Kohdistavia lääkkeitä, kuten setuksimabia ja panitumumabia, on käytetty laajalti klinikalla tehokkaina terapeuttisina lääkkeinä paksusuolen syöpään. Kliiniset tiedot osoittavat, että potilailla, joilla on KRAS-mutaatioita, ei ole merkittävää vaikutusta tähän monoklonaaliseen vasta-ainelääkkeeseen, ja vain villityypin potilaat voivat hyötyä siitä. Siksi KRAS-geenimutaatiotilaa pidetään kliinisesti tärkeänä terapeuttisena markkerina, jolla on vahva korrelaatio paksusuolen syövän ennusteeseen ja hoitovaikutukseen. Vuoden 2009 kansallisen Cancer Comprehensive Networkin (NCCN) paksusuolen syövän kliinisen käytännön ohjeissa määrätään, että kaikkien metastaattista paksusuolen syöpää sairastavien potilaiden on tunnistettava KRAS-geenimutaatiotila, ja vain villin KRAS-tyypin suositellaan saavan EGFR-kohdennettua hoitoa. Samana vuonna American Society of Clinical Oncology (ASCO) antoi myös samat kliiniset hoitosuositukset kuin molekyylimarkkeri kasvaimeen kohdennetulle hoidolle, mikä osoittaa sen tärkeän ohjaavan merkityksen. Tällä hetkellä KRAS-geenitestaus on tehty laajasti kliinisesti. Arvioimme pääasiassa kotimaisia KRAS-geenimutaatioiden ilmaisumenetelmiä vertailua varten kliinisessä valinnassa.
1. KRAS-geenimutaation positiivinen määrä kolorektaalisyövässä
Kolorektaalisyövässä KRAS-geenin mutaatioaste on peräti 35% - 45%, ja korkean riskin mutaatiokohta on kodoneja 12 ja 13 eksonissa 2, ja vielä on harvinaisia, kuten 61 ja 146. Mutaatio sivusto. KRAS-geenimutaatioille on monia detektiomenetelmiä, mukaan lukien suora sekvensointi, korkean erotuskyvyn sulamiskäyräanalyysi (HRM), pyrosekvensointi, kvantitatiivinen PCR, mutaation monistumisen estojärjestelmä (amplinc atio) nrefraktorymutaatiojärjestelmä (ARMS), restriktiofragmentin pituuden polymorfismi (RFLP), polymeraasiketjureaktio-yksisäikeinen konformaatiopolymorfismi-analyysi (PCR-singlestrand-konfomaatiopolymorfismi (PCR-SSCP), rinnakkaismonifikaatio matalammassa denaturointilämpötilassa PCR (COLD-PCR) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia-analyysi jne.
2. KRAS-mutaation ilmaisumenetelmien arviointi
1. Suora sekvensointimenetelmä: Se on klassisin menetelmä KRAS-geenimutaatioiden havaitsemiseksi, ja se on myös kultastandardi geenimutaatioiden havaitsemiseksi. Dideoksisekvensoinnin periaatteeseen perustuva suora sekvensointimenetelmä voi intuitiivisimmin näyttää geenisekvenssin muutoksen emäspiikkikartan muodossa. Havaintotyyppi on kattavampi, ja se on myös aikaisimmin käytetty mutaation havaitsemismenetelmä. Huolimatta uuden sukupolven sekvensointialustojen esiintymisestä, tutkijat kotona ja ulkomailla käyttävät edelleen suoran sekvensoinnin tuloksia mittakaavana uuden menetelmän luotettavuuden mittaamiseen ja määrittämiseen. Gao Jing et ai. Sovellettiin suoraa sekvensointia KRAS- ja BRAF-geenimutaatioiden havaitsemiseen 966 kolorektaalisyöpää sairastavalla potilaalla. Tämä on myös KRAS-geenimutaation analyysi suurimmalla kirjallisuudessa ilmoitetulla kotimaisella näytteellä. Ling Yun ja muut uskovat, että suora sekvensointimenetelmä on suorin ja tehokkain detektiomenetelmä kunkin geenin mutaatiotilan ymmärtämiseksi, mikä voi selvittää mutaation tyypin, erityisesti tuntemattomien mutaatioiden havaitsemiseksi. Vaikka tämän menetelmän herkkyys on suhteellisen pieni, sitä voidaan parantaa esimerkiksi mikrodissektiolla tuumorisolujen rikastamiseksi. Suoraa sekvensointimenetelmää on sovellettu myös suurempien näytekokojen KRAS-havaitsemiseen muissa kotimaisissa tutkimusryhmissä. Alempi herkkyys on kuitenkin suoran sekvensoinnin suurin haitta. Kiinassa raportoitujen tulosten perusteella mutaation havaitsemisaste suoralla sekvensoinnilla ei ole alhainen. Liu Xiaojing et ai. Verrattiin suoraa sekvensointia ja peptidinukleiinihappopuristettua PCR: ää (PNA-PCR) ja havaittiin, että 43 KRAS-geenimutaation tapausta havaittiin suoralla sekvensoinnilla. Näiden mutaatioiden lisäksi PNA-PCR havaittiin myös suoralla sekvensoinnilla. Kymmenen mutaatiota löydettiin villityypistä, ja tehtiin ehdotuksia villityypin potilaiden määrittämiseksi PCR: llä ja suoralla sekvensointimenetelmällä mutanttipotilaiden määrittämiseksi. Qiu Tian et ai. Havaittu 131 kolorektaalisyövän näytettä fluoresoivalla PCR-optimoidulla oligonukleotidikoettimenetelmällä ja suoralla sekvensointimenetelmällä, ja KRAS-geenimutaatioiden positiiviset määrät olivat 41.2% (54/131) ja 40.5% (53/131). Bai Dongyu keskusteli myös eri menetelmien havaitsemisherkkyydestä. 