Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Tỷ lệ dương tính của đột biến gen KRAS trong ung thư đại trực tràng
Trong ung thư đại trực tràng, tỷ lệ đột biến gen KRAS cao từ 35% đến 45%, và vị trí đột biến có nguy cơ cao là codon 12 và 13 trên exon 2, và vẫn có những gen hiếm gặp như 61 và 146. Đột biến. Địa điểm. Có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gen KRAS, bao gồm giải trình tự trực tiếp, phân tích đường cong nóng chảy có độ phân giải cao (HRM), lập phương pháp pyrosequencing, PCR định lượng, hệ thống khối khuếch đại đột biến (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP) polymerase chain reaction-phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), đồng khuếch đại ở nhiệt độ biến tính thấp hơn PCR (COLD-PCR) và phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, v.v.
2. Đánh giá các phương pháp phát hiện đột biến KRAS
1. Phương pháp giải trình tự trực tiếp: Đây là phương pháp cổ điển nhất để phát hiện đột biến gen KRAS, và nó cũng là tiêu chuẩn vàng để phát hiện đột biến gen. Phương pháp giải trình tự trực tiếp dựa trên nguyên tắc giải trình tự dideoxy có thể cho thấy một cách trực quan nhất sự thay đổi của trình tự gen dưới dạng bản đồ đỉnh cơ sở. Loại phát hiện toàn diện hơn, và nó cũng là phương pháp phát hiện đột biến được áp dụng sớm nhất. Bất chấp sự xuất hiện của các nền tảng giải trình tự thế hệ mới, các học giả trong và ngoài nước vẫn sử dụng kết quả giải trình tự trực tiếp như một thang đo để đo lường và xác định độ tin cậy của phương pháp mới. Gao Jing và cộng sự. Đã áp dụng giải trình tự trực tiếp để phát hiện đột biến gen KRAS và BRAF ở 966 bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Đây cũng là kết quả phân tích đột biến gen KRAS với mẫu nội địa lớn nhất được báo cáo trong tài liệu. Ling Yun và những người khác tin rằng phương pháp giải trình tự trực tiếp là phương pháp phát hiện trực tiếp và hiệu quả nhất để hiểu tình trạng đột biến của từng gen, có thể làm rõ loại đột biến, đặc biệt là để phát hiện các đột biến chưa biết. Mặc dù độ nhạy của phương pháp này tương đối thấp, nhưng nó có thể được cải thiện bằng các phương pháp như vi phân cắt để làm giàu tế bào khối u. Phương pháp giải trình tự trực tiếp cũng đã được áp dụng để phát hiện KRAS ở các cỡ mẫu lớn hơn trong các nhóm nghiên cứu trong nước khác. Tuy nhiên, độ nhạy thấp hơn là nhược điểm lớn nhất của giải trình tự trực tiếp. Đánh giá từ các kết quả được báo cáo ở Trung Quốc, tỷ lệ phát hiện đột biến bằng giải trình tự trực tiếp là không thấp. Liu Xiaojing và cộng sự. So sánh giải trình tự trực tiếp và PCR kẹp axit nucleic peptide (PNA-PCR) và thấy rằng 43 trường hợp đột biến gen KRAS được phát hiện bằng cách giải trình tự trực tiếp. Ngoài những đột biến này, PNA-PCR cũng được phát hiện bằng cách giải trình tự trực tiếp. Mười đột biến đã được tìm thấy ở dạng hoang dã và các đề xuất đã được đưa ra để xác định bệnh nhân dạng hoang dã bằng PCR và phương pháp giải trình tự trực tiếp để xác định bệnh nhân đột biến. Qiu Tian và cộng sự. Phát hiện 131 mẫu ung thư đại trực tràng bằng phương pháp thăm dò oligonucleotide tối ưu hóa PCR huỳnh quang và phương pháp giải trình tự trực tiếp, và tỷ lệ dương tính với đột biến gen KRAS là 41.2% (54/131) và 40.5% (53/131). Bai Dongyu cũng thảo luận về độ nhạy phát hiện của các phương pháp khác nhau. Trong số 200 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 63 bệnh nhân được phát hiện do đột biến RT-qPCR, và tỷ lệ phát hiện đột biến là 31.5%; 169 mẫu được giải trình tự thành công bằng giải trình tự trực tiếp 50 trường hợp đột biến, tỷ lệ phát hiện đột biến 29.6%. Mặc dù phương pháp giải trình tự trực tiếp có thể phát hiện chính xác, khách quan và cụ thể tình trạng đột biến gen KRAS, nhưng những khuyết điểm của nó như yêu cầu kỹ thuật cao, quy trình vận hành phức tạp, dễ gây nhiễm chéo, và việc giải thích kết quả cũng rất tốn thời gian và công sức. hiển nhiên. Thường thì không có thiết bị giải trình tự, và bệnh phẩm cần phải được gửi đến công ty tương ứng để xét nghiệm, mất nhiều thời gian và chi phí cao nên có hạn chế lớn.
