Ilaçet e synuara si cetuximab dhe panitumumab janë përdorur gjerësisht në klinikë si barna terapeutike efektive për kancerin kolorektal. Të dhënat klinike tregojnë se pacientët me mutacione KRAS nuk kanë asnjë efekt të rëndësishëm në këtë ilaç me antitrupa monoklonal dhe vetëm pacientët e tipit të egër mund të përfitojnë prej tij. Prandaj, statusi i mutacionit të gjenit KRAS konsiderohet klinikisht si një shënues i rëndësishëm terapeutik, i cili ka një korrelacion të fortë me prognozën dhe efektin e trajtimit të kancerit kolorektal. Udhëzimet e praktikës klinike të kancerit kolorektal të Rrjetit Kombëtar Gjithëpërfshirës të Kancerit (NCCN) të vitit 2009 përcaktojnë që të gjithë pacientët me kancer kolorektal metastatik duhet të zbulojnë statusin e mutacionit të gjenit KRAS dhe vetëm lloji i egër KRAS rekomandohet për të marrë terapinë e synuar EGFR. Në të njëjtin vit, Shoqata Amerikane e Onkologjisë Klinike (ASCO) lëshoi gjithashtu të njëjtat rekomandime për trajtimin klinik si një shënues molekular për terapinë e synuar ndaj tumorit, gjë që tregon rëndësinë e saj të rëndësishme udhëzuese. Aktualisht, testimi gjenetik KRAS është kryer gjerësisht klinikisht. Kryesisht vlerësojmë metodat vendase të zbulimit të mutacioneve të gjeneve KRAS për referencë në përzgjedhjen klinike.
1. Shkalla pozitive e mutacionit të gjenit KRAS në kancerin kolorektal
Në kancerin kolorektal, shkalla e mutacionit të gjenit KRAS është e lartë deri në 35% deri në 45%, dhe vendi i mutacionit me rrezik të lartë është kodonet 12 dhe 13 në ekzon 2, dhe ka akoma të rralla si 61 dhe 146. faqe Ekzistojnë shumë metoda të zbulimit për mutacionet e gjenit KRAS, duke përfshirë sekuencimin e drejtpërdrejtë, analizën e kurbës së shkrirjes me rezolucion të lartë (HRM), pirosekuencimin, PCR sasiore, sistemin e bllokut të amplifikimit të mutacionit (amplinc atio) sistemin jrefraktorymutation (ARMS), polimorfizmin e gjatësisë së fragmentit kufizues (RFLP), Analizë e polimorfizmit të reaksionit zinxhir polimerazë-konformim me një fillesë (polimorfizëm konfromimi PCR-njëfarësh (PCR-SSCP), bashkë-amplifikim në temperaturë të ulët të denatyrimit PCR (COLD-PCR) dhe analizë të kromatografisë së lëngshme me performancë të lartë, etj.
2. Vlerësimi i metodave të zbulimit të mutacionit KRAS
1. Metoda e sekuencimit të drejtpërdrejtë: methodshtë metoda më klasike për zbulimin e mutacioneve të gjenit KRAS, dhe është gjithashtu standardi i artë për zbulimin e mutacioneve të gjeneve. Metoda e sekuencimit të drejtpërdrejtë bazuar në parimin e sekuencimit didoksie mund të tregojë më intuitivisht ndryshimin e sekuencës gjenike në formën e hartës së pikut bazë. Lloji i zbulimit është më gjithëpërfshirës, dhe është gjithashtu metoda më e hershme e zbulimit të mutacionit. Pavarësisht shfaqjes së platformave të sekuencave të gjeneratës së re, studiuesit brenda dhe jashtë vendit ende përdorin rezultatet e renditjes direkte si një shkallë për të matur dhe përcaktuar besueshmërinë e metodës së re. Gao Jing etj. Renditja e zbatuar e drejtpërdrejtë për zbulimin e mutacioneve të gjenit KRAS dhe BRAF në 966 pacientë me kancer kolorektal. Kjo është gjithashtu analiza e mutacionit të gjenit KRAS me kampionin më të madh të brendshëm të raportuar në literaturë. Ling Yun dhe të tjerët besojnë se metoda e sekuencimit të drejtpërdrejtë është metoda më e drejtpërdrejtë dhe efektive e zbulimit për të kuptuar statusin e mutacionit të secilit gjen, e cila mund të sqarojë llojin e