200 kolorektaalisyöpäpotilaasta 63 havaittiin RT-qPCR-mutaatioilla, ja mutaatioiden havaitsemisaste oli 31.5%; 169 näytettä sekvensoitiin onnistuneesti sekvensoimalla 50 mutaatiotapausta, mutaation havaitsemisnopeus 29.6%. Vaikka suora sekvensointimenetelmä pystyy havaitsemaan KRAS-geenimutaatiotilan tarkasti, objektiivisesti ja spesifisesti, myös sen puutteet, kuten korkeat tekniset vaatimukset, monimutkaiset toimintamenettelyt, helppo aiheuttaa ristikontaminaatiota, ja tulosten aikaa vievä ja työläs tulkinta ovat myös hyvin ilmeinen. Usein ei ole sekvensointilaitteita, ja näyte on lähetettävä vastaavalle yritykselle testausta varten, mikä kestää kauan ja maksaa paljon, joten sillä on suuria rajoituksia.
Pyrosekvensointimenetelmä:
Pyrosekvensointimenetelmä on myös mukavampi menetelmä KRAS-geenimutaation havaitsemiseen sekvensointiherkkyyden, detektiokustannusten ja raportointiajan suhteen. Tämän menetelmän toistettavuus on parempi. Saadun huippukartan mukaan tietyn paikan mutaatiotaajuuden kvantitatiivinen tutkimus ja eri kohtaisten mutaatiotaajuuksien vertailu ovat selkeitä yhdellä silmäyksellä. Viime vuosina Ogino et ai., Hutchins et ai. Olet käyttänyt pyrosekvensointitekniikkaa KRAS-mutaatioiden testaamiseen potilailla, joilla on suuria paksusuolen ja paksusuolen syövän näytteitä. Tulokset osoittavat, että pyrosekvensointitekniikka on tehokas työkalu potilaiden seulontaan kohdennettua hoitoa varten. Kasvaimen molekyylidiagnoosilla on laaja soveltamismahdollisuus. Kotimaiset tutkijat ovat myös käyttäneet pyrosekvensointitekniikkaa KRAS-mutaatioiden kliiniseen havaitsemiseen paksusuolen syövässä hyvällä tarkkuudella ja luotettavuudella. Tällä menetelmällä on parempi spesifisyys ja suurempi herkkyys. SundstrÖm et ai. Verrattiin alleelispesifistä PCR: ää ja pyrosekvensointia kliinisissä sovelluksissa ja havaittiin, että 314 KRAS-mutaation tapauksessa kolorektaalisyöpäpotilailla pyrosekvensoinnin spesifisyys oli parempi kuin alleelien. PCR, ja sillä on hyvä herkkyys kudoksille, joilla on alhainen kasvainsolupitoisuus. Laimenna kasvainsolujen osuus 1.25 - 2.5 prosenttiin. Pyrosekvensointi voi silti havaita mutaatiosignaalit. Kun näytteen mutanttialleelien vähimmäispitoisuuden on oltava 20%, jotta se voidaan havaita Sanger-sekvensoinnilla, se voidaan havaita HRM-menetelmällä, kun se saavuttaa 10%, ja pyrosekvensoinnissa vain 5% voi havaita mutaatiot. Alleelit. Käytimme pyrosekvensointia KRAS-mutaatioiden havaitsemiseksi 717 kolorektaalisyöpää sairastavalla potilaalla ja havaitsimme, että KRAS-mutaatioiden taajuus oli 40.9%. Kodonin 12 mutaatioaste oli 30.1%, kodonin 13 mutaatioaste oli 9.8% ja kodonin 61 mutaatioaste oli 1.0%. Rikastimme kudokset korkeammalla kasvainpitoisuudella manuaalisella mikrodissektiolla ennen testausta, mikä teki tuloksista luotettavampia. Menetelmällä on hyvä herkkyys ja spesifisyys, ja se on helppo kehittää kliinisessä käytännössä. Pyrosekvensoinnin haittana on korkeat havaitsemiskustannukset, ja prosessi yksisäikeisen DNA: n valmistamiseksi näytteiden sekvensoimiseksi on hankala. Tulevaisuudessa pyrosekvensointi voidaan kohdistaa kaksisäikeisten PCR-tuotteiden suoran havaitsemisen tekniikan kehittämiseen, mikä yksinkertaistaa huomattavasti toimintaa. Alenna sekvensointikustannuksia tehokkaasti kliinisen testauksen kattavan edistämisen saavuttamiseksi.