Phương pháp tìm kiếm bằng lửa:
Phương pháp xác định trình tự bằng lửa cũng là một phương pháp thuận tiện hơn để phát hiện đột biến gen KRAS về độ nhạy của trình tự, chi phí phát hiện và thời gian để báo cáo. Độ lặp lại của phương pháp này tốt hơn. Theo bản đồ đỉnh thu được Việc nghiên cứu định lượng tần số đột biến của một vị trí nhất định và so sánh giữa các tần số đột biến của các vị trí khác nhau là rõ ràng trong nháy mắt. Trong những năm gần đây, Ogino và cộng sự, Hutchins và cộng sự. Đã sử dụng công nghệ pyrosequencing để kiểm tra đột biến KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng mẫu lớn. Kết quả chỉ ra rằng công nghệ pyrosequencing là một công cụ mạnh mẽ để sàng lọc bệnh nhân cho liệu pháp nhắm mục tiêu. Chẩn đoán phân tử khối u có triển vọng ứng dụng rộng rãi. Các học giả trong nước cũng đã sử dụng công nghệ pyrosequencing để phát hiện lâm sàng các đột biến KRAS trong ung thư đại trực tràng, với độ chính xác và độ tin cậy cao. Phương pháp này có độ đặc hiệu tốt hơn và độ nhạy cao hơn. SundstrÖm và cộng sự. So sánh PCR đặc hiệu với alen và giải pháp pyrose trong các ứng dụng lâm sàng và phát hiện ra rằng trong 314 trường hợp đột biến KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, tính đặc hiệu của giải pháp pyrose cao hơn so với các alen. PCR, và có độ nhạy tốt với các mô có hàm lượng tế bào khối u thấp. Pha loãng tỷ lệ tế bào khối u từ 1.25% đến 2.5%. Pyrosequencing vẫn có thể phát hiện tín hiệu đột biến Khi hàm lượng tối thiểu của các alen đột biến trong mẫu cần đạt 20% để được phát hiện bằng giải trình tự Sanger, nó có thể được phát hiện bằng phương pháp HRM khi nó đạt 10% và đối với giải mã bằng hỏa tinh chỉ có thể phát hiện được 5% đột biến. Các alen. Chúng tôi sử dụng pyrosequencing để phát hiện đột biến KRAS ở 717 bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng và thấy rằng tần suất đột biến KRAS là 40.9%. Tỷ lệ đột biến của codon 12 là 30.1%, tỷ lệ đột biến của codon 13 là 9.8% và tỷ lệ đột biến của codon 61 là 1.0%. Chúng tôi đã làm giàu các mô có hàm lượng khối u cao hơn bằng phương pháp dò tìm vi mô thủ công trước khi thử nghiệm, làm cho kết quả đáng tin cậy hơn. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu tốt, dễ phát triển trong thực hành lâm sàng. Nhược điểm của giải trình tự pyrose là chi phí phát hiện cao và quá trình chuẩn bị DNA sợi đơn để giải trình tự các mẫu rất phức tạp. Trong tương lai, quá trình pyrosequencing có thể được dành cho sự phát triển của công nghệ phát hiện trực tiếp các sản phẩm PCR sợi đôi, điều này sẽ giúp đơn giản hóa hoạt động một cách đáng kể. Và giảm hiệu quả chi phí giải trình tự để đạt được sự thúc đẩy toàn diện của thử nghiệm lâm sàng.