mutacionit, veçanërisht për zbulimin e mutacioneve të panjohura. Megjithëse ndjeshmëria e kësaj metode është relativisht e ulët, ajo mund të përmirësohet me metoda të tilla si mikrodiseksioni për të pasuruar qelizat tumorale. Metoda e sekuencimit të drejtpërdrejtë është aplikuar gjithashtu në zbulimin e KRAS-it për madhësi më të mëdha të mostrave në grupe të tjera kërkimore vendase. Sidoqoftë, ndjeshmëria më e ulët është disavantazhi më i madh i sekuencimit direkt. Duke gjykuar nga rezultatet e raportuara në Kinë, shkalla e zbulimit të mutacionit me renditje direkte nuk është e ulët. Liu Xiaojing etj. Krahasuar sekuencën direkte dhe pirgin e acidit nukleik peptid PCR (PNA-PCR) dhe zbuloi se 43 raste të mutacioneve të gjenit KRAS u zbuluan nga sekuencimi i drejtpërdrejtë. Përveç këtyre mutacioneve, PNA-PCR u zbulua gjithashtu nga sekuencimi i drejtpërdrejtë. Dhjetë mutacione u gjetën në llojin e egër dhe u bënë sugjerime për të përcaktuar pacientët e tipit të egër me PCR dhe metodën e sekuencës direkte për të përcaktuar pacientët mutantë. Qiu Tian etj. Zbuluan 131 ekzemplarë të kancerit kolorektal nga metoda fluoreshente e sondës oligonukleotide të optimizuar nga PCR dhe metoda e sekuencës direkte, dhe normat pozitive të mutacioneve të gjenit KRAS ishin 41.2% (54/131) dhe 40.5% (53/131)). Bai Dongyu gjithashtu diskutoi mbi ndjeshmërinë e zbulimit të metodave të ndryshme. Nga 200 pacientë me kancer kolorektal, 63 u zbuluan nga mutacionet RT-qPCR, dhe shkalla e zbulimit të mutacioneve ishte 31.5%; 169 mostra u sekuencuan me sukses nga sekuencimi i drejtpërdrejtë i 50 rasteve të mutacionit, shkalla e zbulimit të mutacionit 29.6%. Megjithëse metoda e sekuencës së drejtpërdrejtë mund të zbulojë me saktësi, objektivisht dhe në mënyrë specifike statusin e mutacionit të gjenit KRAS, mangësitë e tij, siç janë kërkesat e larta teknike, procedurat e ndërlikuara të funksionimit, lehtë për të shkaktuar ndotje të kryqëzuar dhe interpretimi i gjatë dhe i mundimshëm i rezultateve janë gjithashtu shumë e dukshme Shpesh nuk ka pajisje për sekuencën, dhe ekzemplari duhet të dërgohet në kompaninë përkatëse për testim, i cili zgjat shumë kohë dhe ka një kosto të lartë, kështu që ka kufizime të mëdha.
Metoda e piroseksimit:
Metoda e pirosekuencimit është gjithashtu një metodë më e përshtatshme për zbulimin e mutacionit të gjenit KRAS përsa i përket ndjeshmërisë së renditjes, kostos së zbulimit dhe kohës për tu raportuar. Përsëritshmëria e kësaj metode është më e mirë. Sipas hartës së pikut të marrë Studimi sasior i frekuencës së mutacionit të një vendi të caktuar dhe krahasimi midis frekuencave të mutacionit të vendeve të ndryshme janë të qarta në një shikim. Në vitet e fundit, Ogino et al., Hutchins et al. Kanë përdorur teknologjinë pirosekuenciale për të provuar mutacionet KRAS në pacientë me mostra të mëdha të kancerit kolorektal. Rezultatet tregojnë se teknologjia pirosekuenciale është një mjet i fuqishëm për shqyrtimin e pacientëve për terapi të synuar. Diagnoza molekulare e tumorit ka perspektiva të gjera të aplikimit. Studiuesit vendas gjithashtu kanë përdorur teknologjinë e pirosekuencave për të zbuluar klinikisht mutacionet KRAS në kancerin kolorektal, me saktësi dhe besueshmëri të mirë. Kjo metodë ka specifikë më të mirë dhe ndjeshmëri më të lartë. SundstrÖm etj. Krahasuar PCR specifike alerike dhe pirosekuencat në aplikimet klinike dhe zbuloi se në 314 raste të mutacioneve KRAS në pacientët me kancer kolorektal, specifikimi