Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
အူမကင်ဆာအတွက် KRAS ဗီဇ mutation ၏ 1. အပြုသဘောဆောင်မှုနှုန်း
အူမကြီးကင်ဆာတွင် KRAS ဗီဇ၏ mutation rate သည် ၃၅% မှ ၄၅% အထိမြင့်မားပြီးအန္တရာယ်ရှိသော mutation site သည် exon 35 ရှိ codons 45 နှင့် 12 ဖြစ်ပြီး ၆၁ နှင့် ၁၄၆ ကဲ့သို့သောရှားပါးသောမျိုးများရှိသေးသည်။ ဆိုဒ် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းအတွက်ရှာဖွေခြင်းနည်းစနစ်များ၊ တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်၊ မြင့်မားသော resolution အရည်ပျော်မှုကွေးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (pyrosequencing)၊ အရေအတွက် PCR၊ mutation amplification block system (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS)၊ ကန့်သတ်ချက်အပိုင်းအစ polymorphism (RFLP)၊ polymerase ကွင်းဆက်တုံ့ပြန်မှု - Single- ကမ်းနားလမ်းခုန် polymorphic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ (PCR-singlestrand confomation polymorphic (PCR-SSCP), နိမ့် denaturation အပူချိန် PCR (COLD-PCR) နှင့်စွမ်းဆောင်ရည်မြင့် Chromatography ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာ, မှာပူးတွဲ amplification, etc)
KRAS mutation detection နည်းလမ်းများ 2. အကဲဖြတ်
1. တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်း - ၎င်းသည် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုဖော်ထုတ်ရန်အကောင်းဆုံးဂန္ထဝင်နည်းဖြစ်ပြီး၎င်းသည်ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုရှာဖွေရန်အတွက်ရွှေစံဖြစ်သည်။ dideoxy အစီအစဉ်၏အခြေခံအပေါ်အခြေခံပြီးတိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်းအများဆုံးအလိုလိုအခြေစိုက်စခန်းအထွတ်အထိပ်မြေပုံ၏ပုံစံအတွက်ဗီဇ sequence ကို၏ပြောင်းလဲမှုကိုပြသနိုင်ပါတယ်။ Detection type သည်ပိုမိုကျယ်ပြန့်ပြီး၎င်းသည်အစောဆုံးအသုံးပြုသော mutation detection method လည်းဖြစ်သည်။ မျိုးဆက်သစ်အစီအစဉ်ပလက်ဖောင်းများပေါ်ပေါက်လာသော်လည်းပြည်တွင်းနှင့်ပြည်ပမှပညာရှင်များသည်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်၏ရလဒ်များကိုနည်းစနစ်အသစ်၏ယုံကြည်စိတ်ချရမှုကိုတိုင်းတာရန်နှင့်ဆုံးဖြတ်ရန်အတိုင်းအတာတစ်ခုအဖြစ်အသုံးပြုဆဲဖြစ်သည်။ Gao Jing et al ။ အူမကြီးကင်ဆာနှင့်အတူလူနာ 966 အတွက် KRAS နှင့် BRAF ဗီဇဗီဇပြောင်းလဲမှုတွေ၏ရှာဖွေတွေ့ရှိရန်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်လျှောက်ထားခဲ့သည်။ ၎င်းသည်စာပေတွင်ဖော်ပြထားသည့်အကြီးဆုံးပြည်တွင်းနမူနာနှင့် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းလည်းဖြစ်သည်။ လင် Yun နှင့်အခြားသူများကမူတိုက်ရိုက်အစီအစဉ်သည်နည်းလမ်းသည်မျိုးဗီဇတစ်ခုစီ၏ mutation status ကိုနားလည်ရန်အတွက်တိုက်ရိုက်နှင့်ထိရောက်သောထောက်လှမ်းသည့်နည်းလမ်းဖြစ်သည်၊ အထူးသဖြင့်မသိသောဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုရှာဖွေရန်ဖြစ်သည်။ ဤနည်းလမ်း၏ sensitivity သည်အတော်အတန်နည်းသော်လည်းအကျိတ်ဆဲလ်များကိုပိုမိုကောင်းမွန်အောင် microdissection ကဲ့သို့သောနည်းလမ်းများဖြင့်တိုးတက်နိုင်သည်။ အခြားအစီအစဉ်များအတွက်ပိုမိုကြီးမားသောနမူနာအရွယ်အစားများကို KRAS ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းအတွက်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်းကိုလည်းအသုံးပြုခဲ့သည်။ သို့သော်အနိမ့် sensitivity သည်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်၏အကြီးမားဆုံးအားနည်းချက်ဖြစ်သည်။ တရုတ်နိုင်ငံတွင်တင်ပြသောရလဒ်များအရတိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ဖြင့် mutation detection rate သည်မနိမ့်ကျပါ။ လျူ Xiaojing et al ။ တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နှင့် peptide nukleic acid clamp PCR (PNA-PCR) နှိုင်းယှဉ်ခြင်းနှင့် KRAS ဗီဇဗီဇပြောင်းလဲခြင်း၏ 43 ဖြစ်ပွားမှုကိုတိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ဖြင့်ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤပြောင်းလဲမှုအပြင် PNA-PCR ကိုလည်းတိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ဖြင့်ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။ ရိုင်းအမျိုးအစားတွင်ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းဆယ်မျိုးတွေ့ရှိရပြီး PCR မှလူနာများကိုဆုံးဖြတ်ရန်နှင့် Mutant လူနာများကိုဆုံးဖြတ်ရန်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ကိုအကြံပြုခဲ့သည်။ Qiu Tian et al ။ fluorescent PCR-optimized oligonucleotide စုံစမ်းခြင်းနည်းလမ်းနှင့်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်းအားဖြင့် 131 အူမကင်ဆာနမူနာကိုရှာဖွေတွေ့ရှိနှင့် KRAS ဗီဇဗီဇပြောင်းလဲမှုတွေ၏အပြုသဘောဆောင်သောနှုန်းထားများ 41.2% (54/131) နှင့် 40.5% (53/131) ရှိကြ၏။ Bai Dongyu သည်မတူညီသောနည်းလမ်းများ၏ detectivity sensitivity ကိုလည်းဆွေးနွေးခဲ့သည်။ အူမကြီးကင်ဆာလူနာ ၂၀၀ တွင် ၆၃ ယောက်ကို RT-qPCR ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းဖြင့်ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး mutation detection detection 200%; 63 နမူနာကိုတိုက်ရိုက်အစီအစဉ် 31.5 ဆင့် mutation ထောက်လှမ်းမှုနှုန်း 169%, တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်အားဖြင့် sequenced ခဲ့ကြသည်။ တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်းသည် KRAS