3. Phương pháp ARMS:
Công nghệ này sử dụng các đoạn mồi để phân biệt giữa gen kiểu hoang dã và gen đột biến, wh
ich đã được báo cáo ngay từ những năm 1980. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có độ nhạy lên đến 1.0% và có thể phát hiện các gen đột biến trong mẫu thấp tới 1.0%. Trong thiết kế, chiều dài của sản phẩm mục tiêu có thể được rút ngắn đến mức lớn nhất, và vấn đề là không thể thu được kết quả phát hiện chính xác vì phần lớn DNA chiết xuất từ mẫu mô nhúng parafin bị phân mảnh. Công nghệ này kết hợp nền tảng PCR thời gian thực để đạt được hoạt động ống kín trong quá trình khuếch đại. Quá trình vận hành đơn giản và không cần xử lý sau sản phẩm, điều này có thể tránh được sự nhiễm bẩn của sản phẩm khuếch đại ở mức độ lớn nhất. Hiện nay, phương pháp ARMS bọ cạp kết hợp đầu dò bọ cạp và hệ thống đột biến khối khuếch đại được sử dụng phổ biến hơn trên thế giới. Sự kết hợp của hai công nghệ có thể tối đa hóa độ nhạy và độ đặc hiệu của cả hai bên. Gao Jie và cộng sự. Đã sử dụng phương pháp này để phát hiện tình trạng đột biến gen KRAS ở 167 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, cho thấy rằng phương pháp này đáng tin cậy và chính xác. Wang Hui và cộng sự. Cũng được sử dụng ARMS để phát hiện đột biến KRAS trong 151 trường hợp mô được cố định bằng formaldehyde và nhúng parafin. Tại Hoa Kỳ, bộ COBAS (Roche) đã được FDA chấp thuận để kiểm tra lâm sàng KRAS và bộ Therascreen RGQ (Qiagen) được chứng nhận bởi Liên minh Châu Âu về chẩn đoán trong ống nghiệm (CE-IVD) đều sử dụng nguyên tắc ARMS. Trong số các phương pháp phổ biến, phương pháp ARMS là nhạy nhất và chi phí tương đối hợp lý. Vì vậy, một phần lớn trong việc phát hiện lâm sàng gen KRAS trong và ngoài nước là sử dụng phương pháp ARMS, nhưng do phương pháp này dựa trên công nghệ PCR nên khuyết điểm của nó là chỉ có thể phát hiện các đột biến tại chỗ đã biết.
4. Phương pháp PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. Phương pháp HRM:
Đây là một trong những phương pháp phát hiện gen được sử dụng phổ biến hơn trong những năm gần đây. Nó có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng, nhạy cảm và một ống đơn để tránh ô nhiễm. Để khám phá tính khả thi của việc sử dụng nó trong thử nghiệm lâm sàng, Liu Liqin và những người khác đã sử dụng phương pháp HRM để phát hiện đột biến gen KRAS ở 64 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, sau đó sử dụng giải trình tự trực tiếp để xác minh kết quả. Kết quả của HRM và giải trình tự trực tiếp được tìm thấy là nhất quán. So với giải trình tự trực tiếp, việc phát hiện đột biến gen KRAS bằng HRM rất đơn giản và chính xác, cho thấy rằng đây là một phương pháp đáng tin cậy phù hợp để thử nghiệm lâm sàng. Chen Zhihong và cộng sự. Đã sử dụng phương pháp HRM để kiểm tra một loạt các mẫu hỗn hợp có chứa các tỷ lệ khác nhau của plasmid đột biến KRAS để đánh giá độ nhạy của chúng. Người ta thấy rằng tỷ lệ đột biến plasmid trong các mẫu hỗn hợp là 10%, và độ nhạy đạt 10%. Sau đó, phương pháp này được sử dụng để phát hiện đột biến gen KRAS trong 60 mẫu mô ung thư đại trực tràng. So với phương pháp giải trình tự trực tiếp, độ nhạy của phương pháp HRM là 100% và độ đặc hiệu là 96% (43/45). Nhược điểm của phương pháp HRM là không thể cung cấp chính xác loại đột biến cụ thể và codon nào bị đột biến. Nếu phát hiện thấy bất thường trên đường cong nóng chảy, cần sử dụng phương pháp giải trình tự để xác định dạng đột biến. Nhóm nghiên cứu Harlé đã sử dụng 156 trường hợp mô ung thư đại trực tràng để so sánh các phương pháp PCR huỳnh quang, ARMS và HRM. Kết quả cho thấy rằng mặc dù ba phương pháp đều phù hợp để thử nghiệm lâm sàng, độ tin cậy của HRM không tốt bằng hai phương pháp còn lại.
