Targeting drugs such as cetuximab and panitumumab have been widely used in clinic as effective therapeutic drugs for colorectal cancer. Clinical data show that patients with KRAS mutations have no significant effect on this monoclonal antibody drug, and only wild-type patients can benefit from it. Therefore, the KRAS gene mutation status is clinically regarded as an important therapeutic marker, which has a strong correlation with the prognosis and treatment effect of colorectal cancer. The 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Colorectal Cancer Clinical Practice Guidelines stipulates that all patients with metastatic colorectal cancer must detect KRAS gene mutation status, and only KRAS wild type is recommended to receive EGFR targeted therapy. In the same year, the American Society of Clinical Oncology (ASCO) also issued the same clinical treatment recommendations as a molecular marker for tumor targeted therapy, which shows its important guiding significance. At present, KRAS genetic testing has been widely carried out clinically. We mainly evaluate the domestic KRAS gene mutation detection methods for reference in clinical selection.
1. Il tasso positivo di mutazione del gene KRAS nel cancro del colon-retto
Nel cancro del colon-retto, il tasso di mutazione del gene KRAS va dal 35% al 45% e il sito di mutazione ad alto rischio è rappresentato dai codoni 12 e 13 sull'esone 2, e ce ne sono ancora di rari come 61 e 146. Mutazione luogo. Esistono molti metodi di rilevamento per le mutazioni del gene KRAS, tra cui sequenziamento diretto, analisi della curva di fusione ad alta risoluzione (HRM), pirosequenziamento, PCR quantitativa, sistema di blocco di amplificazione della mutazione (amplinc atio) sistema di mutazione refrattaria (ARMS), polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), analisi del polimorfismo di conformazione a filamento singolo della reazione a catena della polimerasi (PCR-polimorfismo di confomazione a singolo filamento (PCR-SSCP), co-amplificazione a temperatura di denaturazione inferiore PCR (COLD-PCR) e analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni, ecc.
2. Valutazione dei metodi di rilevamento della mutazione KRAS
1. Metodo di sequenziamento diretto: è il metodo più classico per rilevare le mutazioni del gene KRAS ed è anche il gold standard per rilevare le mutazioni geniche. Il metodo di sequenziamento diretto basato sul principio del sequenziamento dideoxy può mostrare in modo più intuitivo il cambiamento della sequenza genica sotto forma di mappa del picco di base. Il tipo di rilevamento è più completo ed è anche il primo metodo di rilevamento delle mutazioni applicato. Nonostante l'emergere di piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, gli studiosi in patria e all'estero utilizzano ancora i risultati del sequenziamento diretto come scala per misurare e determinare l'affidabilità del nuovo metodo. Gao Jin et al. Sequenziamento diretto applicato alla rilevazione delle mutazioni del gene KRAS e BRAF in 966 pazienti con cancro del colon-retto. Questa è anche l'analisi della mutazione del gene KRAS con il più ampio campione domestico riportato in letteratura. Ling Yun e altri ritengono che il metodo di sequenziamento diretto sia il metodo di rilevamento più diretto ed efficace per comprendere lo stato di mutazione di ciascun gene, che può chiarire il tipo di mutazione, soprattutto per l'individuazione di mutazioni sconosciute. Sebbene la sensibilità di questo metodo sia relativamente bassa, può essere migliorata con metodi come la microdissezione per arricchire le cellule tumorali. Il metodo di sequenziamento diretto è stato applicato anche alla rilevazione KRAS di campioni di dimensioni maggiori in altri gruppi di ricerca nazionali. Tuttavia, una sensibilità inferiore è il più grande svantaggio del sequenziamento diretto. A giudicare dai risultati riportati in Cina, il tasso di rilevamento della mutazione mediante sequenziamento diretto non è basso. Liu Xiaojing et al. Confronto tra sequenziamento diretto e PCR con morsetto dell'acido nucleico peptidico (PNA-PCR) e si è riscontrato che 43 casi di mutazioni del gene KRAS sono stati rilevati mediante sequenziamento diretto. Oltre a queste mutazioni, è stata rilevata anche la PNA-PCR mediante sequenziamento diretto. Sono state trovate dieci mutazioni nel tipo selvatico e sono stati suggeriti per determinare i pazienti di tipo selvatico mediante PCR e il metodo di sequenziamento diretto per determinare i pazienti mutanti. Qi Tian et al. Sono stati rilevati 131 campioni di cancro del colon-retto mediante il metodo della sonda oligonucleotidica ottimizzata per PCR fluorescente e il metodo di sequenziamento diretto e le percentuali positive di mutazioni del gene KRAS sono state del 41.2% (54/131) e del 40.5% (53/131). Bai Dongyu ha anche discusso della sensibilità di rilevamento di diversi metodi. Dei 200 pazienti con cancro del colon-retto, 63 sono stati rilevati da mutazioni RT-qPCR e il tasso di rilevamento della mutazione è stato del 31.5%; 169 campioni sono stati sequenziati con successo mediante sequenziamento diretto di 50 casi di mutazione, tasso di rilevamento della mutazione 29.6%. Sebbene il metodo di sequenziamento diretto possa rilevare in modo accurato, oggettivo e specifico lo stato di mutazione del gene KRAS, anche i suoi difetti come gli elevati requisiti tecnici, le procedure operative complicate, la facile contaminazione incrociata e l'interpretazione laboriosa e dispendiosa in termini di tempo dei risultati sono molto ovvio. Spesso non ci sono apparecchiature di sequenziamento e il campione deve essere inviato all'azienda corrispondente per il test, il che richiede molto tempo e ha un costo elevato, quindi ha grandi limiti.