3. ARMS-menetelmä:
Tämä tekniikka käyttää alukkeita erottamaan villityypin ja mutanttigeenit, wh
on raportoitu jo 1980-luvulla. Tämän menetelmän suurin etu on, että sen herkkyys on jopa 1.0% ja se pystyy havaitsemaan mutanttigeenit niinkin alhaisissa näytteissä. Suunnittelussa kohdetuotteen pituutta voidaan lyhentää suurimmaksi osaksi, ja ongelmaa, jota ei voida saada tarkkoja havaintotuloksia, koska suurin osa parafiiniin upotetusta kudosnäytteestä uutetusta DNA: sta on fragmentoitunut. Tämä tekniikka yhdistää reaaliaikaisen PCR-alustan suljetun putken toiminnan aikaansaamiseksi vahvistuksen aikana. Toimenpide on yksinkertainen eikä vaadi tuotteen jälkikäsittelyä, mikä voi välttää monistetun tuotteen kontaminoitumisen suurimmaksi osaksi. Tällä hetkellä maailmassa käytetään yleisemmin skorpioni-ARMS-menetelmää, joka yhdistää skorpionikoettimen ja amplifikaatiolohkomutaatiojärjestelmän. Kahden tekniikan yhdistelmä voi maksimoida molempien osapuolten herkkyyden ja spesifisyyden. Gao Jie et ai. Käytti tätä menetelmää KRAS-geenimutaatiotilan havaitsemiseen 1.0 paksusuolen syöpää sairastavalla potilaalla, mikä viittaa siihen, että tämä menetelmä on luotettava ja tarkka. Wang Hui et ai. Käytettiin myös ARMS: ää KRAS-mutaatioiden havaitsemiseen 167 tapauksessa formaldehydiin kiinnittyneissä ja parafiiniin upotetuissa kudoksissa. Yhdysvalloissa FDA: n hyväksymä COBAS-pakkaus (Roche) KRAS: n kliinisiin testeihin ja Euroopan unionin in vitro -diagnostiikan (CE-IVD) sertifioima Therascreen RGQ -sarja (Qiagen) käyttävät kaikki ARMS-periaatetta. Yleisimmistä menetelmistä ARMS-menetelmä on herkin ja kustannukset ovat suhteellisen kohtuulliset. Siksi suuri osa KRAS-geenien kliinisestä havainnoinnista kotimaassa ja ulkomailla käyttää ARMS-menetelmää, mutta koska menetelmä perustuu PCR-tekniikkaan, sen puute on, että se voidaan havaita vain tunnettujen paikkamutaatioiden avulla.
