Ang pag-target ng mga gamot tulad ng cetuximab at panitumumab ay malawakang ginagamit sa klinika bilang mabisang therapeutic na gamot para sa colorectal na cancer. Ipinapakita ng data sa klinika na ang mga pasyenteng may mutation ng KRAS ay walang makabuluhang epekto sa monoclonal antibody na gamot na ito, at ang mga wild-type na pasyente lamang ang maaaring makinabang mula dito. Samakatuwid, ang KRAS gene mutation status ay itinuturing na klinikal bilang isang mahalagang therapeutic marker, na may isang malakas na ugnayan sa pagbabala at epekto ng paggamot ng colorectal cancer. Ang 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines ay nagsasaad na ang lahat ng mga pasyente na may metastatic colorectal cancer ay dapat makakita ng KRAS gene mutation status, at ang KRAS wild type lang ang inirerekomenda para makatanggap ng EGFR targeted therapy. Sa parehong taon, ang American Society of Clinical Oncology (ASCO) ay naglabas din ng parehong mga rekomendasyon sa klinikal na paggamot bilang isang molecular marker para sa tumor targeted therapy, na nagpapakita ng mahalagang patnubay na kahalagahan nito. Sa kasalukuyan, ang pagsusuri sa genetic ng KRAS ay malawakang isinasagawa nang klinikal. Pangunahing sinusuri namin ang mga pamamaraan ng pagtuklas ng mutation ng domestic KRAS gene para sa sanggunian sa pagpili ng klinikal.
1. Ang positibong rate ng KRAS gene mutation sa colorectal cancer
Sa colorectal cancer, ang mutation rate ng KRAS gene ay kasing taas ng 35% hanggang 45%, at ang site na may mataas na peligro na mutation ay mga codon 12 at 13 sa exon 2, at mayroon pa ring mga bihirang kagaya ng 61 at 146. Mutation lugar. Maraming pamamaraan ng pagtuklas para sa mga mutasyon ng KRAS gene, kabilang ang direktang pagkakasunud-sunod, pagtatasa ng curve ng natutunaw na mataas na resolusyon (HRM), pyrosequencing, dami ng PCR, mutation amplification block system (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), restriction fragment length polymorphism (RFLP), polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis (PCR-singlestrand confomation polymorphism (PCR-SSCP), co-amplification at lower denaturation temperatur PCR (COLD-PCR) and high-performance likidong chromatography analysis, atbp.
2. Pagsusuri sa mga pamamaraan ng pagtuklas ng mutasyon ng KRAS
1. Direktang pamamaraan ng pagsunud-sunod: Ito ang pinaka-klasikong pamamaraan para sa pagtuklas ng mga mutasyon ng KRAS gene, at ito rin ang pamantayang ginto para sa pagtuklas ng mga mutasyon ng gene. Ang direktang pamamaraan ng pagkakasunud-sunod batay sa prinsipyo ng pagkakasunud-sunod ng dideoxy ay maaaring pinaka-intuitive na maipakita ang pagbabago ng pagkakasunud-sunod ng gene sa anyo ng batayang tuktok na mapa. Ang uri ng pagtuklas ay mas komprehensibo, at ito rin ang pinakamaagang pamamaraan ng pagtuklas ng mutation na inilapat. Sa kabila ng paglitaw ng mga bagong henerasyon ng pagkakasunud-sunod ng mga platform, ginagamit pa rin ng mga iskolar sa bahay at sa ibang bansa ang mga resulta ng direktang pagkakasunud-sunod bilang isang sukat upang