Setuksimab ve panitumumab gibi hedefleme ilaçları klinikte kolorektal kanser için etkili terapötik ilaçlar olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Klinik veriler, KRAS mutasyonu olan hastaların bu monoklonal antikor ilacı üzerinde önemli bir etkisinin olmadığını, yalnızca vahşi tip hastaların bundan yararlanabileceğini gösteriyor. Bu nedenle KRAS gen mutasyon durumu klinik olarak kolorektal kanserin prognozu ve tedavi etkisi ile güçlü bir korelasyona sahip olan önemli bir terapötik belirteç olarak kabul edilmektedir. 2009 Kapsamlı Ulusal Kanser Ağı (NCCN) Kolorektal Kanser Klinik Uygulama Kılavuzları, metastatik kolorektal kanserli tüm hastaların KRAS gen mutasyon durumunu tespit etmesi gerektiğini ve EGFR hedefli tedavi için yalnızca KRAS vahşi tipinin önerildiğini şart koşar. Aynı yıl, Amerikan Klinik Onkoloji Derneği (ASCO) da tümör hedefli tedavi için moleküler bir belirteç olarak aynı klinik tedavi önerilerini yayınladı ve bu da bunun önemli yol gösterici önemini gösteriyor. Şu anda KRAS genetik testi klinik olarak yaygın şekilde yapılmaktadır. Klinik seçimde esas olarak yerli KRAS gen mutasyonu tespit yöntemlerini referans olarak değerlendiriyoruz.
1. Kolorektal kanserde pozitif KRAS gen mutasyonu oranı
Kolorektal kanserde, KRAS geninin mutasyon oranı% 35 ila% 45 kadar yüksektir ve yüksek riskli mutasyon bölgesi, ekson 12'deki 13 ve 2 kodonlarıdır ve 61 ve 146 gibi hala nadir olanlar vardır. Mutasyon site. Doğrudan sıralama, yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi (HRM), pyrosequencing, kantitatif PCR, mutasyon amplifikasyon blok sistemi (amplinc atio) nrefraktermutasyon sistemi (ARMS), restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi (RFLP) dahil olmak üzere KRAS gen mutasyonları için birçok tespit yöntemi vardır. polimeraz zincir reaksiyonu-tek sarmallı konformasyon polimorfizmi analizi (PCR-singlestrand konfomasyon polimorfizmi (PCR-SSCP), düşük denatürasyon sıcaklığında birlikte amplifikasyon PCR (COLD-PCR) ve yüksek performanslı sıvı kromatografi analizi, vb.
2. KRAS mutasyon tespit yöntemlerinin değerlendirilmesi
1. Doğrudan sıralama yöntemi: KRAS gen mutasyonlarını tespit etmek için en klasik yöntemdir ve aynı zamanda gen mutasyonlarını tespit etmek için altın standarttır. Dideoksi dizileme ilkesine dayanan doğrudan dizileme yöntemi, gen dizisinin değişimini temel tepe haritası biçiminde en sezgisel olarak gösterebilir. Algılama türü daha kapsamlıdır ve aynı zamanda uygulanan en erken mutasyon saptama yöntemidir. Yeni nesil dizileme platformlarının ortaya çıkmasına rağmen, yurtiçi ve yurtdışındaki akademisyenler, yeni yöntemin güvenilirliğini ölçmek ve belirlemek için bir ölçek olarak doğrudan dizileme sonuçlarını kullanmaya devam etmektedir. Gao Jing vd. Kolorektal kanserli 966 hastada KRAS ve BRAF gen mutasyonlarının saptanması için doğrudan sıralama uygulandı. Bu aynı zamanda, KRAS gen mutasyonunun literatürde bildirilen en büyük yerli örnekle analizidir. Ling Yun ve diğerleri, doğrudan sıralama yönteminin, özellikle bilinmeyen mutasyonların tespiti için mutasyon türünü netleştirebilen her bir genin mutasyon durumunu anlamak için en doğrudan ve etkili tespit yöntemi olduğuna inanıyor. Bu yöntemin duyarlılığı nispeten düşük olmasına rağmen, tümör hücrelerini zenginleştirmek için mikrodiseksiyon gibi yöntemlerle iyileştirilebilir. Doğrudan sıralama yöntemi, diğer yerel araştırma gruplarında daha büyük örneklem boyutlarının KRAS tespitine de uygulanmıştır. Bununla birlikte, düşük hassasiyet, doğrudan sıralamanın en büyük dezavantajıdır. Çin'de bildirilen sonuçlara göre, doğrudan dizileme ile mutasyon tespit oranı düşük değildir. Liu Xiaojing vd. Doğrudan dizileme ve peptit nükleik asit kıskaçlı PCR (PNA-PCR) karşılaştırıldı ve doğrudan dizileme ile 43 KRAS gen mutasyonu vakasının tespit edildiği bulundu. Bu mutasyonlara ek olarak, PNA-PCR ayrıca doğrudan dizileme ile tespit edildi. Vahşi tipte on mutasyon bulundu ve doğal tip hastaları PCR ve mutant hastaları belirlemek için doğrudan sıralama yöntemi ile belirlemek için önerilerde bulunuldu. Qiu Tian vd. Floresan PCR ile optimize edilmiş oligonükleotid prob metodu ve direkt sekanslama metodu ile 131 kolorektal kanser numunesi tespit edildi ve KRAS gen mutasyonlarının pozitif oranları% 41.2 (54/131) ve% 40.5 (53/131) idi. Bai Dongyu ayrıca farklı yöntemlerin algılama hassasiyetini tartıştı. 