4. Reaaliaikainen kvantitatiivinen fluoresenssin kvantitatiivinen menetelmä:
Se on PCR-pohjainen detektiomenetelmä mutaation määrittämiseksi Ct-arvon perusteella. Sen etuna on vahva spesifisyys, korkea herkkyys, tarkka määritys, helppo käyttö ja täysin suljettu reaktio. Monet kokeelliset ryhmät ovat omaksuneet tämän menetelmän KRAS-mutaatioiden havaitsemiseksi paksusuolen syövässä. Suoraan sekvensointimenetelmään verrattuna kvantitatiivisella PCR: llä on suurempi etu herkkyydessä. Useimmat tutkijoita vertailevat kahta menetelmää uskovat, että kvantitatiivinen PCR on herkempi. Liu Wei et ai. Käytettiin kahta menetelmää yksityiskohtaisen analyysin tekemiseen 280 paksusuolen ja paksusuolen syövän KRAS-geenimutaation tapauksesta, 94 KRAS-geenisekvensointimutaation tapauksesta, positiivinen osuus oli 33.57% (94/280), josta reaaliaikainen kvantitatiivinen fluoresenssi PCR oli positiivinen 91 tapauksen herkkyys oli 96.8% (91/94). 186 villityypin sekvensoivasta geenisekvenssistä 184 oli reaaliaikaisen kvantitatiivisen PCR: n avulla negatiivisia, spesifisyydellä 98.9% (184/186). Reaaliaikaisen fluoresenssikvantitatiivisen PCR-menetelmän ja suoran geenisekvensointimenetelmän välinen sattuma oli 98.2%. Kahdessa detektiomenetelmässä kunkin mutaatiokohdan positiivinen ja negatiivinen sattuma oli yli 90%, ja neljän kohdan sattuma oli 100%. Kahden menetelmän havaintotulokset olivat erittäin yhdenmukaisia, mikä osoitti fluoresoivan kvantitatiivisen PCR: n. Se on luotettavampi menetelmä mutaation havaitsemiseksi. PCR-pohjaisten menetelmien on kuitenkin suunniteltava alukkeet ja koettimet tunnettujen mutaatiotyyppien perusteella, joten kaikkia mahdollisia mutaatioita ei voida havaita ja vain tietyt kohdat voidaan havaita. Jos tiettyä kohtaa ei sisälly paketin ilmaisualueelle, vaikka mutaatio tosiasiallisesti esiintyisi, sarjan tulos on silti negatiivinen. Lisäksi, vaikka kvantitatiivisen PCR: n herkkyys on korkea, onko vääriä positiivisia tuloksia, on vielä varmistettava DNA-sekvensointitekniikalla tai retrospektiivisillä ja prospektiivisilla kliinisillä kokeilla suurilla näytekokoilla KRAS-mutaatiotilan ja kohdennetun tehon välisen korrelaation vahvistamiseksi. huumeita. Siksi mutaation havaitsemisen suurta herkkyyttä ei pitäisi pyrkiä sokeasti, kun taas havaitsemisen spesifisyyttä ja tarkkuutta tulisi jättää huomioimatta. Eri laboratorio-olosuhteissa optimaalinen menetelmä mutaation havaitsemiseksi näytteissä voi myös olla erilainen. Näytteillä, joilla on suurempi mutaatioiden osuus, Sanger-sekvensointimenetelmällä on suurempi tarkkuus geenimutaatioiden havaitsemisessa, kun taas näytteillä, joilla on pienempi mutaatioiden osuus, Sanger-sekvensointimenetelmä voi esiintyä vääriä negatiivisia ja detektiomenetelmä, jossa teknisenä alustana käytetään fluoresoivaa PCR: ää voidaan luonnehtia korkealle herkkyydelle.
5. HRM-menetelmä:
Se on yksi viime vuosina yleisimmin käytetyistä geenien havaitsemismenetelmistä. Sillä on yksinkertaisen, nopean, herkän ja yhden putken edut pilaantumisen välttämiseksi. Liu Liqin ja muut käyttivät HRM-menetelmää KRAS-geenimutaatioiden havaitsemiseksi 64 kolorektaalisyöpää sairastavalla potilaalla ja käyttivät sitten suoraa sekvensointia tulosten todentamiseksi tutkiakseen sen käytön toteutettavuutta kliinisissä testeissä. HRM: n ja suoran sekvensoinnin tulosten havaitaan olevan johdonmukaisia. Suoraan sekvensointiin verrattuna KRAS-geenimutaatioiden havaitseminen HRM: llä on yksinkertaista ja tarkkaa, mikä viittaa siihen, että se on luotettava menetelmä, joka soveltuu kliiniseen testaukseen. Chen Zhihong et ai. Käytettiin HRM-menetelmää sekoitettujen näytteiden sarjan testaamiseksi, jotka sisälsivät eri suhteita KRAS-mutanttiplasmideja niiden herkkyyden arvioimiseksi. Havaittiin, että plasmidimutaatioiden osuus sekoitetuissa näytteissä oli 10% ja herkkyys saavutti 10%. Myöhemmin menetelmää käytettiin KRAS-geenimutaatioiden havaitsemiseksi 60 paksusuolen syöpäkudosnäytteessä. Suoraan sekvensointimenetelmään verrattuna HRM-menetelmän herkkyys oli 100% ja spesifisyys 96% (43/45). HRM-menetelmän haittana on, että on mahdotonta antaa tarkasti spesifistä mutaatiotyyppiä ja mikä kodoni on mutatoitunut. Jos sulamiskäyrällä havaitaan poikkeavuuksia, tarvitaan sekvensointimenetelmä mutaatiotyypin määrittämiseksi. Harlén tutkimusryhmä käytti 156 kolorektaalisen syöpäkudoksen tapausta verrattaessa fluoresoivia PCR-, ARMS- ja HRM-menetelmiä. Tulokset viittaavat siihen, että vaikka nämä kolme menetelmää sopivat kliiniseen testaukseen, HRM: n luotettavuus ei ole yhtä hyvä kuin kaksi muuta menetelmää.