မျိုးဗီဇ mutation status ကိုတိကျစွာ၊ တိကျမှန်ကန်စွာတိကျစွာရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း၎င်း၏လိုအပ်ချက်များမှာမြင့်မားသောနည်းပညာလိုအပ်ချက်များ၊ ရှုပ်ထွေးသောစစ်ဆင်ရေးလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများ၊ ကူးစက်လွယ်သောကူးစက်ရောဂါကိုဖြစ်ပေါ်စေသည့်အပြင်အချိန်ကုန်ခြင်းနှင့်ကြိုးစားအားထုတ်မှုဆိုင်ရာရလဒ်များကိုလည်းဖော်ပြသည်။ သိသာတဲ့။ များသောအားဖြင့်အစီအစဉ်ဆိုင်ရာကိရိယာများမရှိပါ။ အချိန်ကြာမြင့်စွာကုန်ကျပြီးမြင့်မားသောကုန်ကျစရိတ်များသည့်စမ်းသပ်မှုအတွက်သက်ဆိုင်ရာကုမ္ပဏီသို့နမူနာပို့ရန်လိုသည်။
Pyrosequencing နည်းလမ်း:
Pyrosequencing နည်းလမ်းသည် KRAS မျိုးဗီဇ mutation detect အတွက် sequencing sensitivity, detect ကုန်ကျစရိတ်နှင့်အစီရင်ခံရန်အချိန်အတွက်ပိုမိုလွယ်ကူသောနည်းလမ်းဖြစ်သည်။ ဒီနည်းလမ်း၏ပြန်လုပ်သာ။ ကောင်း၏။ ရရှိသောအထင်ကရမြေပုံအရအချို့သော site တစ်ခု၏ mutation frequency နှင့်အရေအတွက်ကွဲပြားခြားနားသော site များ၏ mutation frequency အကြားနှိုင်းယှဉ်ချက်ကိုကြည့်လျှင်ရှင်းသည်။ မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်း Ogino et al ။ , Hutchins et al ။ အူမကြီးကင်ဆာအမြောက်အများနှင့်အတူလူနာများတွင် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုစမ်းသပ်ရန် pyrosequencing နည်းပညာကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ရလဒ်များအရ pyrosequencing နည်းပညာသည်လူနာများကိုပစ်မှတ်ထားသောကုထုံးအတွက်စစ်ဆေးရန်အတွက်အစွမ်းထက်သောကိရိယာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်းညွှန်ပြသည်။ အကျိတ်မော်လီကျူးရောဂါတွင်ကျယ်ပြန့်စွာအသုံးပြုခြင်းအလားအလာရှိသည်။ ပြည်တွင်းပညာရှင်များသည်အူမကြီးကင်ဆာတွင် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုလက်တွေ့ကျသောတိကျမှန်ကန်မှုနှင့်ယုံကြည်စိတ်ချရမှုအားစစ်ဆေးရန် pyrosequencing နည်းပညာကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ဒီနည်းလမ်းကိုပိုမိုတိကျတဲ့နှင့်ပိုမိုမြင့်မား sensitivity ကိုရှိပါတယ်။ SundstrÖm et al ။ လက်တွေ့အသုံးချမှုများတွင် allelic-specific PCR နှင့် pyrosequencing နှိုင်းယှဉ်ခြင်းနှင့်အူမကင်ဆာလူနာများအတွက် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်း၏ဖြစ်ရပ် ၃၁၄ ခုတွင် pyrosequencing ၏တိကျမှုသည် alleles များထက်များစွာသာလွန်ကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့သည်။ PCR နှင့်အကျိတ်ဆဲလ်ပါဝင်မှုနိမ့်ကျသောတစ်ရှူးများကိုကောင်းမွန်စွာသိရှိနိုင်သည်။ အကျိတ်ဆဲလ်များ၏အချိုးအစား 314% မှ 1.25% မှေး။ Pyrosequencing ဆဲ mutation အချက်ပြ detect နိုင်ပါတယ်။ Sanger