്തി. നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, എച്ച്ആർ‌എം കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് ലളിതവും കൃത്യവുമാണ്, ഇത് ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്ക് അനുയോജ്യമായ ഒരു വിശ്വസനീയമായ രീതിയാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ചെൻ സിഹോംഗ് തുടങ്ങിയവർ. KRAS മ്യൂട്ടന്റ് പ്ലാസ്മിഡുകളുടെ വ്യത്യസ്ത അനുപാതങ്ങൾ അടങ്ങിയ മിശ്രിത സാമ്പിളുകളുടെ ഒരു സംവേദനക്ഷമത പരിശോധിക്കുന്നതിന് എച്ച്ആർ‌എം രീതി ഉപയോഗിച്ചു. മിശ്രിത സാമ്പിളുകളിലെ പ്ലാസ്മിഡ് മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ അനുപാതം 10% ആണെന്നും സംവേദനക്ഷമത 10% ആയെന്നും കണ്ടെത്തി. തുടർന്ന്, 60 കൊളോറെക്ടൽ കാൻസർ ടിഷ്യു സാമ്പിളുകളിൽ കെആർഎസ് ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഈ രീതി ഉപയോഗിച്ചു. നേരിട്ടുള്ള സീക്വൻസിംഗ് രീതിയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, എച്ച്ആർ‌എം രീതിയുടെ സംവേദനക്ഷമത 100% ആയിരുന്നു, പ്രത്യേകത 96% (43/45) ആയിരുന്നു. നിർദ്ദിഷ്ട മ്യൂട്ടേഷൻ തരം കൃത്യമായി നൽകുന്നത് അസാധ്യമാണ്, ഏത് കോഡൺ പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു എന്നതാണ് എച്ച്ആർ‌എം രീതിയുടെ പോരായ്മ. ദ്രവണാങ്കത്തിൽ അസാധാരണത്വം കണ്ടെത്തിയാൽ, മ്യൂട്ടേഷൻ തരം നിർണ്ണയിക്കാൻ സീക്വൻസിംഗ് രീതി ആവശ്യമാണ്. ഫ്ലൂറസെന്റ് പിസിആർ, ആർ‌എം‌എസ്, എച്ച്ആർ‌എം രീതികൾ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ ഹാർലെ റിസർച്ച് ഗ്രൂപ്പ് 156 കേസുകൾ വൻകുടൽ കാൻസർ ടിഷ്യു ഉപയോഗിച്ചു. മൂന്ന് രീതികളും ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്ക് അനുയോജ്യമാണെങ്കിലും, എച്ച്ആർ‌എമ്മിന്റെ വിശ്വാസ്യത മറ്റ് രണ്ട് രീതികളെപ്പോലെ മികച്ചതല്ലെന്ന് ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
6. മറ്റ് രീതികൾ:
മേൽപ്പറഞ്ഞ രീതികൾ‌ക്ക് പുറമേ, പിസിആർ-എസ്എസ്സിപി, ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി, ഫ്ലൂറസെന്റ് പിസിആർ-ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രോബ് രീതി, നെസ്റ്റഡ് പിസിആർ, ആർ‌എം‌എസ് കോമ്പിനേഷൻ രീതി, കോൾഡ്-പിസിആർ രീതി മുതലായവ. ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക്ക് ശക്തമായ പ്രത്യേകതയുണ്ട്, പക്ഷേ സാമ്പിളുകളുടെ ആവശ്യം വളരെ വലുതാണ്; പിസിആർ-എസ്എസ്സിപി ചെലവ് കുറഞ്ഞതും ലാഭകരവുമാണ്, പക്ഷേ പ്രവർത്തനം സങ്കീർണ്ണമാണ്; ഫ്ലൂറസെന്റ് പി‌സി‌ആറിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മ്യൂട്ടേഷൻ ഡിറ്റക്ഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് ശക്തമായ സവിശേഷത, ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത, കൃത്യമായ അളവ്, എളുപ്പത്തിലുള്ള പ്രവർത്തനം, പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞ പ്രതികരണം, മറ്റ് ഗുണങ്ങൾ എന്നിവയുണ്ട്, എന്നാൽ എല്ലാവർക്കും അറിയപ്പെടുന്ന മ്യൂട്ടേഷൻ തരം അനുസരിച്ച് പ്രൈമറുകളും പ്രോബുകളും രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്, അതിനാൽ നിർദ്ദിഷ്ട സൈറ്റുകൾ മാത്രമേ ആകാവൂ കണ്ടെത്തി, സാധ്യമായ എല്ലാ മ്യൂട്ടേഷനുകളും കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല.
