Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Kolorektal saraton kasalligida KRAS gen mutatsiyasining ijobiy darajasi
Kolorektal saraton kasalligida KRAS genining mutatsiya darajasi 35% dan 45% gacha, yuqori xavfli mutatsiya joyi esa 12-ekzondagi 13 va 2 kodonlardan iborat bo'lib, hanuzgacha 61 va 146 kabi noyoblar mavjud. Mutatsiya sayt. KRAS gen mutatsiyalarini aniqlashning ko'plab usullari mavjud, ular orasida to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik, yuqori aniqlikdagi eritma egri chizig'i tahlili (HRM), pirosekventsiya, miqdoriy PCR, mutatsion amplifikatsiya bloki tizimi (amplinc atio) nrefraktorimutatsiya tizimi (ARMS), cheklash bo'lagi uzunligi polimorfizmi (RFLP), polimeraza zanjiri reaktsiyasi - bir qatorli konformatsion polimorfizmni tahlil qilish (PCR-singlestrand konfomatsiya polimorfizmi (PCR-SSCP), past darajadagi denatürasyon haroratida PCR (COLD-PCR) va yuqori samarali suyuq xromatografiya tahlili va boshqalar.
2. KRAS mutatsiyasini aniqlash usullarini baholash
1. To'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik usuli: Bu KRAS gen mutatsiyalarini aniqlashning eng klassik usuli va shuningdek, gen mutatsiyalarini aniqlashning oltin standartidir. Dideoksiya sekvensiyasi printsipiga asoslangan to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik usuli intuitiv ravishda genlar ketma-ketligini bazaviy tepalik xaritasi ko'rinishida ko'rsatishi mumkin. Aniqlash turi yanada keng qamrovli bo'lib, u shuningdek mutatsiyani aniqlashning eng qadimgi usuli hisoblanadi. Yangi avlod ketma-ketlik platformalari paydo bo'lishiga qaramay, mamlakatdagi va chet eldagi olimlar hali ham yangi usulning ishonchliligini o'lchash va aniqlash uchun to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya natijalarini o'lchov sifatida ishlatishadi. Gao Jing va boshq. Kolorektal saraton kasalligiga chalingan 966 bemorda KRAS va BRAF gen mutatsiyalarini aniqlash uchun to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya qo'llanildi. Bu, shuningdek, KRAS gen mutatsiyasining adabiyotda keltirilgan eng katta mahalliy namunasi bilan tahlilidir. Ling Yun va boshqalar to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya usuli har bir genning mutatsion holatini anglash uchun eng to'g'ridan-to'g'ri va samarali aniqlash usuli, bu mutatsiya turiga oydinlik kiritishi mumkin, ayniqsa noma'lum mutatsiyalarni aniqlash uchun. Ushbu usulning sezgirligi nisbatan past bo'lsa-da, uni o'simta hujayralarini boyitish uchun mikrodissektsiya kabi usullar bilan yaxshilash mumkin. To'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik usuli KRASning boshqa mahalliy tadqiqot guruhlarida namunalarning kattaroqligini aniqlashda ham qo'llanilgan. Biroq, past sezgirlik to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlikning eng katta kamchilikidir. Xitoyda e'lon qilingan natijalarga qaraganda mutatsiyani bevosita sekvensiya bilan aniqlash darajasi past emas. Lyu Syaojing va boshq. To'g'ridan-to'g'ri sekvensiya va peptid nuklein kislota qisqichi PCR (PNA-PCR) bilan taqqoslanib, KRAS gen mutatsiyalarining 43 ta holati bevosita sekvensiya bilan aniqlangan. Ushbu mutatsiyalarga qo'shimcha ravishda to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik bilan PNA-PCR ham aniqlandi. Yovvoyi turda o'nta mutatsiya topildi va yovvoyi turdagi bemorlarni PCR va mutant bemorlarni aniqlash uchun to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya usuli bilan aniqlash bo'yicha takliflar berildi. Qiu Tian va boshq. Floresan PCR-optimallashtirilgan oligonukleotid zond usuli va to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya usuli bilan kolorektal saratonning 131 namunasi aniqlandi va KRAS gen mutatsiyalarining ijobiy ko'rsatkichlari 41.2% (54/131) va 40.5% (53/131)). Bai Dongyu, shuningdek, turli xil usullarni aniqlash sezgirligini muhokama qildi. Kolorektal saraton kasalligiga chalingan 200 kishidan 63 tasi RT-qPCR mutatsiyalari bilan aniqlandi va mutatsiyani aniqlash darajasi 31.5%; 169 namunani to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya qilish yo'li bilan muvaffaqiyatli tartiblashtirildi, 50 ta mutatsion holat, mutatsiyani aniqlash darajasi 29.6%. To'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik usuli KRAS gen mutatsion holatini aniq, xolis va aniq aniqlashi mumkin bo'lsa-da, uning yuqori texnik talablari, murakkab operatsiya protseduralari, o'zaro kontaminatsiyani keltirib chiqarishi va natijalarni ko'p vaqt talab qiladigan va mehnatkash talqin qilish kabi kamchiliklari ham juda muhimdir. aniq. Ko'pincha ketma-ketlik uskunalari mavjud emas va namunani tegishli kompaniyaga sinov uchun yuborish kerak, bu uzoq vaqt talab qiladi va yuqori narxga ega, shuning uchun u katta cheklovlarga ega.
