Такие таргетные препараты, как цетуксимаб и панитумумаб, широко используются в клинике в качестве эффективных терапевтических препаратов при колоректальном раке. Клинические данные показывают, что пациенты с мутациями KRAS не оказывают существенного влияния на этот препарат моноклональных антител, и только пациенты дикого типа могут получить от него пользу. Таким образом, статус мутации гена KRAS клинически рассматривается как важный терапевтический маркер, который имеет сильную корреляцию с прогнозом и эффектом лечения колоректального рака. Рекомендации по клинической практике колоректального рака Национальной комплексной сети по борьбе с раком (NCCN) 2009 года предусматривают, что все пациенты с метастатическим колоректальным раком должны выявить статус мутации гена KRAS, и только KRAS дикого типа рекомендуется получать таргетную терапию EGFR. В том же году Американское общество клинической онкологии (ASCO) также выпустило те же рекомендации по клиническому лечению, что и молекулярный маркер для таргетной терапии опухолей, что показывает его важное руководящее значение. В настоящее время генетическое тестирование KRAS широко проводится клинически. В основном мы оцениваем отечественные методы обнаружения мутаций гена KRAS для использования в клиническом отборе.
1. Положительная частота мутации гена KRAS при колоректальном раке.
При колоректальном раке частота мутаций гена KRAS достигает 35–45%, а сайт мутации высокого риска - это кодоны 12 и 13 экзона 2, и все еще есть редкие, такие как 61 и 146. Мутации. сайт. Существует множество методов обнаружения мутаций гена KRAS, в том числе прямое секвенирование, анализ кривой плавления с высоким разрешением (HRM), пиросеквенирование, количественная ПЦР, система блокировки амплификации мутаций (амплификация), система рефрактерной мутации (ARMS), полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP), полимеразная цепная реакция - анализ однонитевого конформационного полиморфизма (ПЦР-полиморфизм однонитевой конформации (PCR-SSCP), коамплификация при более низкой температуре денатурации, ПЦР (COLD-PCR) и анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии и т. д.
2. Оценка методов обнаружения мутации KRAS.
1. Метод прямого секвенирования: это самый классический метод обнаружения мутаций гена KRAS, а также золотой стандарт для обнаружения генных мутаций. Метод прямого секвенирования, основанный на принципе дидезокси-секвенирования, может наиболее интуитивно показать изменение последовательности гена в виде карты базовых пиков. Тип обнаружения является более всеобъемлющим, и это также самый ранний применяемый метод обнаружения мутаций. Несмотря на появление платформ секвенирования нового поколения, ученые в стране и за рубежом по-прежнему используют результаты прямого секвенирования в качестве шкалы для измерения и определения надежности нового метода. Гао Цзин и др. Применено прямое секвенирование для выявления мутаций генов KRAS и BRAF у 966 пациентов с колоректальным раком. Это также анализ мутации гена KRAS с крупнейшей отечественной выборкой, описанной в литературе. Лин Юнь и другие считают, что метод прямого секвенирования является наиболее прямым и эффективным методом обнаружения для понимания статуса мутации каждого гена, который может уточнить тип мутации, особенно для обнаружения неизвестных мутаций. Хотя чувствительность этого метода относительно низкая, его можно улучшить с помощью таких методов, как микродиссекция, для обогащения опухолевых клеток. Метод прямого секвенирования также применялся для обнаружения KRAS более крупных выборок в других отечественных исследовательских группах. Однако более низкая чувствительность - самый большой недостаток прямого секвенирования. Судя по результатам, полученным в Китае, частота выявления мутаций путем прямого секвенирования невысока. Лю Сяоцзин и др. Сравнив прямое секвенирование и ПЦР с фиксацией пептидных нуклеиновых кислот (PNA-PCR), было обнаружено, что с помощью прямого секвенирования было обнаружено 43 случая мутаций гена KRAS. В дополнение к этим мутациям, ПНК-ПЦР также была обнаружена прямым секвенированием. Было обнаружено десять мутаций у дикого типа, и были сделаны предложения по определению пациентов дикого типа с помощью ПЦР и метода прямого секвенирования для определения мутантных пациентов. Цю Тянь и др. Обнаружен 131 образец рака прямой кишки с помощью метода флуоресцентного ПЦР-оптимизированного олигонуклеотидного зонда и метода прямого секвенирования, а частота положительных мутаций гена KRAS составила 41.2% (54/131) и 40.5% (53/131)). Бай Дунъюй также рассказал о чувствительности обнаружения различных методов. Из 200 пациентов с колоректальным раком 63 были обнаружены с помощью мутаций RT-qPCR, и уровень обнаружения мутаций составил 31.5%; 169 образцов были успешно секвенированы прямым секвенированием 50 случаев мутации, уровень обнаружения мутаций 29.6%. Хотя метод прямого секвенирования может точно, объективно и конкретно определять статус мутации гена KRAS, его недостатки, такие как высокие технические требования, сложные операционные процедуры, легкость возникновения перекрестного заражения, а также трудоемкая и трудоемкая интерпретация результатов, также весьма значительны. очевидный. Часто оборудование для секвенирования отсутствует, и образец необходимо отправить в соответствующую компанию для тестирования, что занимает много времени и имеет высокую стоимость, поэтому имеет большие ограничения.
