Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Tingkat positip mutasi gén KRAS dina kanker koloréktal
Dina kanker koloréktal, tingkat mutasi gén KRAS saluhur 35% dugi ka 45%, sareng situs mutasi anu résiko tinggi nyaéta codon 12 sareng 13 dina exon 2, sareng masih aya anu jarang sapertos 61 sareng 146. Mutasi situs. Aya seueur metode deteksi pikeun mutasi gén KRAS, kalebet urutan langsung, analisis kurva lebur résolusi tinggi (HRM), pyrosequencing, PCR kuantitatif, sistem blok amplifikasi mutasi (amplinc atio) sistem nrefractorymutation (ARMS), watesan fragméntasi panjang polimorfisme (RFLP), analisis polimérase réaksi-tunggal-untaian konformasi analisis polimorfisme (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), ko-amplifikasi dina déaturasi handap temperatur PCR (COLD-PCR) sareng kinerja kromatografi cair kinerja tinggi, jst.
2. Evaluasi metode deteksi mutasi KRAS
1. Metode ngaruntuy langsung: Mangrupikeun metode anu paling klasik pikeun ngadeteksi mutasi gén KRAS, sareng éta ogé standar emas pikeun ngadeteksi mutasi gén. Metodeu ngaruntuy langsung dumasar kana prinsip sekuen dideoxy anu paling intuitifna tiasa nunjukkeun parobihan sekuen gén dina bentuk peta puncak dasar. Jinis deteksi langkung lengkep, sareng éta ogé metode deteksi mutasi anu paling mimiti. Sanaos munculna platform séri generasi anyar, sarjana di bumi sareng di mancanagara tetep nganggo hasil urutan langsung salaku skala pikeun ngukur sareng nangtoskeun réliabilitas metode anyar. Gao Jing dkk. Dilarapkeun langsung kana sekuen deteksi KRAS sareng mutasi gén BRAF di 966 pasién sareng kanker koloréktal. Ieu ogé analisis mutasi gén KRAS kalayan sampel doméstik panggedéna dilaporkeun dina literatur. Ling Yun sareng anu sanésna yakin yén cara ngaruntuykeun langsung nyaéta metode deteksi anu paling langsung sareng épéktip pikeun ngartos status mutasi unggal gén, anu tiasa netelakeun jinis mutasi, khususna pikeun deteksi mutasi anu teu dikenal. Sanaos sensitipitas metoda ieu kawilang rendah, éta tiasa ditingkatkeun ku cara sapertos microdissection pikeun ngeuyeuban sél tumor. Métode ngaruntuy langsung ogé parantos dilarapkeun kana deteksi KRAS ukuran sampel anu langkung ageung di grup panilitian domestik anu sanés. Nanging, sensitipitas anu handap mangrupikeun karugian anu paling gedé tina sekuen langsung. Ditilik tina hasil anu dilaporkeun di Cina, tingkat deteksi mutasi ku sekuens langsung henteu handap. Liu Xiaojing dkk. Dibandingkeun sekuens langsung sareng péptida asam nukléat clamp PCR (PNA-PCR) sareng mendakan yén 43 kasus mutasi gén KRAS dideteksi ku sekuens langsung. Salaku tambahan kana mutasi ieu, PNA-PCR ogé kauninga ku sekuens langsung. Sapuluh mutasi dipendakan dina jinis liar, sareng saran disebatkeun pikeun nangtoskeun pasién jinis liar ku PCR sareng metode ngaruntuy langsung pikeun nangtoskeun pasién mutan. Qiu Tian dkk. Dideteksi 131 spésimén kanker koloréktal ku metode usik oligonukleotida PCR-dioptimalkeun fluorescent sareng metode urutan langsung, sareng tingkat positif mutasi gén KRAS nyaéta 41.2% (54/131) sareng 40.5% (53/131)). Bai Dongyu ogé ngabahas sensitipitas detéksi tina metode anu béda. Tina 200 pasién kanker koloréktal, 63 kauninga ku mutasi RT-qPCR, sareng tingkat deteksi mutasi 31.5%; 169 sampel hasil diteruskeun ku sekuen langsung 50 kasus mutasi, tingkat deteksi mutasi 29.6%. Sanaos metode panyusunan langsung tiasa akurat, obyektif sareng khusus ngadeteksi status mutasi gén KRAS, kakiranganna sapertos syarat téknis tinggi, prosedur operasi rumit, gampang disababkeun kontaminasi silang, sareng interpretasi anu nyéépkeun waktos sareng damel pikeun hasil ogé saé pisan atra. Seringna teu aya peralatan sekuensina, sareng spésimenna kedah dikirim ka perusahaan anu saluyu pikeun diuji, anu peryogi waktos anu lami sareng gaduh biaya anu tinggi, janten ngagaduhan watesan anu hébat.