Pirosekvensiya usuli:
Pirosekvensiya usuli KRAS gen mutatsiyasini aniqlash uchun ketma-ketlikni sezgirligi, aniqlash qiymati va hisobot berish muddati jihatidan yanada qulay usuldir. Ushbu usulning takrorlanishi yaxshiroqdir. Olingan tepalik xaritasiga ko'ra ma'lum bir saytning mutatsion chastotasini miqdoriy o'rganish va turli joylarning mutatsion chastotalarini taqqoslash bir qarashda aniq. So'nggi yillarda Ogino va boshq., Xutchins va boshq. Kolorektal saratonning katta namunalari bo'lgan bemorlarda KRAS mutatsiyalarini sinash uchun pirosekvensiya texnologiyasidan foydalangansiz. Natijalar shuni ko'rsatadiki, pirosquvenatsiya texnologiyasi bemorlarni maqsadli terapiya uchun tekshirishda kuchli vosita hisoblanadi. Shish molekulyar diagnostikasi keng qo'llanilish istiqbollariga ega. Mahalliy olimlar, shuningdek, to'g'ri aniqlik va ishonch bilan kolorektal saraton kasalligida KRAS mutatsiyasini klinik ravishda aniqlash uchun pirosekvensiya texnologiyasidan foydalanganlar. Ushbu usul aniqroq va yuqori sezgirlikka ega. SundstrÖm va boshq. Klinik qo'llanmalarda allelikga xos PCR va pirosekvensiya bilan taqqoslaganda, kolorektal saraton kasalligida KRAS mutatsiyasining 314 holatida pirosekvensiyaning o'ziga xos xususiyati allelnikidan ustun ekanligi aniqlandi. PCR va o'simta hujayralari miqdori past bo'lgan to'qimalarga yaxshi sezgir. Shish hujayralarining ulushini 1.25% dan 2.5% gacha suyultirish. Pirosekvantatsiya mutatsiya signallarini hali ham aniqlay oladi. Sanger ketma-ketligi bilan aniqlash uchun namunadagi mutant allellarning minimal miqdori 20% ga etishi kerak bo'lsa, uni 10% ga yetganda HRM usuli bilan aniqlash mumkin va pirosekvensiya uchun faqat mutatsiyalarni 5% ga aniqlash mumkin. Allellar. Biz kolorektal saraton kasalligiga chalingan 717 bemorda KRAS mutatsiyasini aniqlash uchun pirosekvensiyadan foydalandik va KRAS mutatsiyalarining chastotasi 40.9% ni tashkil etdik. Kodon 12 ning mutatsion darajasi 30.1%, kodon 13 ning mutatsiya darajasi 9.8% va 61 kodonning mutatsion darajasi 1.0% ni tashkil etdi. Sinovdan oldin qo'lda mikrosizatsiyalash yo'li bilan to'qimalarni o'smaning yuqori miqdori bilan boyitdik va natijalar yanada ishonchli bo'ldi. Usul yaxshi sezgirlik va o'ziga xoslikka ega va klinik amaliyotda osonlikcha ishlab chiqiladi. Pirosekvensiya etishmovchiligi - bu aniqlashning yuqori xarajati va namunalarni sekvensiya qilish uchun bitta zanjirli DNKni tayyorlash jarayoni og'ir. Kelajakda pirosekvensiya operatsiyani sezilarli darajada soddalashtiradigan ikki yo'nalishli PCR mahsulotlarini bevosita aniqlash texnologiyasini ishlab chiqishga bag'ishlanishi mumkin. Va klinik testlarni har tomonlama targ'ib qilish uchun ketma-ketlik narxini samarali ravishda kamaytiring.