Metodo di pirosequenziamento:
Il metodo di pirosequenziamento è anche un metodo più conveniente per il rilevamento della mutazione del gene KRAS in termini di sensibilità del sequenziamento, costo di rilevamento e tempo per la segnalazione. La ripetibilità di questo metodo è migliore. Secondo la mappa dei picchi ottenuta Lo studio quantitativo della frequenza di mutazione di un certo sito e il confronto tra le frequenze di mutazione di diversi siti sono chiari a colpo d'occhio. Negli ultimi anni, Ogino et al., Hutchins et al. Hanno utilizzato la tecnologia del pirosequenziamento per testare le mutazioni KRAS in pazienti con grandi campioni di cancro del colon-retto. I risultati indicano che la tecnologia del pirosequenziamento è un potente strumento per lo screening dei pazienti per una terapia mirata. La diagnosi molecolare del tumore ha ampie prospettive di applicazione. Gli studiosi domestici hanno anche utilizzato la tecnologia del pirosequenziamento per rilevare clinicamente le mutazioni KRAS nel cancro del colon-retto, con buona precisione e affidabilità. Questo metodo ha una migliore specificità e una maggiore sensibilità. SundstrÖm et al. Confrontando la PCR allelico-specifica e il pirosequenziamento nelle applicazioni cliniche, è emerso che in 314 casi di mutazioni KRAS in pazienti con cancro del colon-retto, la specificità del pirosequenziamento era superiore a quella degli alleli. PCR e ha una buona sensibilità ai tessuti con un basso contenuto di cellule tumorali. Diluire la proporzione di cellule tumorali dall'1.25% al 2.5%. Il pirosequenziamento può ancora rilevare i segnali di mutazione. Quando il contenuto minimo di alleli mutanti nel campione deve raggiungere il 20% per essere rilevato dal sequenziamento di Sanger, può essere rilevato con il metodo HRM quando raggiunge il 10% e per il pirosequenziamento solo le mutazioni possono essere rilevate del 5%. Alleli. Abbiamo utilizzato il pirosequenziamento per rilevare le mutazioni di KRAS in 717 pazienti con cancro del colon-retto e abbiamo scoperto che la frequenza delle mutazioni di KRAS era del 40.9%. Il tasso di mutazione del codone 12 era del 30.1%, il tasso di mutazione del codone 13 era del 9.8% e il tasso di mutazione del codone 61 era dell'1.0%. Abbiamo arricchito i tessuti con un contenuto di tumore più elevato mediante microdissezione manuale prima del test, rendendo i risultati più affidabili. Il metodo ha una buona sensibilità e specificità ed è facile da sviluppare nella pratica clinica. Lo svantaggio del pirosequenziamento è l'alto costo del rilevamento e il processo di preparazione del DNA a filamento singolo per il sequenziamento dei campioni è macchinoso. In futuro, il pirosequenziamento può essere dedicato allo sviluppo della tecnologia per il rilevamento diretto di prodotti PCR a doppio filamento, il che semplificherà notevolmente l'operazione. E ridurre efficacemente il costo del sequenziamento per ottenere una promozione completa dei test clinici.