3. സംഗ്രഹം
ചുരുക്കത്തിൽ, വ്യത്യസ്ത ലബോറട്ടറികളിലെ മ്യൂട്ടേഷൻ സൈറ്റുകളും കണ്ടെത്തൽ രീതികളും ആകർഷകമല്ലാത്തതിനാൽ, വിശകലനം ചെയ്ത ട്യൂമർ മാതൃകകളുടെ വലുപ്പവും ഡിഎൻ‌എ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന്റെ ഗുണനിലവാരവും അസമമാണ്, ഇതിന്റെ ഫലമായി ലബോറട്ടറികൾക്കിടയിൽ വലിയതോ ചെറുതോ ആയ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ നിലനിൽക്കുന്നു വ്യത്യാസങ്ങൾ, സ്റ്റാൻഡേർഡൈസേഷൻ KRAS ന്റെ ജീൻ മ്യൂട്ടേഷൻ കണ്ടെത്തൽ വിവിധ രാജ്യങ്ങളിൽ ഒരു ക്ലിനിക്കൽ കണ്ടെത്തൽ പ്രശ്നമായി മാറിയിരിക്കുന്നു. നിലവിൽ, KRAS ജീനിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് നിരവധി മാർഗ്ഗങ്ങളുണ്ട്. എആർ‌എം‌എസ്, പൈറോക്യുസെൻസിംഗ്, എച്ച്ആർ‌എം, തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ, ഡയറക്റ്റ് സീക്വൻസിംഗ് എന്നിവയാണ് ഉയർന്നതിൽ നിന്ന് താഴ്ന്നതിലേക്കുള്ള സംവേദനക്ഷമത. ക്ലിനിക്കൽ റിയാലിറ്റിയിൽ നിന്ന്, കുറഞ്ഞ സംവേദനക്ഷമത ക്ലിനിക്കൽ ചികിത്സയ്ക്ക് ഉതകുന്നതല്ല, പക്ഷേ വളരെ സെൻസിറ്റീവ് രീതികൾ കണ്ടെത്തൽ സവിശേഷത കുറയാൻ ഇടയാക്കും, കൂടാതെ അനാവശ്യമായ തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാകുകയും രോഗിയുടെ തുടർന്നുള്ള മരുന്നുകളെ ബാധിക്കുകയും ചെയ്യും. മേൽപ്പറഞ്ഞ വശങ്ങൾ കണക്കിലെടുത്ത്, എഫ്ഡി‌എ അംഗീകരിച്ച രീതിയുമായി ചേർന്ന്, ആർ‌എം‌എസ് രീതി ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. തീർച്ചയായും, ഒരു വിപണി കാഴ്ചപ്പാടിൽ, മോളിക്യുലർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ് എന്നെ ize ന്നിപ്പറയരുത്
രീതികൾ, എന്നാൽ അന്തിമ ശരിയായ ഫലങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുക. വ്യത്യസ്ത ലബോറട്ടറികൾക്ക് യഥാർത്ഥ സാഹചര്യത്തിനനുസരിച്ച് ഉചിതമായ പരിശോധനാ രീതികൾ സ്വീകരിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ അവയ്ക്ക് നല്ല ഓപ്പറേറ്റർ യോഗ്യതകളും ആന്തരിക ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളും ഉണ്ടെങ്കിൽ മാത്രം. നിലവിലെ ഗാർഹിക ലബോറട്ടറി പാരിസ്ഥിതിക സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആർ ലബോറട്ടറിയിൽ പരിശോധന നടത്തുകയും വിശ്വസനീയമായ ലബോറട്ടറി പരിശോധന ഗുണനിലവാരം ഉറപ്പാക്കുന്നതിന് ആഭ്യന്തര അന്തർദ്ദേശീയ ഇന്റർ-റൂം ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ പങ്കെടുക്കുകയും ചെയ്യേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. സ്ഥിരമായ ഫലങ്ങൾ ഉറപ്പാക്കാൻ സ്റ്റാൻഡേർഡൈസ്ഡ് മാനേജ്മെന്റ് ഒരു ആവശ്യമായ വ്യവസ്ഥയാണ്. ചൈനയിൽ, KRAS ജീനിന്റെ ക്ലിനിക്കൽ ടെസ്റ്റിംഗ് ഏകീകരിക്കുകയും സ്റ്റാൻഡേർഡ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യേണ്ടത് അടിയന്തിരമായി ആവശ്യമാണ്, കൂടാതെ വ്യത്യസ്ത ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ്, സ്റ്റാൻഡേർഡ് ടെസ്റ്റിംഗ് പ്രോഗ്രാം സൃഷ്ടിക്കുക, കൂടാതെ ഈ പ്രോഗ്രാം BRAF, PIK23450_3CA, EGFR എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിലേക്കും വ്യാപിപ്പിക്കാം. ക്ലിനിക്കൽ മോളിക്യുലാർ പാത്തോളജി ടെസ്റ്റിംഗ് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള മറ്റ് ജീനുകൾ.