Metode pyrosequencing:
Métode pyrosequencing ogé mangrupikeun padika anu langkung merenah pikeun deteksi mutasi gén KRAS dina hal sensitipitas urutan, biaya deteksi sareng waktos ngalaporkeun. Pangulangan tina metode ieu langkung saé. Numutkeun peta puncak anu di pikagaduh Panilitian kuantitatif frékuénsi mutasi situs anu tangtu sareng perbandingan antara frékuénsi mutasi situs anu béda-béda jelas dina pandangan. Dina taun-taun ayeuna, Ogino dkk., Hutchins dkk. Parantos nganggo téknologi pyrosequencing pikeun nguji mutasi KRAS di pasién anu ngagaduhan sampel kanker koloréktal ageung. Hasilna nunjukkeun yén téknologi pyrosequencing mangrupikeun alat anu kuat pikeun nyaring penderita pikeun terapi anu ditujukeun. Diagnosis molekular tumor ngagaduhan prospek aplikasi anu lega. Sarjana domestik ogé parantos nganggo téknologi pyrosequencing pikeun sacara klinis ngadeteksi mutasi KRAS dina kanker koloréktal, kalayan akurasi sareng reliabilitas anu saé. Metoda ieu ngagaduhan spésifisitas anu langkung saé sareng sensitipitas anu langkung luhur. SundstrÖm dkk. Dibandingkeun alél-spésifik PCR sareng pyrosequencing dina aplikasi klinis sareng mendakan yén dina 314 kasus mutasi KRAS di pasién kanker koloréktal, kekhususan pyrosequencing langkung unggul tibatan alél. PCR, sareng ngagaduhan sénsitip anu saé pikeun jaringan sareng eusi sél tumor anu handap. Éncér proporsi sél tumor janten 1.25% dugi ka 2.5%. Pyrosequencing masih tiasa mendakan sinyal mutasi. Nalika eusi minimum alél mutan dina sampel kedah ngahontal 20% pikeun dideteksi ku urutan Sanger, éta tiasa dideteksi ku metode HRM nalika ngahontal 10%, sareng pikeun pyrosequencing ngan ukur mutasi tiasa dideteksi ku 5%. Alélés. Kami nganggo pyrosequencing pikeun ngadeteksi mutasi KRAS di 717 penderita kanker koloréktal sareng mendakan yén frékuénsi mutasi KRAS nyaéta 40.9%. Tingkat mutasi codon 12 nyaéta 30.1%, tingkat mutasi codon 13 9.8%, sareng tingkat mutasi codon 61 nyaéta 1.0%. Kami ngabeungharkeun jaringan kalayan eusi tumor anu langkung luhur ku microdissection manual sateuacan diuji, sahingga hasilna langkung dipercaya. Cara na ngagaduhan sensitipitas sareng spésifisitas anu saé, sareng gampang dikembangkeun dina prakték klinis. Kalemahan pyrosequencing mangrupikeun biaya deteksi anu luhur, sareng prosés nyiapkeun DNA tunggal terdampar pikeun ngaruntuykeun sampel nyaéta rumit. Di pikahareupeun, pyrosequencing tiasa dikhususkeun pikeun pamekaran téknologi pikeun deteksi langsung produk PCR dua-terdampar, anu bakal mempermudah operasi. Sareng sacara épéktip ngirangan biaya urutan kanggo ngahontal promosi komprehensif ngeunaan uji klinis.