6. Muut menetelmät:
Edellä mainittujen menetelmien lisäksi muilla detektiomenetelmillä on omat etunsa ja haittansa sovelluksessa, kuten PCR-SSCP, korkean suorituskyvyn nestekromatografia, fluoresoiva PCR-optimoitu oligonukleotidikoettimenetelmä, sisäkkäisen PCR: n ja ARMS-yhdistelmän menetelmä, COLD-PCR menetelmä jne. Korkean suorituskyvyn nestekromatografialla on vahva spesifisyys, mutta näytteiden kysyntä on suuri; PCR-SSCP on edullinen ja taloudellinen, mutta toiminta on monimutkaista; fluoresoivaan PCR: ään perustuvalla mutaatiotunnistustekniikalla on vahva spesifisyys, korkea herkkyys ja tarkka kvantitatiivinen, helppo käyttö, täysin estetty reaktio ja muita etuja, mutta kaikkien on suunniteltava alukkeet ja koettimet tunnetun mutaatiotyypin mukaan, joten vain tietyt kohdat voidaan määrittää kaikkia mahdollisia mutaatioita ei voida havaita.
3. Yhteenveto
Yhteenvetona voidaan todeta, että koska mutaatiokohdat ja havaitsemismenetelmät eri laboratorioissa eivät ole yhdenmukaisia, analysoitujen kasvainnäytteiden koko ja DNA-uuton laatu ovat myös epätasaiset, mikä johtaa laboratorioiden välillä suurien tai pienten kokeiden tulosten eroihin, standardointiin KRAS-geenimutaation havaitsemisesta on tullut kliininen havaitsemiskysymys, joka on huolestuttava useissa maissa. Tällä hetkellä on olemassa monia menetelmiä mutaatioiden havaitsemiseksi KRAS-geenissä. Herkkyys korkeasta matalaan on ARMS, pyrosekvensointi, HRM, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja suora sekvensointi. Kliinisestä todellisuudesta johtuen alhainen herkkyys ei edistä kliinistä hoitoa, mutta liian herkät menetelmät aiheuttavat havaitsemisspesifisyyden heikkenemisen, ja saattaa ilmetä tarpeettomia vääriä positiivisia tuloksia ja vaikuttaa potilaan seuraavaan lääkitysohjelmaan. Ottaen huomioon edellä mainitut näkökohdat yhdistettynä FDA: n hyväksymään menetelmään ARMS-menetelmä on suositeltava. Markkinoiden näkökulmasta molekyylidiagnostiikan ei tietenkään pitäisi korostaa minua
thods, mutta keskity lopullisiin oikeisiin tuloksiin. Eri laboratoriot voivat ottaa käyttöön sopivia testausmenetelmiä todellisen tilanteen mukaan, mutta vain, jos niillä on hyvä toimijan pätevyys ja sisäiset laadunvalvontajärjestelmät. Nykyisissä kotimaisissa laboratorioympäristöolosuhteissa on välttämätöntä suorittaa testaus standardoidussa PCR-laboratoriossa ja osallistua kotimaisiin ja kansainvälisiin huoneiden välisiin laadunvalvontatoimintoihin luotettavan laboratoriotestien laadun varmistamiseksi. Standardoitu hallinta on välttämätön edellytys jatkuvien tulosten varmistamiseksi. Kiinassa on kiireellinen tarve yhtenäistää ja standardoida KRAS-geenin kliininen testaus sekä luoda standardisoitu ja standardoitu testausohjelma eri tarpeiden mukaan, ja tämä ohjelma voidaan laajentaa BRAF-, PIK23450_3CA-, EGFR- ja muiden geenien havaitsemiseen kliinisen molekyylipatologian testauksen edistämiseksi.