Метод пиросеквенирования:
Метод пиросеквенирования также является более удобным методом обнаружения мутаций гена KRAS с точки зрения чувствительности секвенирования, стоимости обнаружения и времени для сообщения. Воспроизводимость этого метода лучше. Согласно полученной карте пиков. Количественное исследование частоты мутаций определенного сайта и сравнение частот мутаций разных сайтов наглядны с первого взгляда. В последние годы Огино и др., Хатчинс и др. Использовали технологию пиросеквенирования для тестирования мутаций KRAS у пациентов с большими образцами колоректального рака. Результаты показывают, что технология пиросеквенирования является мощным инструментом для скрининга пациентов на предмет таргетной терапии. Молекулярная диагностика опухолей имеет широкие перспективы применения. Отечественные ученые также использовали технологию пиросеквенирования для клинического обнаружения мутаций KRAS при колоректальном раке с хорошей точностью и надежностью. Этот метод имеет лучшую специфичность и большую чувствительность. Сундстрём и др. Сравнив аллель-специфическую ПЦР и пиросеквенирование в клинических применениях, было обнаружено, что в 314 случаях мутаций KRAS у пациентов с колоректальным раком специфичность пиросеквенирования была выше, чем у аллелей. ПЦР и имеет хорошую чувствительность к тканям с низким содержанием опухолевых клеток. Разбавьте долю опухолевых клеток от 1.25% до 2.5%. Пиросеквенирование все еще может обнаруживать сигналы мутации. Когда минимальное содержание мутантных аллелей в образце должно достигать 20% для обнаружения с помощью секвенирования по Сэнгеру, оно может быть обнаружено методом HRM, когда оно достигает 10%, а для пиросеквенирования только мутации могут быть обнаружены на 5%. Аллели. Мы использовали пиросеквенирование для выявления мутаций KRAS у 717 пациентов с колоректальным раком и обнаружили, что частота мутаций KRAS составила 40.9%. Частота мутаций кодона 12 составляла 30.1%, частота мутаций кодона 13 составляла 9.8%, а частота мутаций кодона 61 составляла 1.0%. Перед тестированием мы обогатили ткани с более высоким содержанием опухолей путем ручного микродиссекции, что сделало результаты более надежными. Метод обладает хорошей чувствительностью и специфичностью и легко реализуется в клинической практике. Недостатком пиросеквенирования является высокая стоимость обнаружения, а процесс подготовки одноцепочечной ДНК для секвенирования образцов является громоздким. В будущем пиросеквенирование может быть посвящено развитию технологии прямого обнаружения двухцепочечных продуктов ПЦР, что значительно упростит операцию. И эффективно снизить стоимость секвенирования для достижения всестороннего продвижения клинических испытаний.
3. Метод АРМС:
В этой технологии используются праймеры для различения генов дикого типа и мутантных генов.