i pirosekuencave ishte më i lartë se ai i aleleve. PCR, dhe ka ndjeshmëri të mirë ndaj indeve me përmbajtje të ulët të qelizave tumorale. Holloni përqindjen e qelizave tumorale në 1.25% në 2.5%. Pirosekuencimi ende mund të zbulojë sinjalet e mutacionit. Kur përmbajtja minimale e aleleve mutante në mostër duhet të arrijë 20% për t'u zbuluar nga sekuencat Sanger, ajo mund të zbulohet me metodën HRM kur arrin 10%, dhe për pirosekuencat vetëm mutacionet mund të zbulohen me 5%. Alele. Ne përdorëm pirosekuencën për të zbuluar mutacionet e KRAS në 717 pacientë me kancer kolorektal dhe zbuluam që frekuenca e mutacioneve KRAS ishte 40.9%. Shkalla e mutacionit të kodonit 12 ishte 30.1%, shkalla e mutacionit të kodonit 13 ishte 9.8% dhe shkalla e mutacionit të kodonit 61 ishte 1.0%. Ne i pasuruam indet me përmbajtje më të lartë të tumorit me mikrodiseksion manual para testimit, duke i bërë rezultatet më të besueshme. Metoda ka ndjeshmëri dhe specifikë të mirë dhe është e lehtë të zhvillohet në praktikën klinike. Disavantazhi i pirosekuencimit është kostoja e lartë e zbulimit, dhe procesi i përgatitjes së ADN-së me një fillesë për sekuencimin e mostrave është i rëndë. Në të ardhmen, pirosekuencat mund t'i kushtohen zhvillimit të teknologjisë për zbulimin e drejtpërdrejtë të produkteve PCR me dy fillesa, gjë që do të thjeshtojë shumë funksionimin. Dhe në mënyrë efektive të zvogëlojë koston e renditjes për të arritur promovimin gjithëpërfshirës të testimit klinik.
3. Metoda ARMS:
Kjo teknologji përdor abetaret për të bërë dallimin midis gjeneve të tipit të egër dhe gjeneve mutantë, wh
që është raportuar qysh në vitet 1980. Përparësia më e madhe e kësaj metode është se ajo ka një ndjeshmëri deri në 1.0% dhe mund të zbulojë gjenet mutante në mostra të ulëta deri në 1.0%. Në dizajn, gjatësia e produktit të synuar mund të shkurtohet në masën më të madhe dhe problemi që rezultatet e sakta të zbulimit nuk mund të merret sepse shumica e ADN-së së nxjerrë nga mostra e indit të ngulitur në parafinë është e copëtuar. Kjo teknologji kombinon platformën PCR në kohë reale për të arritur funksionimin e tubave të mbyllur gjatë amplifikimit. Operacioni është i thjeshtë dhe nuk kërkon post-përpunim të produktit, i cili mund të shmangë ndotjen e produktit të amplifikuar në masën më të madhe. Aktualisht, metoda akrep-ARMS që kombinon sondën e akrepit dhe sistemin e mutacionit të bllokut të amplifikimit përdoret më shpesh në botë. Kombinimi i të dy teknologjive mund të maksimizojë ndjeshmërinë dhe specifikën e të dy palëve. Gao Jie etj. Përdore këtë metodë për të zbuluar statusin e mutacionit të gjenit KRAS në 167 pacientë me kancer kolorektal, duke sugjeruar që kjo metodë të jetë e besueshme dhe e saktë. Wang Hui etj. Përdoret gjithashtu ARMS për të zbuluar mutacionet e KRAS në 151 raste të indeve të fiksuara në formaldehid dhe të ngulitura në parafinë. Në Shtetet e Bashkuara, kompleti COBAS (Roche) i aprovuar nga FDA për testimin klinik të KRAS dhe kompleti Therascreen RGQ (Qiagen) i certifikuar nga Diagnostifikimi In Vitro i Bashkimit Evropian (CE-IVD) përdorin të gjithë parimin ARMS. Ndër metodat e zakonshme, metoda ARMS është më e ndjeshmja dhe kostoja është relativisht e arsyeshme. Prandaj, një pjesë e madhe e zbulimit klinik të gjeneve KRAS brenda dhe jashtë vendit po përdor metodën ARMS, por për shkak se metoda bazohet në teknologjinë PCR, e meta e saj është se mund të zbulohet vetëm mutacione të faqeve të njohura.