masukat at matukoy ang pagiging maaasahan ng bagong pamamaraan. Gao Jing et al. Inilapat ang direktang pagsunud-sunod sa pagtuklas ng mga mutasyon ng KRAS at BRAF na gene sa 966 mga pasyente na may colorectal cancer. Ito rin ang pagsusuri ng pag-mutate ng KRAS gene na may pinakamalaking sample ng domestic na iniulat sa panitikan. Naniniwala si Ling Yun at iba pa na ang direktang pagsunud-sunod ng pamamaraan ay ang pinaka direkta at mabisang pamamaraan ng pagtuklas para sa pag-unawa sa katayuan ng mutation ng bawat gene, na maaaring linawin ang uri ng mutation, lalo na para sa pagtuklas ng hindi kilalang mga mutasyon. Bagaman ang pagiging sensitibo ng pamamaraang ito ay medyo mababa, maaari itong mapabuti ng mga pamamaraan tulad ng microdissection upang pagyamanin ang mga tumor cell. Ang pamamaraan ng direktang pagsunud ay inilapat din sa pagtuklas ng KRAS ng mas malaking sukat ng sample sa iba pang mga pangkat ng pagsasaliksik sa tahanan. Gayunpaman, ang mas mababang pagiging sensitibo ay ang pinakamalaking kawalan ng direktang pagkakasunud-sunod. Sa paghusga mula sa mga resulta na naiulat sa Tsina, ang rate ng pagtuklas ng mutasyon sa pamamagitan ng direktang pagkakasunud-sunod ay hindi mababa. Liu Xiaojing et al. Kung ikukumpara ang direktang pagkakasunud-sunod at peptide nucleic acid clamp PCR (PNA-PCR) at natagpuan na 43 na mga kaso ng KRAS gene mutation ang napansin sa direktang pagkakasunud-sunod. Bilang karagdagan sa mga mutasyong ito, ang PNA-PCR ay napansin din sa pamamagitan ng direktang pagkakasunud-sunod. Sampung mutasyon ang natagpuan sa ligaw na uri, at ang mga mungkahi ay ginawa upang matukoy ang mga ligaw na uri ng pasyente ng PCR at ang direktang pamamaraan ng pagsunud-sunod upang matukoy ang mga mutant na pasyente. Qiu Tian et al. Nakita ang 131 mga specimen ng cancer ng colorectal sa pamamagitan ng fluorescent na PCR na na-optimize na paraan ng oligonucleotide probe at direktang pamamaraan ng pagsunud-sunod, at ang mga positibong rate ng pag-mutate ng KRAS gene ay 41.2% (54/131) at 40.5% (53/131)). Tinalakay din ni Bai Dongyu ang pagiging sensitibo sa pagtuklas ng iba't ibang mga pamamaraan. Sa 200 mga pasyente ng cancer ng colorectal, 63 ang napansin ng mutation ng RT-qPCR, at ang rate ng detection ng mutation ay 31.5%; Ang 169 na mga sample ay matagumpay na na-sunod sa pamamagitan ng direktang pagsunud-sunod ng 50 mga kaso ng mutation, rate ng pagtuklas ng mutation na 29.6%. Kahit na ang direktang pagsunud-sunod na pamamaraan ay maaaring tumpak, nang walang layunin at tukoy na tuklasin ang katayuan ng mutasyon ng KRAS, ang mga pagkukulang nito tulad ng mataas na kinakailangang panteknikal, kumplikadong mga pamamaraan sa pagpapatakbo, madaling maging sanhi ng kontaminasyon sa cross, at pag-ubos ng oras at matrabahong pagbibigay kahulugan ng mga resulta halata naman Kadalasan walang kagamitan sa pagkakasunud-sunod, at ang ispesimen ay kailangang maipadala sa kaukulang kumpanya para sa pagsubok, na tumatagal ng mahabang panahon at may mataas na gastos, kaya't may mahusay na mga limitasyon.