ich был зарегистрирован еще в 1980-х годах. Самым большим преимуществом этого метода является то, что он имеет чувствительность до 1.0% и может обнаруживать мутантные гены в образцах с точностью до 1.0%. При разработке длина целевого продукта может быть сокращена в наибольшей степени, и проблема состоит в том, что невозможно получить точные результаты обнаружения, поскольку большая часть ДНК, извлеченная из залитого в парафин образца ткани, является фрагментированной. Эта технология объединяет платформу ПЦР в реальном времени для достижения работы в закрытой пробирке во время амплификации. Операция проста и не требует дополнительной обработки продукта, что позволяет избежать загрязнения амплифицированного продукта в наибольшей степени. В настоящее время в мире более широко используется метод scorpion-ARMS, сочетающий зонд-скорпион и систему мутации блока амплификации. Комбинация двух технологий может максимизировать чувствительность и специфичность обеих сторон. Гао Цзе и др. Использовал этот метод для определения статуса мутации гена KRAS у 167 пациентов с колоректальным раком, что позволило предположить, что этот метод является надежным и точным. Ван Хуэй и др. Также использовали ARMS для обнаружения мутаций KRAS в 151 случае фиксированных формальдегидом и залитых парафином тканей. В США набор COBAS (Roche), одобренный FDA для клинического тестирования KRAS, и набор Therascreen RGQ (Qiagen), сертифицированный Европейским союзом для диагностики in vitro (CE-IVD), используют принцип ARMS. Среди распространенных методов наиболее чувствительным является метод ARMS, а его стоимость относительно разумна. Таким образом, большая часть клинического обнаружения генов KRAS в стране и за рубежом проводится с использованием метода ARMS, но поскольку этот метод основан на технологии ПЦР, его недостатком является то, что он может быть обнаружен только мутациями известных сайтов.
4. Метод количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени:
Это метод обнаружения на основе ПЦР, позволяющий определить мутацию по значению Ct. Его преимущества заключаются в высокой специфичности, высокой чувствительности, точном количественном определении, простоте эксплуатации и полностью закрытой реакции. Многие экспериментальные группы использовали этот метод для обнаружения мутаций KRAS при колоректальном раке. По сравнению с методом прямого секвенирования количественная ПЦР имеет большее преимущество по чувствительности. Большинство ученых, сравнивающих эти два метода, считают, что количественная ПЦР более чувствительна. Лю Вэй и др. С помощью двух методов был проведен детальный анализ результатов выявления 280 случаев колоректального рака с мутациями гена KRAS, 94 случаев мутаций секвенирования гена KRAS, положительный показатель составил 33.57% (94/280), из них количественная флуоресценция в реальном времени. ПЦР была положительной: в 91 случае чувствительность составила 96.8% (91/94). Из 186 случаев секвенирования генов дикого типа 184 были отрицательными по данным количественной ПЦР в реальном времени со специфичностью 98.9% (184/186). Степень совпадения между методом флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени и методом прямого секвенирования генов составила 98.2%. В двух методах обнаружения показатели положительного и отрицательного совпадения каждого сайта мутации превышали 90%, а уровень совпадения четырех сайтов достигал 100%. Результаты обнаружения двух методов были очень согласованными, что указывает на флуоресцентную количественную ПЦР. Это более надежный метод обнаружения мутаций. Однако методы, основанные на ПЦР, требуют разработки праймеров и зондов на основе известных типов мутаций, поэтому все возможные мутации не могут быть обнаружены, а можно обнаружить только определенные сайты. Если определенный сайт не входит в диапазон обнаружения набора, даже если мутация действительно существует, результат набора все равно будет отрицательным. Кроме того, хотя чувствительность количественной ПЦР высока, наличие ложноположительных результатов все же необходимо проверять с помощью технологии секвенирования ДНК или ретроспективных и проспективных клинических экспериментов с большими размерами выборки для подтверждения корреляции между статусом мутации KRAS и эффективностью таргетного лечения. наркотики . Поэтому не следует слепо стремиться к высокой чувствительности обнаружения мутаций, а специфичность и точность обнаружения следует игнорировать. В разных лабораторных условиях оптимальный метод выявления мутаций в образцах также может быть разным. Для образцов с более высокой долей мутаций метод секвенирования по Сэнгеру имеет более высокую точность обнаружения генных мутаций, тогда как для образцов с более низкой долей мутаций метод секвенирования по Сэнгеру может иметь ложноотрицательные результаты, а метод обнаружения использует флуоресцентную ПЦР в качестве технической платформы. может характеризоваться высокой чувствительностью.