3. ARMS usuli:
Ushbu texnologiyada yovvoyi va mutant genlarni ajratish uchun primerlardan foydalaniladi, wh
ich haqida 1980-yillarda xabar berilgan. Ushbu usulning eng katta afzalligi shundaki, u 1.0% gacha sezuvchanlikka ega va 1.0% gacha bo'lgan namunalarda mutant genlarni aniqlay oladi. Loyihalashda maqsadli mahsulotning uzunligi eng katta darajada qisqartirilishi mumkin va aniq aniqlash natijalariga erishish mumkin emas, chunki kerosin bilan biriktirilgan to'qima namunasidan olingan DNKning katta qismi parchalanadi. Ushbu texnologiya kuchaytirish paytida yopiq trubkali ishlashga erishish uchun real vaqtda PCR platformasini birlashtiradi. Amaliyot sodda va mahsulotni qayta ishlashni talab qilmaydi, bu esa kuchaytirilgan mahsulotning ifloslanishidan maksimal darajada saqlanib qolishi mumkin. Hozirgi kunda dunyoda chayon probi va amplifikatsiya blokining mutatsion tizimini birlashtirgan chayon-ARMS usuli keng tarqalgan. Ikkala texnologiyaning kombinatsiyasi ikkala tomonning sezgirligi va o'ziga xosligini maksimal darajada oshirishi mumkin. Gao Jie va boshq. Kolorektal saraton kasalligiga chalingan 167 bemorda KRAS gen mutatsion holatini aniqlash uchun ushbu usuldan foydalanilgan va bu usul ishonchli va aniq ekanligini ko'rsatmoqda. Vang Xui va boshq. Formaldegid bilan biriktirilgan va kerosin bilan biriktirilgan to'qimalarning 151 holatida KRAS mutatsiyasini aniqlash uchun ARMS dan ham foydalanilgan. Qo'shma Shtatlarda KRASni klinik sinovlari uchun FDA tomonidan tasdiqlangan COBAS to'plami (Roche) va Evropa Ittifoqi In Vitro Diagnostics (CE-IVD) tomonidan sertifikatlangan Therascreen RGQ to'plami (Qiagen) ARMS printsipidan foydalanadi. Umumiy usullar orasida ARMS usuli eng sezgir bo'lib, narxi nisbatan oqilona. Shu sababli, KRAS genlarini uyda va chet elda klinik aniqlashning katta qismi ARMS usulini qo'llaydi, ammo bu usul PCR texnologiyasiga asoslanganligi sababli, uning etishmasligi shundaki, uni faqat ma'lum bo'lgan sayt mutatsiyasini aniqlash mumkin.
4. Haqiqiy vaqtdagi lyuminestsentsiya miqdoriy PCR usuli:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. HRM usuli:
Bu so'nggi yillarda tez-tez ishlatiladigan genlarni aniqlash usullaridan biridir. Bu ifloslanishdan saqlanish uchun oddiy, tezkor, sezgir va bitta kolba afzalliklariga ega. Uni klinik sinovlarda qo'llashning maqsadga muvofiqligini o'rganish uchun Lyu Litsin va boshqalar kolorektal saraton kasalligiga chalingan 64 bemorda KRAS gen mutatsiyasini aniqlash uchun HRM usulini qo'lladilar, so'ngra natijalarni tekshirish uchun to'g'ridan-to'g'ri sekvensiyadan foydalanishdi. HRM va to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik natijalari izchil ekanligi aniqlandi. To'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik bilan taqqoslaganda, KRAS gen mutatsiyalarini HRM tomonidan aniqlash sodda va aniq bo'lib, bu uning klinik tekshiruvlar uchun ishonchli usul ekanligini ko'rsatmoqda. Chen Zhihong va boshqalar. HRM usuli yordamida ularning sezgirligini baholash uchun KRAS mutant plazmidlarining har xil nisbatlarini o'z ichiga olgan bir qator aralash namunalarni sinab ko'rdi. Aralashtirilgan namunalardagi plazmid mutatsiyalarining ulushi 10%, sezgirligi esa 10% ga etganligi aniqlandi. Keyinchalik, bu usul kolorektal saraton to'qimalarining 60 ta namunasida KRAS gen mutatsiyasini aniqlash uchun ishlatilgan. To'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik usuli bilan taqqoslaganda HRM usulining sezgirligi 100%, o'ziga xosligi 96% (43/45) ni tashkil etdi. HRM usulining kamchiligi shundaki, o'ziga xos mutatsiya turini aniq ta'minlash mumkin emas va qaysi kodon mutatsiyaga uchragan. Agar eritish egri chizig'ida anormallik aniqlansa, mutatsiya turini aniqlash uchun ketma-ketlik usuli zarur. Harle tadqiqot guruhi lyuminestsent PCR, ARMS va HRM usullarini taqqoslash uchun kolorektal saraton to'qimalarining 156 ta holatidan foydalangan. Natijalar shuni ko'rsatadiki, uchta usul klinik tekshiruvlarga mos bo'lsa ham, HRMning ishonchliligi boshqa ikkita usul kabi yaxshi emas.