Paraan ng pyrosequencing:
Ang pamamaraang pyrosequencing ay isang mas maginhawang pamamaraan para sa pagtuklas ng pag-mutate ng KRAS gene sa mga tuntunin ng pagkakasunud-sunod ng pagkasensitibo, gastos sa pagtuklas at oras upang mag-ulat. Ang pag-ulit ng pamamaraang ito ay mas mahusay. Ayon sa nakuha na pinakamataas na mapa Ang dami ng pag-aaral ng dalas ng mutation ng isang tiyak na site at ang paghahambing sa pagitan ng mga frequency ng mutation ng iba't ibang mga site ay malinaw sa isang sulyap. Sa mga nagdaang taon, Ogino et al., Hutchins et al. Gumamit ng teknolohiyang pyrosequencing upang subukan ang mutasyon ng KRAS sa mga pasyente na may malaking sample ng colorectal cancer. Ipinapahiwatig ng mga resulta na ang teknolohiya ng pyrosequencing ay isang malakas na tool para sa pag-screen ng mga pasyente para sa naka-target na therapy. Ang diagnosis ng tumor na molekular ay may malawak na mga prospect ng aplikasyon. Ang mga scholar sa loob ng bansa ay gumamit din ng teknolohiyang pyrosequencing upang makita ang klinikal na mga mutasyon ng KRAS sa colorectal cancer, na may mahusay na kawastuhan at pagiging maaasahan. Ang pamamaraang ito ay may mas mahusay na detalye at mas mataas na pagiging sensitibo. SundstrÖm et al. Kung ikukumpara ang tukmang allelic PCR at pyrosequencing sa mga klinikal na aplikasyon at natagpuan na sa 314 na mga kaso ng KRAS mutation sa mga pasyente ng colorectal cancer, ang pagiging tiyak ng pyrosequencing ay nakahihigit kaysa sa mga alleles. PCR, at may mahusay na pagiging sensitibo sa mga tisyu na may mababang nilalaman ng tumor cell. Haluin ang proporsyon ng mga cell ng tumor sa 1.25% hanggang 2.5%. Maaari pa ring makita ng pyrosequencing ang mga signal ng mutation. Kapag ang minimum na nilalaman ng mga mutant alleles sa sample ay kailangang maabot ang 20% upang makita ng pagkakasunud-sunod ng Sanger, maaari itong makita sa pamamaraang HRM kapag umabot sa 10%, at para sa pyrosequencing ang mga mutation lamang ang maaaring napansin ng 5%. Mga Alleles Gumamit kami ng pyrosequencing upang makita ang mga mutasyon ng KRAS sa 717 mga pasyente na may colorectal cancer at nalaman na ang dalas ng mga mutasyon ng KRAS ay 40.9%. Ang mutation rate ng codon 12 ay 30.1%, ang mutation rate ng codon 13 ay 9.8%, at ang mutation rate ng codon 61 ay 1.0%. Pinayaman namin ang mga tisyu na may mas mataas na nilalaman ng tumor sa pamamagitan ng manu-manong microdissection bago subukan, na ginagawang mas maaasahan ang mga resulta. Ang pamamaraan ay may mahusay na pagiging sensitibo at pagtitiyak, at madaling mabuo sa klinikal na pagsasanay. Ang kawalan ng pyrosequencing ay ang mataas na halaga ng pagtuklas, at ang proseso ng paghahanda ng solong-straced na DNA para sa pagsunud-sunod ng mga sampol ay mahirap gawin. Sa hinaharap, ang pyrosequencing ay maaaring italaga sa pagpapaunlad ng teknolohiya para sa direktang pagtuklas ng mga produkto ng doble-straced na PCR, na lubos na magpapasimple sa operasyon. At mabisang mabawasan ang gastos ng pagkakasunud-sunod upang makamit ang komprehensibong promosyon ng klinikal na pagsubok.