4. Metoda sasiore e PCR-së e fluoreshencës në kohë reale:
Është një metodë zbulimi e bazuar në PCR për të përcaktuar mutacionin me vlerën e Ct. Ka avantazhet e specifikës së fortë, ndjeshmërisë së lartë, përcaktimit të saktë të sasisë, funksionimit të lehtë dhe reagimit plotësisht të mbyllur. Shumë grupe eksperimentale kanë adoptuar këtë metodë për zbulimin e mutacioneve KRAS në kancerin kolorektal. Krahasuar me metodën e sekuencës direkte, PCR sasiore zë një avantazh më të madh në ndjeshmëri. Shumica e studiuesve që krahasojnë dy metodat besojnë se PCR sasiore është më e ndjeshme. Liu Wei et al. Përdori dy metoda për të bërë një analizë të detajuar të rezultateve të zbulimit të 280 rasteve të mutacioneve të gjeneve KRAS të kancerit kolorektal, 94 rasteve të mutacioneve të sekuencës së gjeneve KRAS, shkalla pozitive ishte 33.57% (94/280), nga të cilat, sasiore e fluoreshencës në kohë reale PCR ishte pozitive 91 raste kishin një ndjeshmëri prej 96.8% (91/94). Nga 186 rastet e sekuencës së gjeneve të tipit të egër, 184 ishin negative nga PCR sasiore në kohë reale, me një specifikë prej 98.9% (184/186). Shkalla e koincidencës ndërmjet metodës sasiore PCR të fluoreshencës në kohë reale dhe metodës së sekuencës direkte të gjeneve ishte 98.2%. Në dy metodat e zbulimit, normat pozitive dhe negative të koincidencës së çdo vendi të mutacionit ishin mbi 90%, dhe shkalla e koincidencës së katër vendeve arriti në 100%. Rezultatet e zbulimit të dy metodave ishin shumë të qëndrueshme, duke treguar PCR sasiore fluoreshente. Është një metodë më e besueshme për zbulimin e mutacioneve. Megjithatë, metodat e bazuara në PCR duhet të dizajnojnë primerë dhe sonda bazuar në llojet e njohura të mutacioneve, kështu që të gjitha mutacionet e mundshme nuk mund të zbulohen dhe mund të zbulohen vetëm vende specifike. Nëse një vend i caktuar nuk përfshihet në diapazonin e zbulimit të kompletit, edhe nëse në të vërtetë ka një mutacion, rezultati i kompletit është ende negativ. Për më tepër, edhe pse ndjeshmëria e PCR sasiore është e lartë, nëse ka rezultate false pozitive ende duhet të verifikohet nga teknologjia e sekuencës së ADN-së, ose eksperimentet klinike retrospektive dhe prospektive me madhësi të mëdha mostrash për të konfirmuar korrelacionin midis statusit të mutacionit KRAS dhe efikasitetit të mutacionit të synuar. droga . Prandaj, ndjeshmëria e lartë e zbulimit të mutacioneve nuk duhet ndjekur verbërisht, ndërsa specifika dhe saktësia e zbulimit duhet të injorohen. Në kushte të ndryshme laboratorike, metoda optimale për zbulimin e mutacioneve në ekzemplarë mund të jetë gjithashtu e ndryshme. Për ekzemplarët me një përqindje më të lartë mutacionesh, metoda e sekuencës Sanger ka një saktësi më të lartë në zbulimin e mutacioneve të gjeneve, ndërsa për ekzemplarët me një përqindje më të ulët mutacionesh, metoda e sekuencës Sanger mund të ndodhin negativë të rremë dhe metoda e zbulimit duke përdorur PCR fluoreshente si platformë teknike. mund të karakterizohet me ndjeshmëri të lartë.
5. Metoda HRM:
Isshtë një nga metodat më të zakonshme të zbulimit të gjeneve në vitet e fundit. Ka avantazhet e tubit të thjeshtë, të shpejtë, të ndjeshëm dhe të vetëm për të shmangur ndotjen. Në mënyrë që të eksplorojnë fizibilitetin e përdorimit të tij në testimin klinik, Liu Liqin dhe të tjerët përdorën metodën HRM për të zbuluar mutacionet e gjenit KRAS në 64 pacientë me kancer kolorektal, dhe më pas përdorën renditjen direkte për të verifikuar rezultatet. Rezultatet e HRM dhe sekuencave direkte janë gjetur të qëndrueshme. Krahasuar me renditjen direkte, zbulimi i mutacioneve të gjenit KRAS nga HRM është i thjeshtë dhe i saktë, duke sugjeruar që ajo është një metodë e besueshme e përshtatshme për testimin klinik. Chen Zhihong etj. Përdoret metoda HRM për të provuar një sërë mostrash të përziera që përmbajnë përmasa të ndryshme të plazmideve mutante KRAS për të vlerësuar ndjeshmërinë e tyre. U zbulua se përqindja e mutacioneve të plazmidit në mostrat e përziera ishte 10%, dhe ndjeshmëria arriti në 10%. Më pas, metoda u përdor për të zbuluar mutacionet e gjenit KRAS në 60 mostra të indeve të kancerit kolorektal. Krahasuar me metodën e sekuencës së drejtpërdrejtë, ndjeshmëria e metodës HRM ishte 100%, dhe specifikimi ishte 96% (43/45). Disavantazhi i metodës HRM është se është e pamundur të sigurohet me saktësi lloji specifik i mutacionit dhe cili kodon është mutuar. Nëse një anomali gjendet në lakoren e shkrirjes, është e nevojshme metoda e sekuencës për të përcaktuar llojin e mutacionit. Grupi kërkimor Harlé përdori 156 raste të indeve të kancerit kolorektal për të krahasuar metodat fluoreshente PCR, ARMS dhe HRM. Rezultatet sugjerojnë që edhe pse të tre metodat janë të përshtatshme për testimin klinik, besueshmëria e HRM nuk është aq e mirë sa dy metodat e tjera.