5. Метод УЧР:
Это один из наиболее часто используемых методов обнаружения генов в последние годы. Он имеет преимущества простой, быстрой, чувствительной и одиночной трубки, чтобы избежать загрязнения. Чтобы изучить возможность его использования в клинических испытаниях, Лю Лицинь и другие использовали метод HRM для обнаружения мутаций гена KRAS у 64 пациентов с колоректальным раком, а затем использовали прямое секвенирование для проверки результатов. Результаты HRM и прямого секвенирования согласуются. По сравнению с прямым секвенированием обнаружение мутаций гена KRAS с помощью HRM является простым и точным, что позволяет предположить, что это надежный метод, подходящий для клинических испытаний. Chen Zhihong et al. Использовали метод HRM для тестирования серии смешанных образцов, содержащих различные пропорции мутантных плазмид KRAS, для оценки их чувствительности. Было обнаружено, что доля плазмидных мутаций в смешанных образцах составляла 10%, а чувствительность достигала 10%. Впоследствии этот метод был использован для обнаружения мутаций гена KRAS в 60 образцах ткани колоректального рака. По сравнению с методом прямого секвенирования, чувствительность метода HRM составляла 100%, а специфичность - 96% (43/45). Недостатком метода HRM является то, что невозможно точно определить конкретный тип мутации и кодон, который мутировал. Если на кривой плавления обнаруживается отклонение от нормы, необходим метод секвенирования для определения типа мутации. Исследовательская группа Харле использовала 156 случаев ткани колоректального рака для сравнения методов флуоресцентной ПЦР, ARMS и HRM. Результаты показывают, что, хотя эти три метода подходят для клинических испытаний, надежность HRM не так хороша, как два других метода.
6. Другие методы:
В дополнение к вышеупомянутым методам, другие методы обнаружения имеют свои преимущества и недостатки в применении, такие как ПЦР-SSCP, высокоэффективная жидкостная хроматография, метод флуоресцентных ПЦР-оптимизированных олигонуклеотидных зондов, Метод вложенной ПЦР и комбинации ARMS, ХОЛОД-ПЦР. метод и т. д. Высокоэффективная жидкостная хроматография имеет высокую специфичность, но спрос на образцы велик; PCR-SSCP дешев и экономичен, но операция сложна; Технология обнаружения мутаций, основанная на флуоресцентной ПЦР, обладает высокой специфичностью, высокой чувствительностью и точными количественными показателями, простотой в эксплуатации, полностью блокированной реакцией и другими преимуществами, но все они требуют разработки праймеров и зондов в соответствии с известным типом мутации, поэтому можно использовать только определенные сайты. обнаружены, и все возможные мутации не могут быть обнаружены.
3. Резюме
Таким образом, поскольку сайты мутаций и методы обнаружения в разных лабораториях неодинаковы, размер анализируемых образцов опухолей и качество экстракции ДНК также неодинаковы, что приводит к существованию больших или малых экспериментальных результатов между лабораториями Различия, стандартизация Обнаружение мутации гена KRAS стало проблемой клинической диагностики, вызывающей озабоченность в различных странах. В настоящее время существует множество методов обнаружения мутаций в гене KRAS. Чувствительность от высокой к низкой - это ARMS, пиросеквенирование, HRM, количественная ПЦР в реальном времени и прямое секвенирование. С клинической реальности низкая чувствительность не способствует клиническому лечению, но слишком чувствительные методы приведут к снижению специфичности обнаружения, и могут возникнуть ненужные ложноположительные результаты, которые повлияют на последующий режим лечения пациента. Принимая во внимание вышеуказанные аспекты, в сочетании с методом, одобренным FDA, рекомендуется метод ARMS. Конечно, с точки зрения рынка, молекулярная диагностика не должна ставить меня в центр внимания.
методы, но сосредоточьтесь на окончательных правильных результатах. Различные лаборатории могут применять соответствующие методы испытаний в соответствии с реальной ситуацией, но только в том случае, если они обладают хорошей квалификацией операторов и внутренними системами контроля качества. В нынешних условиях внутренней лабораторной среды необходимо проводить тестирование в стандартизированной лаборатории ПЦР и участвовать во внутренних и международных мероприятиях по контролю качества внутри помещений, чтобы обеспечить надежное качество лабораторных испытаний. Стандартизированное управление является необходимым условием для обеспечения постоянных результатов. В Китае существует острая необходимость унифицировать и стандартизировать клиническое тестирование гена KRAS, а также разработать стандартизированную и стандартизированную программу тестирования в соответствии с различными потребностями, и эта программа может быть расширена для обнаружения BRAF, PIK23450_3CA, EGFR и других генов для продвижения клинических исследований молекулярной патологии.