3. Paraan ng ARMS:
Gumagamit ang teknolohiyang ito ng mga primer upang makilala ang mga wild-type at mutant genes, wh
Ang ich ay naiulat na noong 1980s pa. Ang pinakamalaking bentahe ng pamamaraang ito ay mayroon itong pagiging sensitibo hanggang sa 1.0% at maaaring makita ang mga mutant gen sa mga sample na mas mababa sa 1.0%. Sa disenyo, ang haba ng target na produkto ay maaaring paikliin sa pinakamalawak na lawak, at ang problema na ang mga resulta ng tumpak na pagtuklas ay hindi maaaring makuha dahil ang karamihan sa DNA na nakuha mula sa paraffin-embedded tissue na ispesimen ay nahati. Pinagsasama ng teknolohiyang ito ang real-time na platform ng PCR upang makamit ang operasyon ng closed-tube habang nagpapalaki. Ang operasyon ay simple at hindi nangangailangan ng post-processing ng produkto, na maaaring maiwasan ang kontaminasyon ng pinalakas na produkto sa pinakamalawak na lawak. Sa kasalukuyan, ang pamamaraan ng alakdan-ARMS na pagsasama ng scorpion probe at amplification block mutation system ay mas madalas na ginagamit sa mundo. Ang kumbinasyon ng dalawang mga teknolohiya ay maaaring i-maximize ang pagiging sensitibo at pagtitiyak ng magkabilang panig. Gao Jie et al. Ginamit ang pamamaraang ito upang makita ang katayuan ng mutation ng KRAS sa 167 mga pasyente na may colorectal cancer, na nagmumungkahi na ang pamamaraang ito ay maaasahan at tumpak. Wang Hui et al. Ginamit din ang ARMS upang tuklasin ang mga mutasyon ng KRAS sa 151 mga kaso ng formaldehyde-fixed at paraffin-embedded na mga tisyu. Sa Estados Unidos, ang COBAS kit (Roche) na inaprubahan ng FDA para sa klinikal na pagsubok ng KRAS at ang Therascreen RGQ kit (Qiagen) na sertipikado ng European Union In Vitro Diagnostics (CE-IVD) lahat ay gumagamit ng ARMS na prinsipyo. Kabilang sa mga karaniwang pamamaraan, ang pamamaraang ARMS ay ang pinaka-sensitibo at ang gastos ay medyo makatuwiran. Samakatuwid, ang isang malaking bahagi ng klinikal na pagtuklas ng mga gen ng KRAS sa bahay at sa ibang bansa ay gumagamit ng pamamaraang ARMS, ngunit dahil ang pamamaraan ay batay sa teknolohiya ng PCR, ang pagkukulang nito ay maaari lamang itong napansin na Mga kilalang mutasyon ng site.
4. Real-time na dami ng fluorescent na paraan ng PCR:
Ito ay isang PCR-based detection method para matukoy ang mutation sa pamamagitan ng Ct value. Ito ay may mga pakinabang ng malakas na pagtitiyak, mataas na sensitivity, tumpak na dami, madaling operasyon, at ganap na saradong reaksyon. Maraming mga eksperimentong grupo ang nagpatibay ng pamamaraang ito para sa pagtuklas ng mga mutation ng KRAS sa colorectal cancer. Kung ikukumpara sa direktang paraan ng pagkakasunud-sunod, ang dami ng PCR ay sumasakop ng isang mas malaking kalamangan sa pagiging sensitibo. Karamihan sa mga iskolar na naghahambing sa dalawang pamamaraan ay naniniwala na ang quantitative PCR ay mas sensitibo. Liu Wei et al. Gumamit ng dalawang pamamaraan upang makagawa ng isang detalyadong pagsusuri ng mga resulta ng pagtuklas ng 280 kaso ng colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 na kaso ng KRAS gene sequencing mutations, ang positibong rate ay 33.57% (94/280), kung saan, real-time fluorescence quantitative Positibo ang PCR 91 kaso ay may sensitivity ng 96.8% (91/94). Sa 186 gene sequencing wild-type na mga kaso, 184 ang negatibo sa pamamagitan ng real-time quantitative PCR, na may specificity na 98.9% (184/186). Ang coincidence rate sa pagitan ng real-time fluorescence quantitative PCR method at direct gene sequencing method ay 98.2%. Sa dalawang paraan ng pagtuklas, ang positibo at negatibong coincidence rate ng bawat mutation site ay higit sa 90%, at ang coincidence rate ng apat na site ay umabot sa 100%. Ang mga resulta ng pagtuklas ng dalawang pamamaraan ay lubos