အစီအစဉ်ဖြင့်တွေ့ရှိရန် Mutant alleles များ၏အနည်းဆုံးပါဝင်မှုသည် ၂၀% သို့ရောက်ရန်လိုအပ်လျှင်၎င်းသည် ၁၀% သို့ရောက်သောအခါ၎င်းသည် HRM နည်းလမ်းဖြင့်ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်။ pyrosequencing အတွက်သာဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကို ၅% တွေ့ရှိနိုင်သည်။ Alleles ။ ကျနော်တို့ pyrosequencing ကိုသုံးပြီးအူမကင်ဆာရှိသူလူနာ ၇၁၇ ယောက်မှာ KRAS ဗီဇပြောင်းလဲမှုကိုတွေ့ရှိခဲ့ပြီး KRAS ဗီဇပြောင်းလဲမှုအကြိမ်ရေ ၄၀.၉% ရှိခဲ့တယ်။ codon 2.5 ၏ mutation မှုနှုန်း 20%, codon 10 ၏ mutation မှုနှုန်း 5% နှင့် codon 717 ၏ mutation မှုနှုန်း 40.9 12% ရှိခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည်စမ်းသပ်မှုမပြုလုပ်မီလက်ကို microdissection ဖြင့်ပိုမိုမြင့်မားသောအကျိတ်ပါဝင်သောတစ်ရှူးများကိုပိုမိုကောင်းမွန်စေပြီးရလဒ်များကို ပို၍ ယုံကြည်စိတ်ချရစေသည်။ အဆိုပါနည်းလမ်းသည်ကောင်းသော sensitivity နှင့်တိကျသောရှိပြီးလက်တွေ့လက်တွေ့တွင်ဖွံ့ဖြိုးရန်လွယ်ကူသည်။ pyrosequencing ၏အားနည်းချက်ကိုရှာဖွေတွေ့ရှိရန်ကုန်ကျစရိတ်မြင့်မားသည်, နမူနာအစီအစဉ်များအတွက် Single- သောင်တင် DNA ကိုပြင်ဆင်၏ဖြစ်စဉ်ကိုခက်ခဲသည်။ အနာဂတ်တွင် pyrosequencing သည်လုပ်ငန်းလည်ပတ်မှုကိုများစွာရိုးရှင်းစေမည့် double-strand PCR ထုတ်ကုန်များကိုတိုက်ရိုက်ရှာဖွေတွေ့ရှိရန်နည်းပညာဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက်မြှုပ်နှံနိုင်သည်။ လက်တွေ့စမ်းသပ်မှု၏ပြည့်စုံသောမြှင့်တင်ရေးအောင်မြင်ရန်အစီအစဉ်၏ကုန်ကျစရိတ်ကိုထိရောက်စွာလျှော့ချပါ။
၃။ ARMS နည်းလမ်း
ဒီနည်းပညာကမျိုးရိုးဗီဇနှင့် Mutant genes တို့ကိုခွဲခြားရန် primer များကိုသုံးသည်
ich သည် ၁၉၈၀ ပြည့်လွန်နှစ်များကတည်းကဖော်ပြခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်း၏အကြီးမားဆုံးအားသာချက်မှာ၎င်းသည် sensitivity အထိ ၁.၀% အထိရှိပြီးနမူနာများတွင် mutant genes များကို ၁.၀% အထိနိမ့်ကျစေနိုင်သည်။ ဒီဇိုင်းတွင်ပစ်မှတ်ထုတ်ကုန်၏အရှည်ကိုအကြီးမားဆုံးအတိုင်းအတာအထိတိုစေနိုင်သည်၊ ပါဖင်ပါဝင်သောတစ်သျှူးနမူနာမှထုတ်ယူသောဒီအဲန်အေ၏အစိတ်အပိုင်းအများစုမှာကွဲလွဲနေသောကြောင့်တိကျသောစစ်ဆေးတွေ့ရှိမှုရလဒ်များကိုမရရှိနိုင်ပါ။ ဤနည်းပညာသည်ချဲ့စက်စဉ်အတွင်းတံခါးပိတ်လည်ပတ်မှုရရှိရန်အတွက်အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR ပလက်ဖောင်းကိုပေါင်းစပ်ထားသည်။ အဆိုပါစစ်ဆင်ရေးရိုးရှင်းပြီးအကြီးမြတ်ဆုံးအတိုင်းအတာအထိ amplified ထုတ်ကုန်များညစ်ညမ်းမှုကိုရှောင်ရှားနိုင်သည့်ထုတ်ကုန်၏ Post- အပြောင်းအလဲနဲ့မလိုအပ်ပါဘူး။ ယခုလက်ရှိတွင် Scorpion-ARMS နည်းလမ်းနှင့် amplification block mutation စနစ်ကိုပေါင်းစပ်ပြီးကမ္ဘာတွင်ပိုမိုအသုံးပြုသည်။ နည်းပညာနှစ်ခုကိုပေါင်းစပ်လိုက်ခြင်းကြောင့်နှစ်ဖက်စလုံး၏ထိခိုက်လွယ်မှုနှင့်တိကျမှုတို့ကိုမြင့်မားစေသည်။ Gao Jie et al ။ အူမကြီးကင်ဆာရှိသည့်လူနာ ၁၆၇ ဦး တွင် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းအခြေအနေကိုဤနည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ဤနည်းလမ်းသည်ယုံကြည်စိတ်ချရပြီးတိကျကြောင်းဖော်ပြသည်။ ဝမ်ဟွိုင်း et al ။ formaldehyde-fixed နှင့် paraffin-embedded တစ်ရှူးများ 1980 ကိစ္စများတွင် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုရှာဖွေရန် ARMS ကိုလည်းအသုံးပြုခဲ့သည်။ ယူနိုက်တက်စတိတ်တွင်၊ COBAS ကိရိယာ (Roche) သည် KRAS ၏လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုအတွက် FDA ကအတည်ပြုခဲ့ပြီး Therascreen RGQ ကိရိယာ (Qiagen) ကိုဥရောပသမဂ္ဂ Vitro Diagnostics (CE-IVD) မှအသိအမှတ်ပြုထားသော ARMS နိယာမကိုအသုံးပြုသည်။ အသုံးများသောနည်းလမ်းများအနက် ARMS နည်းလမ်းသည်အထိခိုက်မခံဆုံးဖြစ်ပြီးကုန်ကျစရိတ်မှာအတော်အတန်ကျိုးကြောင်းဆီလျော်သည်။ ထို့ကြောင့်ပြည်တွင်းနှင့်ပြည်ပရှိ KRAS မျိုးဗီဇများကိုလက်တွေ့ရှာဖွေတွေ့ရှိမှု၏အများစုမှာ ARMS နည်းလမ်းကိုအသုံးပြုနေသည်။ သို့သော်ထိုနည်းလမ်းသည် PCR နည်းပညာကိုအခြေခံထားသဖြင့်၎င်းသည်အားနည်းချက်မှာ၎င်းကိုလူသိများသော site mutations ကိုသာတွေ့ရှိနိုင်သည်။
၄။ Real-time ချောင်းအရေအတွက် PCR နည်းလမ်း။
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
၅။ HRM နည်းလမ်း
၎င်းသည်မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်းပိုမိုကျယ်ပြန့်စွာအသုံးပြုသောမျိုးရိုးဗီဇရှာဖွေတွေ့ရှိနည်းဖြစ်သည်။ ၎င်းသည်ညစ်ညမ်းမှုကိုရှောင်ရှားရန်ရိုးရှင်းမြန်ဆန်သောထိခိုက်လွယ်မှုနှင့်တစ်ခုတည်းသောပြွန်၏အားသာချက်များရှိသည်။ လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများတွင်၎င်းကိုအသုံးပြုရန်ဖြစ်နိုင်ချေကိုလေ့လာနိုင်ရန် Liu Liqin နှင့်အခြားသူများသည်အူမကင်ဆာရှိသည့်လူနာ ၆၄ ဦး တွင် KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုသိရှိရန် HRM နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ရလဒ်များကိုအတည်ပြုရန်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ HRM နှင့်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်၏ရလဒ်များမှာတသမတ်တည်းဖြစ်သည်။ တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်များနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက HRM မှ KRAS ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းသည်ရိုးရှင်းပြီးတိကျသည်၊ ၎င်းသည်လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများအတွက်သင့်တော်သောယုံကြည်စိတ်ချရသောနည်းလမ်းဖြစ်သည်။ Chen Zhihong et al သူတို့ရဲ့ sensitivity ကိုအကဲဖြတ်ရန် KRAS Mutant plasmids ၏ကွဲပြားခြားနားသောအချိုးအစားများပါဝင်သည်ရောထွေးနမူနာတစ်စီးရီးကိုစမ်းသပ်ဖို့ HRM နည်းလမ်းကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ဒါဟာရောထွေးနမူနာများတွင် plasmid ဗီဇပြောင်းလဲမှုတွေ၏အချိုးအစား 64% နှင့် sensitivity ကို 10% ရောက်ရှိခဲ့ကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့သည်။ နောက်ပိုင်းတွင်, ဒီနည်းလမ်းကိုအူမကင်ဆာတစ်ရှူးနမူနာ 10 KRAS ဗီဇဗီဇပြောင်းလဲမှုတွေ detect လုပ်ဖို့အသုံးပြုခဲ့သည်။ တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်နည်းလမ်းနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက HRM နည်းလမ်း၏ sensitivity ကို ၁၀၀%၊ သတ်သတ်မှတ်မှတ် 60% (100/96) ရှိသည်။ အဆိုပါ HRM နည်းလမ်း၏အားနည်းချက်ကတိကျစွာ mutation အမျိုးအစားတိကျစွာနှင့်မဖြစ်နိုင်ပါသော codon mutated ဖြစ်ပါတယ်မဖြစ်နိုင်သောကွောငျ့ဖွစျသညျ။ အကယ်၍ ပုံမှန်မဟုတ်သောအရည်ပျော်မှုအရည်ပျော်မျဉ်းကိုတွေ့ရှိပါကဗီဇပြောင်းလဲခြင်းအမျိုးအစားကိုဆုံးဖြတ်ရန်အစီအစဉ်ကိုလိုအပ်သည်။ Harléသုတေသနအဖွဲ့သည်အူမကြီးကင်ဆာတစ်သျှူး ၁၆၆ ခုကို fluorescent PCR, ARMS နှင့် HRM နည်းလမ်းများကိုနှိုင်းယှဉ်ရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။ ရလဒ်သုံးနည်းလမ်းများလက်တွေ့စမ်းသပ်မှုများအတွက်သင့်လျော်သောဖြစ်သော်လည်း HRM ၏ယုံကြည်စိတ်ချရသည်အခြားနည်းလမ်းနှစ်ခုကဲ့သို့ကောင်းသောမဟုတ်ကြောင်းအကြံပြုအပ်ပါသည်။
၆ ။
အထက်ဖော်ပြပါနည်းစနစ်များအပြင်အခြားရှာဖွေတွေ့ရှိနည်းများသည် PCR-SSCP၊ မြင့်မားသောစွမ်းဆောင်ရည်အရည် Chromatography၊ fluorescent PCR-optimized oligonucleotide probe method၊ nested PCR နှင့် ARMS ပေါင်းစပ်မှုနည်းလမ်း၊ COLD-PCR စသည့်အသုံးချခြင်းများတွင်၎င်းတို့၏အားသာချက်များနှင့်အားနည်းချက်များရှိသည်။ မြင့်မားသောစွမ်းဆောင်ရည်အရည် Chromatography သည်တိကျသောသတ်သတ်မှတ်မှတ်ရှိသော်လည်းနမူနာများအတွက် ၀ ယ်လိုအားမှာကြီးမားသည်။ PCR-SSCP သည်ကုန်ကျစရိတ်သက်သာပြီးချွေတာသော်လည်း၎င်းသည်ရှုပ်ထွေးသည်။ fluorescent PCR အပေါ် အခြေခံ၍ mutation detection နည်းပညာသည်တိကျသောတိကျမှု၊ မြင့်မားသော sensitivity နှင့်တိကျသောအရေအတွက်၊ လွယ်ကူစွာလည်ပတ်မှု၊ အပြည့်အဝပိတ်ဆို့ခြင်းတုံ့ပြန်မှုနှင့်အခြားအားသာချက်များရှိသည်။ သို့သော်အားလုံးသည်သိသာသော mutation type နှင့်အညီ primer များနှင့်စုံစမ်းမှုများကိုဒီဇိုင်းပြုလုပ်ရန်လိုအပ်သည်။ ရှာဖွေတွေ့ရှိအပေါင်းတို့နှင့်ဖြစ်နိုင်သမျှဗီဇပြောင်းလဲမှုတွေရှာဖွေတွေ့ရှိမရနိုင်ပါ။
3 ။ အကျဉ်းချုပ်