3. metode ARMS:
Téknologi ieu ngagunakeun primér pikeun ngabédakeun jinis liar sareng gén mutant, wh
ich parantos dilaporkeun ti mimiti taun 1980an. Kauntungan pangbadagna tina metode ieu nyaéta ngagaduhan sensitipitas dugi ka 1.0% sareng tiasa mendakan gén mutan dina sampel sakumaha handap 1.0%. Dina rarancang, panjang produk udagan tiasa disingget dugi ka saageungna, sareng masalah anu hasil deteksi anu akurat henteu tiasa dicandak kumargi seuseueurna DNA anu diekstraksi tina spésimen jaringan anu dilebetkeun parafin fragmented. Téknologi ieu ngagabungkeun platform PCR real-time pikeun ngahontal operasi tabung tertutup nalika panguat. Operasiana saderhana sareng henteu meryogikeun post-processing produk, anu tiasa nyingkahan kontaminasi produk anu dikuatkeun dugi ka saageungna. Ayeuna, metode kalajengking-ARMS ngagabungkeun usik kalajengking sareng sistem mutasi blok amplifikasi langkung umum dianggo di dunya. Kombinasi dua téknologi tiasa ngamaksimalkeun sensitipitas sareng spésifisitas tina dua sisi. Gao Jie dkk. Dipaké cara ieu pikeun ngadeteksi status mutasi gén KRAS di 167 pasién kanker kanker kolorékal, nunjukkeun yén cara ieu tiasa dipercaya sareng akurat. Wang Hui dkk. Ogé digunakeun ARMS pikeun ngadeteksi mutasi KRAS dina 151 kasus jaringan formaldehida-dibereskeun sareng parafin-embedded. Di Amérika Serikat, kit COBAS (Roche) disatujuan ku FDA pikeun uji klinis KRAS sareng Therascreen RGQ kit (Qiagen) anu disahkeun ku Uni Éropa Dina Vitro Diagnostics (CE-IVD) sadayana nganggo prinsip ARMS. Diantara metode anu umum, metode ARMS anu paling peka sareng biayana lumayan lumayan. Kusabab kitu, bagian ageung tina deteksi klinis gen KRAS di bumi sareng di luar negeri nganggo metode ARMS, tapi kusabab cara na dumasarkeun kana téknologi PCR, kakurangannana nyaéta ngan tiasa dideteksi Mutasi situs anu dipikaterang.
4. Metode PCR kuantitatif kuantitas nyata-waktos:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. metode HRM:
Éta mangrupikeun salah sahiji metode deteksi gén anu langkung sering dianggo dina sababaraha taun terakhir. Éta ngagaduhan kaunggulan tabung saderhana, gancang, sénsitip, sareng tunggal pikeun nyingkahan polusi. Dina raraga ngajajah kasaluyuan panggunaanna dina uji klinis, Liu Liqin sareng anu sanésna nganggo metode HRM pikeun ngadeteksi mutasi gén KRAS di 64 pasién anu ngagaduhan kanker koloréktal, teras nganggo sekuen langsung pikeun verifikasi hasilna. Hasil tina HRM sareng sekuens langsung dipendakan janten konsistén. Dibandingkeun sareng sekuen langsung, deteksi mutasi gén KRAS ku HRM saderhana sareng akurat, nunjukkeun yén éta mangrupikeun cara anu dipercaya pikeun uji klinis. Chen Zhihong dkk. Nganggo metodeu HRM pikeun nguji sababaraha conto campuran anu ngandung babandingan anu béda tina KRAS plasmid mutant pikeun ngaevaluasi sénsitipna. Kapanggih yén proporsi mutasi plasmid dina sampel campuran nyaéta 10%, sareng sénsitipna ngahontal 10%. Salajengna, metoda ieu dianggo pikeun ngadeteksi mutasi gén KRAS dina 60 sampel jaringan kanker koloréktal. Dibandingkeun sareng metode urutan langsung, sénsitip tina metode HRM nyaéta 100%, sareng spésifisitas nyaéta 96% (43/45). Karugian tina metode HRM nyaéta mustahil akurat nyayogikeun jinis mutasi khusus sareng codon mana anu dimutasi. Upami kalainan dipendakan dina kurva lebur, cara nyusun urutan diperyogikeun pikeun nangtoskeun jinis mutasi. Grup panalitian Harlé ngagunakeun 156 kasus jaringan kanker koloréktal pikeun ngabandingkeun metode PCR, ARMS sareng HRM fluoresensi. Hasilna nunjukkeun yén sanaos tilu padika cocog pikeun uji klinis, réliabilitas HRM henteu saé sareng dua padika anu sanés.