3. Metodo ARMS:
Questa tecnologia utilizza primer per distinguere tra geni wild-type e mutanti, wh
È stato segnalato già negli anni '1980. Il più grande vantaggio di questo metodo è che ha una sensibilità fino all'1.0% e può rilevare geni mutanti in campioni fino all'1.0%. Nella progettazione, la lunghezza del prodotto target può essere accorciata al massimo e il problema che non è possibile ottenere risultati di rilevamento accurati perché la maggior parte del DNA estratto dal campione di tessuto incluso in paraffina è frammentato. Questa tecnologia combina la piattaforma PCR in tempo reale per ottenere il funzionamento a provetta chiusa durante l'amplificazione. L'operazione è semplice e non necessita di post-lavorazione del prodotto, che può evitare al massimo la contaminazione del prodotto amplificato. Attualmente, il metodo scorpion-ARMS che combina la sonda dello scorpione e il sistema di mutazione del blocco di amplificazione è più comunemente usato nel mondo. La combinazione delle due tecnologie può massimizzare la sensibilità e la specificità di entrambe le parti. Gao Jie et al. Ha utilizzato questo metodo per rilevare lo stato di mutazione del gene KRAS in 167 pazienti con cancro del colon-retto, suggerendo che questo metodo è affidabile e accurato. Wang Hui et al. Inoltre ha utilizzato ARMS per rilevare mutazioni KRAS in 151 casi di tessuti fissati in formaldeide e inclusi in paraffina. Negli Stati Uniti, il kit COBAS (Roche) approvato dalla FDA per i test clinici di KRAS e il kit Therascreen RGQ (Qiagen) certificato dalla diagnostica in vitro dell'Unione europea (CE-IVD) utilizzano tutti il principio ARMS. Tra i metodi comuni, il metodo ARMS è il più sensibile e il costo è relativamente ragionevole. Pertanto, gran parte del rilevamento clinico dei geni KRAS in patria e all'estero utilizza il metodo ARMS, ma poiché il metodo è basato sulla tecnologia PCR, il suo difetto è che può essere rilevato solo mutazioni del sito note.
4. Metodo PCR quantitativo con fluorescenza in tempo reale:
It is a PCR-based detection method to determine the mutation by Ct value. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, accurate quantification, easy operation, and fully closed reaction. Many experimental groups have adopted this method for the detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Compared with the direct sequencing method, quantitative PCR occupies a greater advantage in sensitivity. Most scholars comparing the two methods believe that quantitative PCR is more sensitive. Liu Wei et al. Used two methods to make a detailed analysis of the detection results of 280 cases of colorectal cancer KRAS gene mutations, 94 cases of KRAS gene sequencing mutations, the positive rate was 33.57% (94/280), of which, real-time fluorescence quantitative PCR was positive 91 cases had a sensitivity of 96.8% (91/94). Of the 186 gene sequencing wild-type cases, 184 were negative by real-time quantitative PCR, with a specificity of 98.9% (184/186). The coincidence rate between real-time fluorescence quantitative PCR method and direct gene sequencing method was 98.2%. In the two detection methods, the positive and negative coincidence rates of each mutation site were above 90%, and the coincidence rate of four sites reached 100%. The detection results of the two methods were highly consistent, indicating fluorescent quantitative PCR It is a more reliable method for mutation detection. However, PCR-based methods need to design primers and probes based on known mutation types, so all possible mutations cannot be detected, and only specific sites can be detected. If a certain site is not included in the detection range of the kit, even if there is actually a mutation, the kit result is still negative. In addition, although the sensitivity of quantitative PCR is high, whether there are false positives still needs to be verified by DNA sequencing technology, or retrospective and prospective clinical experiments with large sample sizes to confirm the correlation between KRAS mutation status and the efficacy of targeted drugs . Therefore, the high sensitivity of mutation detection should not be pursued blindly, while the specificity and accuracy of detection should be ignored. Under different laboratory conditions, the optimal method for mutation detection in specimens may also be different. For specimens with a higher proportion of mutations, Sanger sequencing method has a higher accuracy in detecting gene mutations, while for specimens with a lower proportion of mutations, Sanger sequencing method False negatives may occur, and the detection method using fluorescent PCR as the technical platform can be characterized by high sensitivity.