200 kolorektal kanser hastasından 63'ü RT-qPCR mutasyonları ile tespit edildi ve mutasyon tespit oranı% 31.5 idi; 169 örnek, 50 mutasyon vakası,% 29.6 mutasyon tespit oranı ile doğrudan sekanslama ile başarıyla sekanslandı. Doğrudan sıralama yöntemi KRAS gen mutasyon durumunu doğru, objektif ve spesifik olarak tespit edebilse de, yüksek teknik gereksinimler, karmaşık işlem prosedürleri, çapraz kontaminasyona neden olması kolay ve sonuçların zaman alıcı ve zahmetli yorumlanması gibi eksiklikleri de oldukça fazladır. açık. Genellikle sıralama ekipmanı yoktur ve numunenin test için ilgili şirkete gönderilmesi gerekir, bu uzun zaman alır ve maliyeti yüksektir, bu nedenle büyük sınırlamaları vardır.
Pyrosequencing yöntemi:
Pyrosequencing yöntemi ayrıca KRAS gen mutasyon tespiti için sıralama hassasiyeti, tespit maliyeti ve raporlama süresi açısından daha uygun bir yöntemdir. Bu yöntemin tekrarlanabilirliği daha iyidir. Elde edilen tepe haritasına göre Belirli bir bölgenin mutasyon sıklığının kantitatif çalışması ve farklı bölgelerin mutasyon frekanslarının karşılaştırılması bir bakışta anlaşılır. Son yıllarda Ogino ve diğerleri, Hutchins ve diğerleri. Büyük kolorektal kanser örnekleri olan hastalarda KRAS mutasyonlarını test etmek için pirozekleme teknolojisini kullanmışlardır. Sonuçlar, pyrosequencing teknolojisinin hastaları hedeflenen tedavi için taramak için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir. Tümör moleküler tanısının geniş uygulama olanakları vardır. Yerli bilim adamları ayrıca, iyi bir doğruluk ve güvenilirlik ile kolorektal kanserdeki KRAS mutasyonlarını klinik olarak tespit etmek için pyrosequencing teknolojisini kullandı. Bu yöntemin daha iyi özgüllüğü ve daha yüksek hassasiyeti vardır. SundstrÖm vd. Klinik uygulamalarda alelik spesifik PCR ve pirozisans karşılaştırıldı ve kolorektal kanser hastalarında 314 KRAS mutasyonu vakasında, piroz sıralanmanın özgünlüğünün alellerden daha üstün olduğu bulundu. PCR ve düşük tümör hücresi içeriğine sahip dokulara karşı iyi bir duyarlılığa sahiptir. Tümör hücrelerinin oranını% 1.25 ila% 2.5 oranında seyreltin. Pyrosequencing, mutasyon sinyallerini hala tespit edebilir. Örnekteki minimum mutant alel içeriğinin Sanger dizileme ile tespit edilebilmesi için% 20'ye ulaşması gerektiğinde,% 10'a ulaştığında HRM yöntemi ile tespit edilebilir ve piroz dizileme için sadece% 5 mutasyonlar tespit edilebilir. Aleller. Kolorektal kanserli 717 hastada KRAS mutasyonlarını tespit etmek için pirosquencing kullandık ve KRAS mutasyonlarının sıklığının% 40.9 olduğunu bulduk. Kodon 12'nin mutasyon oranı% 30.1, kodon 13'ün mutasyon oranı% 9.8 ve kodon 61'in mutasyon oranı% 1.0'dı. Test öncesi manuel mikrodiseksiyon ile daha yüksek tümör içeriğine sahip dokuları zenginleştirerek sonuçları daha güvenilir hale getirdik. Yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü iyidir ve klinik uygulamada geliştirilmesi kolaydır. Pyrosequencing'in dezavantajı, yüksek tespit maliyetidir ve numunelerin sıralanması için tek sarmallı DNA hazırlama işlemi zahmetlidir. Gelecekte, pyrosequencing, işlemi büyük ölçüde basitleştirecek olan çift sarmallı PCR ürünlerinin doğrudan tespiti için teknolojinin geliştirilmesine ayrılabilir. Ve kapsamlı klinik test promosyonu elde etmek için sıralama maliyetini etkili bir şekilde azaltın.