6. Metoda të tjera:
Përveç metodave të përmendura më lart, metodat e tjera të zbulimit kanë avantazhet dhe disavantazhet e tyre në zbatim, të tilla si PCR-SSCP, kromatografia e lëngshme me performancë të lartë, metoda e sondës oligonukleotide të optimizuar nga PCR fluoreshente, metoda e kombinimit të PCR-ve të ngulitura dhe ARMS, COLD-PCR metoda, etj. Kromatografia e lëngshme me performancë të lartë ka specifikë të fortë, por kërkesa për mostra është e madhe; PCR-SSCP është me kosto të ulët dhe ekonomike, por operacioni është i komplikuar; teknologjia e zbulimit të mutacionit e bazuar në PCR fluoreshente ka specifikë të fortë, ndjeshmëri të lartë dhe sasiore të saktë, funksionim të lehtë, reagim të bllokuar plotësisht dhe përparësi të tjera, por të gjithë duhet të projektojnë abetare dhe sonda sipas llojit të njohur të mutacionit, kështu që vetëm vendet specifike mund të jenë zbuluar, dhe të gjitha mutacionet e mundshme nuk mund të zbulohen.
3. përmbledhje
Në përmbledhje, për shkak se vendet e mutacionit dhe metodat e zbulimit në laboratorë të ndryshëm nuk janë të njëtrajtshme, madhësia e ekzemplarëve të tumorit të analizuar dhe cilësia e nxjerrjes së ADN-së janë gjithashtu të pabarabarta, duke rezultuar në ekzistencën e rezultateve të mëdha ose të vogla eksperimentale midis laboratorëve Dallimet, standardizimi zbulimi i mutacionit të gjenit KRAS është bërë një çështje shqetësuese e zbulimit klinik në vende të ndryshme. Aktualisht, ka shumë metoda për të zbuluar mutacionet në gjenin KRAS. Ndjeshmëria nga e larta në të ultën është ARMS, pirosekuencimi, HRM, PCR sasiore në kohë reale dhe sekuencimi i drejtpërdrejtë. Nga realiteti klinik, ndjeshmëria e ulët nuk është e favorshme për trajtimin klinik, por metodat shumë të ndjeshme do të bëjnë që specifikimi i zbulimit të bjerë, dhe rezultate të panevojshme false pozitive mund të ndodhin dhe të ndikojnë në regjimin pasues të ilaçeve të pacientit. Duke marrë parasysh aspektet e mësipërme, të kombinuar me metodën e aprovuar nga FDA, rekomandohet metoda ARMS. Sigurisht, nga këndvështrimi i tregut, diagnostikimi molekular nuk duhet të më theksojë
metodat, por fokusohuni në rezultatet e sakta përfundimtare. Laboratorë të ndryshëm mund të miratojnë metoda të përshtatshme testimi sipas situatës aktuale, por vetëm nëse kanë kualifikime të mira operatori dhe sisteme të brendshme të kontrollit të cilësisë. Në kushtet aktuale mjedisore të laboratorit vendas, është e nevojshme të kryhen testime në një laborator të standardizuar PCR dhe të marrin pjesë në aktivitetet vendase dhe ndërkombëtare të kontrollit të cilësisë brenda dhomave për të siguruar cilësi të besueshme të testimit laboratorik. Menaxhimi i standardizuar është një kusht i domosdoshëm për të siguruar rezultate të vazhdueshme. Në Kinë, ekziston një nevojë urgjente për të unifikuar dhe standardizuar testimin klinik të gjenit KRAS dhe për të gjeneruar një program testimi të standardizuar dhe të standardizuar sipas nevojave të ndryshme, dhe ky program mund të shtrihet në zbulimin e BRAF, PIK23450_3CA, EGFR dhe gjene të tjera për të nxitur testimin klinik të patologjisë molekulare.