5. Metodo HRM:
È uno dei metodi di rilevamento genico più comunemente utilizzati negli ultimi anni. Presenta i vantaggi di un tubo semplice, veloce, sensibile e singolo per evitare l'inquinamento. Al fine di esplorare la fattibilità del suo utilizzo nei test clinici, Liu Liqin e altri hanno utilizzato il metodo HRM per rilevare le mutazioni del gene KRAS in 64 pazienti con cancro del colon-retto, quindi hanno utilizzato il sequenziamento diretto per verificare i risultati. I risultati dell'HRM e del sequenziamento diretto sono risultati coerenti. Rispetto al sequenziamento diretto, il rilevamento delle mutazioni del gene KRAS mediante HRM è semplice e accurato, suggerendo che si tratta di un metodo affidabile adatto per i test clinici. Chen Zhihong et al. Ha utilizzato il metodo HRM per testare una serie di campioni misti contenenti diverse proporzioni di plasmidi mutanti KRAS per valutarne la sensibilità. Si è riscontrato che la proporzione di mutazioni plasmidiche nei campioni misti era del 10% e la sensibilità raggiungeva il 10%. Successivamente, il metodo è stato utilizzato per rilevare le mutazioni del gene KRAS in 60 campioni di tessuto di cancro del colon-retto. Rispetto al metodo di sequenziamento diretto, la sensibilità del metodo HRM era del 100% e la specificità era del 96% (43/45). Lo svantaggio del metodo HRM è che è impossibile fornire con precisione il tipo di mutazione specifico e quale codone è mutato. Se viene rilevata un'anomalia sulla curva di fusione, è necessario il metodo di sequenziamento per determinare il tipo di mutazione. Il gruppo di ricerca di Harlé ha utilizzato 156 casi di tessuto canceroso del colon-retto per confrontare i metodi fluorescenti PCR, ARMS e HRM. I risultati suggeriscono che, sebbene i tre metodi siano adatti per i test clinici, l'affidabilità della gestione delle risorse umane non è buona come gli altri due metodi.
6. Altri metodi:
Oltre ai metodi sopra menzionati, altri metodi di rilevamento hanno i loro vantaggi e svantaggi nell'applicazione, come PCR-SSCP, cromatografia liquida ad alte prestazioni, metodo della sonda oligonucleotidica ottimizzata per PCR fluorescente, metodo di combinazione PCR e ARMS annidati, PCR FREDDO metodo, ecc. La cromatografia liquida ad alte prestazioni ha una forte specificità, ma la richiesta di campioni è ampia; PCR-SSCP è a basso costo ed economico, ma l'operazione è complicata; la tecnologia di rilevamento delle mutazioni basata sulla PCR fluorescente ha una forte specificità, un'elevata sensibilità e un quantitativo accurato, funzionamento semplice, reazione completamente bloccata e altri vantaggi, ma tutti devono progettare primer e sonde in base al tipo di mutazione noto, quindi solo siti specifici possono essere rilevato e tutte le possibili mutazioni non possono essere rilevate.
3. Riassunto
In sintesi, poiché i siti di mutazione e i metodi di rilevamento nei diversi laboratori non sono uniformi, anche le dimensioni dei campioni di tumore analizzati e la qualità dell'estrazione del DNA non sono uniformi, determinando l'esistenza di risultati sperimentali grandi o piccoli tra i laboratori Differenze, la standardizzazione del rilevamento della mutazione del gene KRAS è diventato un problema di rilevamento clinico di preoccupazione in vari paesi. Al momento, esistono molti metodi per rilevare le mutazioni nel gene KRAS. La sensibilità da alta a bassa è ARMS, pirosequenziamento, HRM, PCR quantitativa in tempo reale e sequenziamento diretto. Dalla realtà clinica, una bassa sensibilità non è favorevole al trattamento clinico, ma metodi troppo sensibili faranno diminuire la specificità del rilevamento e potrebbero verificarsi risultati falsi positivi non necessari che influenzeranno il successivo regime terapeutico del paziente. Considerando gli aspetti di cui sopra, combinato con il metodo approvato dalla FDA, si consiglia il metodo ARMS. Ovviamente, dal punto di vista del mercato, la diagnostica molecolare non dovrebbe enfatizzarmi
metodi, ma concentrati sui risultati finali corretti. Diversi laboratori possono adottare metodi di prova appropriati in base alla situazione reale, ma solo se dispongono di buone qualifiche degli operatori e di sistemi di controllo qualità interni. Nelle attuali condizioni ambientali di laboratorio nazionali, è necessario eseguire i test in un laboratorio PCR standardizzato e partecipare alle attività di controllo della qualità inter-room nazionali e internazionali per garantire una qualità affidabile dei test di laboratorio. Una gestione standardizzata è una condizione necessaria per garantire risultati costanti. In Cina, vi è un urgente bisogno di unificare e standardizzare i test clinici del gene KRAS e di generare un programma di test standardizzato e standardizzato in base alle diverse esigenze, e questo programma può essere esteso al rilevamento di BRAF, PIK23450_3CA, EGFR e altri geni per promuovere i test di patologia molecolare clinica.