3. ARMS yöntemi:
Bu teknoloji, yabani tip ve mutant genleri ayırt etmek için primerler kullanır.
ich, 1980'lerin başlarında rapor edilmişti. Bu yöntemin en büyük avantajı,% 1.0'a varan hassasiyete sahip olması ve% 1.0 gibi düşük örneklerde mutant genleri tespit edebilmesidir. Tasarımda, hedef ürünün uzunluğu büyük ölçüde kısaltılabilir ve parafine gömülü doku örneğinden ekstrakte edilen DNA'nın çoğu parçalanmış olduğu için doğru tespit sonuçlarının elde edilememesi sorunu. Bu teknoloji, amplifikasyon sırasında kapalı tüp çalışması sağlamak için gerçek zamanlı PCR platformunu birleştirir. İşlem basittir ve ürünün sonradan işlenmesini gerektirmez, bu da amplifiye edilmiş ürünün kontaminasyonunu büyük ölçüde önleyebilir. Şu anda, akrep probu ve amplifikasyon blok mutasyon sistemini birleştiren akrep-ARMS yöntemi dünyada daha yaygın olarak kullanılmaktadır. İki teknolojinin kombinasyonu, her iki tarafın hassasiyetini ve özgüllüğünü en üst düzeye çıkarabilir. Gao Jie vd. Kolorektal kanserli 167 hastada KRAS gen mutasyon durumunu tespit etmek için bu yöntemi kullandı ve bu yöntemin güvenilir ve doğru olduğunu düşündürdü. Wang Hui vd. Ayrıca 151 formaldehitle sabitlenmiş ve parafine gömülü doku vakasında KRAS mutasyonlarını tespit etmek için ARMS kullandı. Amerika Birleşik Devletleri'nde, KRAS'ın klinik testi için FDA tarafından onaylanan COBAS kiti (Roche) ve Avrupa Birliği In Vitro Diagnostics (CE-IVD) tarafından onaylanan Therascreen RGQ kiti (Qiagen), ARMS ilkesini kullanır. Yaygın yöntemler arasında ARMS yöntemi en hassas olanıdır ve maliyeti nispeten makuldür. Bu nedenle, KRAS genlerinin yurtiçi ve yurtdışında klinik tespitinin büyük bir kısmı ARMS yöntemini kullanmaktadır, ancak yöntem PCR teknolojisine dayandığından, eksikliği sadece Bilinen site mutasyonlarının tespit edilebilmesidir.
4. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR yöntemi:
Mutasyonu Ct değerine göre belirlemek için PCR bazlı bir tespit yöntemidir. Güçlü özgüllük, yüksek hassasiyet, doğru ölçüm, kolay kullanım ve tamamen kapalı reaksiyon avantajlarına sahiptir. Birçok deney grubu kolorektal kanserde KRAS mutasyonlarının tespiti için bu yöntemi benimsemiştir. Doğrudan sıralama yöntemiyle karşılaştırıldığında kantitatif PCR, hassasiyet açısından daha büyük bir avantaja sahiptir. İki yöntemi karşılaştıran bilim adamlarının çoğu, kantitatif PCR'nin daha duyarlı olduğuna inanıyor. Liu Wei ve diğerleri. 280 kolorektal kanser KRAS gen mutasyonu vakasının, 94 KRAS gen dizileme mutasyonu vakasının tespit sonuçlarının ayrıntılı bir analizini yapmak için iki yöntem kullanıldı, pozitif oran %33.57 (94/280) idi; bunların gerçek zamanlı floresans kantitatif değeri PCR pozitifti. 91 vakanın duyarlılığı %96.8 (91/94) idi. Yabani tipte gen dizilimi yapan 186 vakadan 184'ü, gerçek zamanlı kantitatif PCR ile %98.9 (184/186) özgüllükle negatifti. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR yöntemi ile doğrudan gen dizileme yöntemi arasındaki tesadüf oranı %98.2 idi. Her iki tespit yönteminde de her mutasyon bölgesinin pozitif ve negatif tesadüf oranı %90'ın üzerindeydi ve dört bölgenin tesadüf oranı %100'e ulaştı. İki yöntemin tespit sonuçları oldukça tutarlıydı; bu da floresan kantitatif PCR'nin mutasyon tespiti için daha güvenilir bir yöntem olduğunu gösteriyor. Ancak PCR bazlı yöntemlerin bilinen mutasyon türlerine göre primerler ve problar tasarlaması gerekir, dolayısıyla tüm olası mutasyonlar tespit edilemez ve yalnızca belirli alanlar tespit edilebilir. Belirli bir bölge kitin tespit aralığına dahil değilse, gerçekte bir mutasyon olsa bile kit sonucu yine negatiftir. Ek olarak, kantitatif PCR'nin duyarlılığı yüksek olmasına rağmen, KRAS mutasyon durumu ile hedeflenen tedavinin etkinliği arasındaki korelasyonu doğrulamak için yanlış pozitiflerin olup olmadığının DNA dizileme teknolojisiyle veya büyük numune boyutlarına sahip retrospektif ve ileriye dönük klinik deneylerle doğrulanması gerekiyor. ilaçlar . Bu nedenle mutasyon tespitinin yüksek hassasiyeti körü körüne takip edilmemeli, tespitin özgüllüğü ve doğruluğu göz ardı edilmelidir. Farklı laboratuvar koşullarında örneklerde mutasyon tespiti için en uygun yöntem de farklı olabilir. Daha yüksek mutasyon oranına sahip numuneler için Sanger sıralama yöntemi, gen mutasyonlarını tespit etmede daha yüksek bir doğruluğa sahipken, daha düşük mutasyon oranına sahip numuneler için Sanger sıralama yöntemi Yanlış negatifler meydana gelebilir ve teknik platform olarak floresan PCR kullanan tespit yöntemi yüksek hassasiyet ile karakterize edilebilir.
5. HRM yöntemi:
Son yıllarda en sık kullanılan gen tespit yöntemlerinden biridir. Kirliliği önlemek için basit, hızlı, hassas ve tek tüp avantajlarına sahiptir. Liu Liqin ve diğerleri, klinik testlerde kullanımının fizibilitesini araştırmak için, kolorektal kanserli 64 hastada KRAS gen mutasyonlarını tespit etmek için HRM yöntemini kullandı ve ardından sonuçları doğrulamak için doğrudan sekanslama kullandı. İKY ve doğrudan sıralamanın sonuçlarının tutarlı olduğu bulunmuştur. Doğrudan sıralama ile karşılaştırıldığında, KRAS gen mutasyonlarının HRM tarafından tespiti basit ve doğrudur, bu da klinik testler için uygun güvenilir bir yöntem olduğunu düşündürür. Chen Zhihong vd. Hassasiyetlerini değerlendirmek için farklı oranlarda KRAS mutant plazmidleri içeren bir dizi karışık numuneyi test etmek için HRM yöntemini kullandı. Karışık örneklerde plazmid mutasyonlarının oranının% 10 olduğu ve duyarlılığın% 10'a ulaştığı bulundu. Daha sonra yöntem, 60 kolorektal kanser doku örneğinde KRAS gen mutasyonlarını tespit etmek için kullanıldı. Doğrudan sıralama yöntemiyle karşılaştırıldığında, HRM yönteminin duyarlılığı% 100 ve özgüllüğü% 96 (43/45) idi. HRM yönteminin dezavantajı, spesifik mutasyon tipini doğru bir şekilde sağlamanın imkansız olması ve hangi kodonun mutasyona uğramış olmasıdır. Erime eğrisinde bir anormallik bulunursa, mutasyon tipini belirlemek için sıralama yöntemine ihtiyaç vardır. Harlé araştırma grubu, floresan PCR, ARMS ve HRM yöntemlerini karşılaştırmak için 156 kolorektal kanser dokusu vakası kullandı. Sonuçlar, üç yöntemin klinik testler için uygun olmasına rağmen, İKY'nin güvenilirliğinin diğer iki yöntem kadar iyi olmadığını göstermektedir.