အချုပ်အားဖြင့်ကွဲပြားခြားနားသောဓာတ်ခွဲခန်းများတွင် mutation sites များနှင့် detect လုပ်ခြင်းနည်းလမ်းများသည်တူညီမှုမရှိသောကြောင့်အကျိတ်နမူနာအရွယ်အစားနှင့် DNA ထုတ်ယူမှုအရည်အသွေးသည်မညီမညာဖြစ်နေသောကြောင့်ဓာတ်ခွဲခန်းများကွာခြားချက်များ၊ စံသတ်မှတ်ချက်အကြားကြီးမားသောသို့မဟုတ်သေးငယ်သောစမ်းသပ်ရလဒ်များရှိခြင်းကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။ KRAS ဗီဇ mutation detection ၏အမျိုးမျိုးသောနိုင်ငံများရှိစိုးရိမ်ပူပန်တဲ့လက်တွေ့ရှာဖွေရေးပြissueနာဖြစ်လာသည်။ လက်ရှိ KRAS ဗီဇတွင်ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းကိုရှာဖွေရန်နည်းလမ်းများစွာရှိသည်။ မြင့်မားခြင်းမှအနိမ့်ကျသည်အထိ sensitivity သည် ARMS၊ pyrosequencing, HRM, real-time အရေအတွက် PCR နှင့်တိုက်ရိုက်အစီအစဉ်ဖြစ်သည်။ လက်တွေ့ဖြစ်ရပ်မှန်မှကြည့်လျှင်ထိခိုက်လွယ်မှုနိမ့်သည်ဆေးကုသမှုအတွက်အထောက်အကူပြုမည်မဟုတ်သော်လည်းအလွန်ထိလွယ်သောနည်းလမ်းများသည်ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုအားတိကျစွာကျဆင်းစေပြီးမလိုအပ်သောမှားယွင်းသောအပြုသဘောဆောင်သောရလဒ်များပေါ်ပေါက်လာပြီးလူနာ၏နောက်ဆက်တွဲဆေးဝါးကုသမှုကိုအကျိုးသက်ရောက်နိုင်သည်။ အထက်ဖော်ပြပါအချက်များနှင့် ပတ်သက်၍ FDA ကအတည်ပြုထားသောနည်းလမ်းနှင့်ပေါင်းစပ်။ ARMS နည်းလမ်းကိုအကြံပြုသည်။ ဟုတ်ပါတယ်, စျေးကွက်ရှုထောင့်ကနေ, မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးငါ့ကိုအလေးပေးသင့်ပါဘူး
ဒါပေမယ့် နောက်ဆုံးမှန်ကန်တဲ့ရလဒ်တွေကို အာရုံစိုက်ပါ။ ကွဲပြားခြားနားသောဓာတ်ခွဲခန်းများသည် ပကတိအခြေအနေအရ သင့်လျော်သောစမ်းသပ်မှုနည်းလမ်းများကို ချမှတ်နိုင်သော်လည်း ၎င်းတို့တွင် အော်ပရေတာအရည်အချင်းများနှင့် စက်တွင်းအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုစနစ်များ ကောင်းမွန်မှုရှိမှသာ၊ လက်ရှိပြည်တွင်းဓာတ်ခွဲခန်းပတ်ဝန်းကျင်အခြေအနေများအောက်တွင်၊ ယုံကြည်စိတ်ချရသောဓာတ်ခွဲခန်းစမ်းသပ်မှုအရည်အသွေးကိုသေချာစေရန်အတွက် စံချိန်စံညွှန်းမီ PCR ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် စမ်းသပ်လုပ်ဆောင်ရန်နှင့် ပြည်တွင်းနှင့် နိုင်ငံတကာအခန်းအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုလုပ်ငန်းများတွင် ပါဝင်ဆောင်ရွက်ရန်လိုအပ်ပါသည်။ စဉ်ဆက်မပြတ်ရလဒ်များကိုသေချာစေရန် Standardized Management သည် လိုအပ်သောအခြေအနေတစ်ခုဖြစ်သည်။ တရုတ်နိုင်ငံတွင်၊ KRAS ဗီဇ၏လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုကို ပေါင်းစပ်ပြီး စံချိန်စံညွှန်းသတ်မှတ်ရန် အရေးတကြီးလိုအပ်နေပြီး မတူညီသောလိုအပ်ချက်များနှင့်အညီ စံချိန်စံညွှန်းသတ်မှတ်ထားသော စံပြုစမ်းသပ်မှုပရိုဂရမ်ကို ထုတ်လုပ်ရန်နှင့် ဤပရိုဂရမ်ကို BRAF၊ PIK23450_3CA၊ EGFR နှင့် အခြားမျိုးဗီဇများကို စမ်းသပ်စစ်ဆေးခြင်းသို့ တိုးချဲ့နိုင်သည်။