6. Boshqa usullar:
Yuqorida aytib o'tilgan usullardan tashqari, boshqa aniqlash usullari ham o'zlarining afzalliklari va kamchiliklariga ega, masalan PCR-SSCP, yuqori mahsuldor suyuqlik xromatografiyasi, lyuminestsent PCR-optimallashtirilgan oligonukleotid prob usuli, Ichki PCR va ARMS kombinatsiyasi usuli, COLD-PCR usul va boshqalar. Yuqori mahsuldor suyuq kromatografiya o'ziga xos xususiyatga ega, ammo namunalarga talab katta; PCR-SSCP arzon va tejamkor, ammo operatsiya murakkab; lyuminestsent PCR asosida mutatsiyani aniqlash texnologiyasi kuchli o'ziga xoslik, yuqori sezuvchanlik va aniq miqdoriy, oson ishlash, to'liq bloklangan reaktsiya va boshqa afzalliklarga ega, ammo barchasi ma'lum mutatsion turiga qarab primer va zondlarni ishlab chiqishi kerak, shuning uchun faqat ma'lum joylar bo'lishi mumkin aniqlandi va barcha mumkin bo'lgan mutatsiyalarni aniqlash mumkin emas.
3. xulosa
Xulosa qilib aytganda, turli laboratoriyalarda mutatsion joylari va aniqlash usullari bir xil bo'lmaganligi sababli, tahlil qilingan o'sma namunalarining hajmi va DNKning ekstraktsiyasi sifati ham teng emas, natijada laboratoriyalar o'rtasida katta yoki kichik eksperimental natijalar mavjud Tafovutlar, standartlashtirish KRAS gen mutatsiyasini aniqlash turli mamlakatlarda tashvishga soladigan klinik muammoga aylandi. Hozirgi vaqtda KRAS genidagi mutatsiyalarni aniqlashning ko'plab usullari mavjud. Yuqori darajadan pastgacha bo'lgan sezgirlik ARMS, pirosekvensiya, HRM, real vaqtda miqdoriy PCR va to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlikdir. Klinik haqiqatdan past sezgirlik klinik davolanishga yordam bermaydi, ammo o'ta sezgir usullar aniqlanishning o'ziga xos xususiyatini pasayishiga olib keladi va keraksiz noto'g'ri ijobiy natijalar paydo bo'lishi va bemorning keyingi dori-darmonlariga ta'sir qilishi mumkin. Yuqoridagi jihatlarni hisobga olgan holda, FDA tomonidan tasdiqlangan usul bilan birlashganda, ARMS usuli tavsiya etiladi. Albatta, bozor nuqtai nazaridan molekulyar diagnostika meni ta'kidlamasligi kerak
thhods, lekin yakuniy to'g'ri natijalarga e'tibor qarating. Turli laboratoriyalar haqiqiy vaziyatga ko'ra tegishli sinov usullarini qo'llashi mumkin, ammo ular yaxshi operator malakasi va ichki sifat nazorati tizimlariga ega bo'lsa. Mavjud mahalliy laboratoriya muhiti sharoitida standartlashtirilgan PCR laboratoriyasida sinov o'tkazish va ishonchli laboratoriya sinovi sifatini ta'minlash uchun mahalliy va xalqaro xonalararo sifat nazorati tadbirlarida ishtirok etish kerak. Standartlashtirilgan boshqaruv doimiy natijalarni ta'minlashning zaruriy shartidir. Xitoyda KRAS genini klinik sinovdan o'tkazishni birlashtirish va standartlashtirish, shuningdek, turli ehtiyojlarga ko'ra standartlashtirilgan va standartlashtirilgan test dasturini yaratish uchun favqulodda ehtiyoj bor va bu dastur klinik molekulyar patologiya testini rag'batlantirish uchun BRAF, PIK23450_3CA, EGFR va boshqa genlarni aniqlashga kengaytirilishi mumkin.