6. Métode sanésna:
Salaku tambahan kana metodeu anu kasebut di luhur, metode deteksi sanés gaduh kaunggulan sareng karugian masing-masing dina aplikasi, sapertos PCR-SSCP, kromatografi cair kinerja tinggi, metoda usik oligonukleotida PCR-dioptimalkeun fluoresensi, Metodeu PCR sareng kombinasi ARMS anu tersandung, COLD-PCR metode, jsb. Kromatografi cair kinerja tinggi gaduh spésifisitas anu kuat, tapi paménta pikeun sampel ageung; PCR-SSCP murah biaya sareng ekonomis, tapi operasi rumit; téknologi deteksi mutasi dumasar kana PCR fluorescent gaduh spésifisitas anu kuat, sensitipitas tinggi, sareng kuantitatif anu akurat, Operasi gampang, réaksi anu diblokir lengkep sareng kaunggulan anu sanés, tapi sadayana kedah ngarancang primér sareng usik numutkeun jinis mutasi anu dipikaterang, janten ngan ukur situs khusus anu tiasa janten dideteksi, sareng sadaya kamungkinan mutasi henteu tiasa dideteksi.
3. Kasimpulan
Ringkesna, kusabab situs mutasi sareng metode deteksi di laboratorium anu béda henteu seragam, ukuran spésimén tumor dianalisis sareng kualitas ékstraksi DNA ogé henteu rata, hasilna ayana hasil ékspérimén ageung atanapi alit antara Béda laboratorium, standarisasi tina deteksi mutasi gén KRAS parantos janten masalah deteksi klinis anu janten perhatian di sagala rupa nagara. Ayeuna, aya seueur cara pikeun ngadeteksi mutasi dina gén KRAS. Sensitipitas tina luhur ka handap nyaéta ARMS, pyrosequencing, HRM, PCR kuantitatif real-time, sareng sekuens langsung. Tina kanyataan klinis, sensitipitas anu handap henteu kondusif pikeun perlakuan klinis, tapi padika anu sénsitip teuing bakal nyababkeun spésifisitas deteksi turun, sareng hasilna positip palsu anu henteu perlu tiasa lumangsung sareng mangaruhan rézim pangobatan anu salajengna. Mertimbangkeun aspék di luhur, digabungkeun sareng metode anu disatujuan ku FDA, metode ARMS disarankeun. Tangtosna, tina sudut pandang pasar, diagnostik molekular teu kedah nekenkeun kuring
thods, tapi fokus kana hasil ahir bener. Laboratorium anu béda-béda tiasa ngadopsi metodeu tés anu cocog dumasar kana kaayaan anu saleresna, tapi ngan upami aranjeunna gaduh kualifikasi operator anu saé sareng sistem kontrol kualitas internal. Dina kaayaan lingkungan laboratorium domestik ayeuna, perlu pikeun ngalaksanakeun tés dina laboratorium PCR standar sareng ilubiung dina kagiatan kontrol kualitas antar-kamar domestik sareng internasional pikeun mastikeun kualitas tés laboratorium anu dipercaya. Manajemén standar mangrupikeun kaayaan anu dipikabutuh pikeun mastikeun hasil anu konstan. Di Cina, aya hiji kabutuhan urgent pikeun ngahijikeun jeung standarisasi tes klinis gén KRAS, sarta pikeun ngahasilkeun program tés standardized jeung standarisasi nurutkeun pangabutuh béda, sarta program ieu bisa diperpanjang pikeun deteksi BRAF, PIK23450_3CA, EGFR jeung gén séjén pikeun ngamajukeun tés patologi molekular klinis.