6. Các phương pháp khác:
Ngoài các phương pháp nêu trên, các phương pháp phát hiện khác có những ưu và nhược điểm riêng trong ứng dụng, chẳng hạn như PCR-SSCP, sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp đầu dò oligonucleotide tối ưu hóa PCR huỳnh quang, Phương pháp kết hợp PCR lồng nhau và ARMS, COLD-PCR phương pháp, v.v ... Sắc ký lỏng hiệu năng cao có tính đặc hiệu mạnh, nhưng nhu cầu về mẫu lớn; PCR-SSCP có chi phí thấp và tiết kiệm, nhưng hoạt động phức tạp; công nghệ phát hiện đột biến dựa trên PCR huỳnh quang có độ đặc hiệu mạnh, độ nhạy cao và định lượng chính xác, Vận hành dễ dàng, phản ứng bị chặn hoàn toàn và các ưu điểm khác, nhưng tất cả đều cần thiết kế mồi và đầu dò theo loại đột biến đã biết, vì vậy chỉ những vị trí cụ thể mới có thể được phát hiện, và tất cả các đột biến có thể không được phát hiện.
3. Tóm tắt thông tin
Tóm lại, do vị trí đột biến và phương pháp phát hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau không đồng nhất nên kích thước mẫu vật phân tích và chất lượng tách chiết ADN cũng không đồng đều, dẫn đến kết quả thí nghiệm lớn hay nhỏ giữa các phòng thí nghiệm có sự khác biệt, không đạt chuẩn. phát hiện đột biến gen KRAS đã trở thành một vấn đề phát hiện lâm sàng được quan tâm ở nhiều quốc gia khác nhau. Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gen KRAS. Độ nhạy từ cao đến thấp là ARMS, pyrosequencing, HRM, PCR định lượng thời gian thực và giải trình tự trực tiếp. Từ thực tế lâm sàng, độ nhạy thấp không có lợi cho điều trị lâm sàng, nhưng phương pháp quá nhạy sẽ làm giảm độ đặc hiệu phát hiện, có thể xảy ra kết quả dương tính giả không cần thiết và ảnh hưởng đến chế độ dùng thuốc tiếp theo của bệnh nhân. Xem xét các khía cạnh trên, kết hợp với phương pháp đã được FDA chấp thuận, phương pháp ARMS được khuyến khích. Tất nhiên, từ góc độ thị trường, chẩn đoán phân tử không nên nhấn mạnh tôi
thods, nhưng tập trung vào các kết quả chính xác cuối cùng. Các phòng thí nghiệm khác nhau có thể áp dụng các phương pháp thử nghiệm phù hợp tùy theo tình hình thực tế, nhưng chỉ khi họ có trình độ người vận hành tốt và hệ thống kiểm soát chất lượng nội bộ. Trong điều kiện môi trường phòng xét nghiệm trong nước hiện nay, việc thực hiện xét nghiệm tại phòng xét nghiệm PCR đạt chuẩn và tham gia các hoạt động kiểm soát chất lượng liên phòng trong nước và quốc tế là cần thiết để đảm bảo chất lượng xét nghiệm tin cậy của phòng xét nghiệm. Tiêu chuẩn hóa quản lý là điều kiện cần thiết để đảm bảo kết quả không đổi. Ở Trung Quốc, nhu cầu cấp thiết là thống nhất và tiêu chuẩn hóa xét nghiệm lâm sàng gen KRAS, đồng thời tạo ra một chương trình xét nghiệm tiêu chuẩn hóa và chuẩn hóa theo các nhu cầu khác nhau, và chương trình này có thể được mở rộng để phát hiện BRAF, PIK23450_3CA, EGFR và các gen khác để thúc đẩy xét nghiệm bệnh lý phân tử lâm sàng.