na pare-pareho, na nagpapahiwatig ng fluorescent quantitative PCR Ito ay isang mas maaasahang paraan para sa pagtuklas ng mutation. Gayunpaman, ang mga pamamaraan na nakabatay sa PCR ay kailangang magdisenyo ng mga panimulang aklat at probe batay sa mga kilalang uri ng mutation, kaya hindi matukoy ang lahat ng posibleng mutasyon, at ang mga partikular na site lamang ang maaaring makita. Kung ang isang partikular na site ay hindi kasama sa hanay ng pagtuklas ng kit, kahit na may aktwal na mutation, negatibo pa rin ang resulta ng kit. Bilang karagdagan, bagama't mataas ang sensitivity ng quantitative PCR, kung may mga maling positibo ay kailangan pa ring i-verify sa pamamagitan ng DNA sequencing technology, o retrospective at prospective na mga klinikal na eksperimento na may malalaking sample size para kumpirmahin ang ugnayan sa pagitan ng KRAS mutation status at ang efficacy ng targeted. droga. Samakatuwid, ang mataas na sensitivity ng pagtuklas ng mutation ay hindi dapat ituloy nang walang taros, habang ang pagtitiyak at katumpakan ng pagtuklas ay dapat balewalain. Sa ilalim ng iba't ibang mga kondisyon ng laboratoryo, ang pinakamainam na paraan para sa pagtuklas ng mutation sa mga specimen ay maaaring iba rin. Para sa mga specimen na may mas mataas na proporsyon ng mga mutasyon, ang Sanger sequencing method ay may mas mataas na katumpakan sa pag-detect ng gene mutations, habang para sa mga specimen na may mas mababang proporsyon ng mutations, Sanger sequencing method Maaaring mangyari ang mga maling negatibo, at ang paraan ng pagtuklas gamit ang fluorescent PCR bilang teknikal na platform maaaring mailalarawan sa pamamagitan ng mataas na sensitivity.
5. pamamaraan ng HRM:
Ito ay isa sa mga karaniwang ginagamit na pamamaraan ng pagtuklas ng gene sa mga nagdaang taon. Mayroon itong mga kalamangan ng simple, mabilis, sensitibo, at solong tubo upang maiwasan ang polusyon. Upang tuklasin ang pagiging posible ng paggamit nito sa klinikal na pagsubok, ginamit ni Liu Liqin at iba pa ang pamamaraan ng HRM upang makita ang mga mutasyon ng KRAS na gene sa 64 mga pasyente na may colorectal cancer, at pagkatapos ay gumamit ng direktang pagsunud-sunod upang mapatunayan ang mga resulta. Ang mga resulta ng HRM at direktang pagkakasunud-sunod ay napatunayang pare-pareho. Kung ikukumpara sa direktang pagkakasunud-sunod, ang pagtuklas ng mga mutasyon ng KRAS gene ng HRM ay simple at tumpak, na nagmumungkahi na ito ay isang maaasahang pamamaraan na angkop para sa klinikal na pagsubok. Chen Zhihong et al. Ginamit ang pamamaraan ng HRM upang subukan ang isang serye ng mga halo-halong mga sample na naglalaman ng iba't ibang mga sukat ng KRAS mutant plasmids upang suriin ang kanilang pagkasensitibo. Napag-alaman na ang proporsyon ng mga mutasyon ng plasmid sa halo-halong mga sample ay 10%, at ang pagkasensitibo umabot sa 10%. Kasunod nito, ginamit ang pamamaraan upang makita ang mga mutasyon ng KRAS gene sa 60 mga sample ng tisyu ng cancer sa colorectal. Kung ikukumpara sa direktang pamamaraan ng pagsunud-sunod, ang pagiging sensitibo ng pamamaraang HRM ay 100%, at ang pagiging tiyak ay 96% (43/45). Ang kawalan ng pamamaraang HRM ay imposibleng tumpak na ibigay ang tiyak na uri ng mutation at kung aling codon ang na-mutate. Kung ang isang abnormalidad ay matatagpuan sa kurba ng natutunaw, kinakailangan ang pamamaraan ng pagsunud-sunod upang matukoy ang uri ng mutation. Ang pangkat ng pananaliksik ng Harlé ay gumamit ng 156 mga kaso ng colorectal cancer tissue upang ihambing ang fluorescent PCR, ARMS at HRM na pamamaraan. Ipinapahiwatig ng mga resulta na kahit na ang tatlong pamamaraan ay angkop para sa klinikal na pagsubok, ang pagiging maaasahan ng HRM ay hindi kasing ganda ng iba pang dalawang pamamaraan.