6. Diğer yöntemler:
Yukarıda belirtilen yöntemlere ek olarak, PCR-SSCP, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, floresan PCR ile optimize edilmiş oligonükleotid prob yöntemi, yuvalanmış PCR ve ARMS kombinasyonu yöntemi, COLD-PCR gibi diğer saptama yöntemlerinin uygulamada kendi avantajları ve dezavantajları vardır. yöntem, vb. Yüksek performanslı sıvı kromatografisinin güçlü bir özgüllüğü vardır, ancak numunelere olan talep büyüktür; PCR-SSCP düşük maliyetli ve ekonomiktir, ancak işlem karmaşıktır; Floresan PCR'ye dayalı mutasyon tespit teknolojisi güçlü özgüllük, yüksek hassasiyet ve doğru niceliksel, Kolay kullanım, tamamen bloke edilmiş reaksiyon ve diğer avantajlara sahiptir, ancak tümünün bilinen mutasyon tipine göre primerleri ve probları tasarlaması gerekir, bu nedenle yalnızca belirli alanlar tespit edildi ve tüm olası mutasyonlar tespit edilemez.
3. Özet
Özetle, farklı laboratuvarlardaki mutasyon alanları ve saptama yöntemleri tek tip olmadığından, analiz edilen tümör örneklerinin boyutu ve DNA ekstraksiyonunun kalitesi de dengesizdir ve laboratuvarlar arasında büyük veya küçük deneysel sonuçların varlığına neden olur Farklılıklar, standardizasyon KRAS gen mutasyon tespiti, çeşitli ülkelerde klinik tespit sorunu haline geldi. Şu anda KRAS genindeki mutasyonları tespit etmek için birçok yöntem vardır. Yüksekten düşüğe duyarlılık ARMS, pyrosequencing, HRM, real-time kantitatif PCR ve doğrudan dizilemedir. Klinik gerçeklikten, düşük duyarlılık klinik tedaviye elverişli değildir, ancak çok hassas yöntemler saptama özgüllüğünün azalmasına neden olur ve gereksiz yanlış pozitif sonuçlar meydana gelebilir ve hastanın sonraki ilaç rejimini etkileyebilir. Yukarıdaki hususlar göz önünde bulundurularak FDA tarafından onaylanan yöntemle birleştirildiğinde ARMS yöntemi önerilmektedir. Elbette piyasa perspektifinden bakıldığında moleküler teşhis beni vurgulamamalı
yine de nihai doğru sonuçlara odaklanın. Farklı laboratuvarlar fiili duruma göre uygun test yöntemlerini benimseyebilir, ancak bu yalnızca iyi operatör vasıflarına ve iç kalite kontrol sistemlerine sahip olmaları durumunda mümkündür. Mevcut yurt içi laboratuvar çevre koşulları altında, güvenilir laboratuvar test kalitesinin sağlanması için testlerin standartlaştırılmış bir PCR laboratuvarında yapılması ve yurt içi ve yurt dışı odalar arası kalite kontrol faaliyetlerine katılmak gerekmektedir. Standartlaştırılmış yönetim, sürekli sonuçların sağlanması için gerekli bir koşuldur. Çin'de, KRAS geninin klinik testlerini birleştirmeye ve standartlaştırmaya ve farklı ihtiyaçlara göre standartlaştırılmış ve standartlaştırılmış bir test programı oluşturmaya acil bir ihtiyaç vardır ve bu program BRAF, PIK23450_3CA, EGFR ve EGFR'nin tespitini kapsayacak şekilde genişletilebilir. klinik moleküler patoloji testlerini teşvik etmek için diğer genler.