6. Iba pang mga pamamaraan:
Bilang karagdagan sa nabanggit na mga pamamaraan, ang iba pang mga pamamaraan ng pagtuklas ay may kani-kanilang mga kalamangan at dehado sa aplikasyon, tulad ng PCR-SSCP, mataas na pagganap na likidong chromatography, pamamaraan ng pag-imbestiga ng oligonucleotide na na-optimize ng fluorescent na PCR, Pamamaraan ng pinagsamang PCR at ARMS na kombinasyon, COLD-PCR paraan, atbp Mataas na pagganap ng likidong chromatography ay may malakas na pagtitiyak, ngunit ang pangangailangan para sa mga sample ay malaki; Ang PCR-SSCP ay mababa sa gastos at matipid, ngunit ang operasyon ay kumplikado; ang teknolohiyang pagtuklas ng mutasyon batay sa fluorescent PCR ay may malakas na pagtitiyak, mataas na pagkasensitibo, at tumpak na dami, Madaling pagpapatakbo, ganap na naka-block na reaksyon at iba pang mga kalamangan, ngunit lahat ay kailangang mag-disenyo ng mga primer at probe ayon sa kilalang uri ng pag-mutate, kaya ang mga tiyak na site lamang ang maaaring napansin, at lahat ng posibleng pag-mutate ay hindi maaaring makita.
3. Buod
Sa buod, dahil ang mga site ng mutasyon at mga pamamaraan ng pagtuklas sa iba't ibang mga laboratoryo ay hindi pare-pareho, ang laki ng mga ispesimen ng tumor na sinuri at ang kalidad ng pagkuha ng DNA ay hindi pantay, na nagreresulta sa pagkakaroon ng malaki o maliit na mga pang-eksperimentong resulta sa pagitan ng mga Pagkakaiba ng mga laboratoryo, ang pamantayan. ng KRAS gene mutation detection ay naging isang klinikal na isyu ng pagtuklas ng pag-aalala sa iba't ibang mga bansa. Sa kasalukuyan, maraming pamamaraan upang matukoy ang mga mutasyon sa gene ng KRAS. Ang pagiging sensitibo mula sa mataas hanggang sa mababa ay ang ARMS, pyrosequencing, HRM, real-time na dami ng PCR, at direktang pagkakasunud-sunod. Mula sa klinikal na katotohanan, ang mababang pagiging sensitibo ay hindi kaaya-aya sa paggamot sa klinika, ngunit ang masyadong sensitibong pamamaraan ay magiging sanhi ng pagtanggi ng pagiging detalyado, at ang hindi kinakailangang maling positibong resulta ay maaaring mangyari at makaapekto sa kasunod na pamumuhay ng gamot. Isinasaalang-alang ang mga aspeto sa itaas, na sinamahan ng pamamaraang inaprubahan ng FDA, inirerekumenda ang pamamaraang ARMS. Siyempre, mula sa pananaw sa merkado, hindi dapat bigyang-diin sa akin ng mga diagnostic na molekular
thods, ngunit tumuon sa mga huling tamang resulta. Ang iba't ibang mga laboratoryo ay maaaring magpatibay ng naaangkop na mga pamamaraan ng pagsubok ayon sa aktwal na sitwasyon, ngunit kung mayroon lamang silang mahusay na mga kwalipikasyon ng operator at panloob na mga sistema ng kontrol sa kalidad. Sa ilalim ng kasalukuyang mga kondisyon sa kapaligiran ng domestic laboratoryo, kinakailangan na magsagawa ng pagsubok sa isang standardized na laboratoryo ng PCR at lumahok sa mga aktibidad sa domestic at internasyonal na inter-room quality control upang matiyak ang maaasahang kalidad ng pagsubok sa laboratoryo. Ang standardized na pamamahala ay isang kinakailangang kondisyon upang matiyak ang patuloy na mga resulta. Sa Tsina, may agarang pangangailangan na pag-isahin at i-standardize ang klinikal na pagsubok ng KRAS gene, at upang makabuo ng isang standardized at standardized na programa sa pagsubok ayon sa iba't ibang pangangailangan, at ang program na ito ay maaaring palawigin sa pagtuklas ng BRAF, PIK23450_3CA, EGFR at iba pang mga gene upang itaguyod ang klinikal na molekular na pagsusuri sa patolohiya.
