داروهای هدفمند مانند cetuximab و panitumumab به طور گسترده در کلینیک به عنوان داروهای موثر درمانی برای سرطان روده بزرگ مورد استفاده قرار گرفته اند. داده‌های بالینی نشان می‌دهد که بیماران مبتلا به جهشهای KRAS تأثیر قابل‌توجهی بر روی این داروی آنتی‌بادی مونوکلونال ندارند و فقط بیماران نوع وحشی می‌توانند از آن بهره ببرند. بنابراین، وضعیت جهش ژن KRAS از نظر بالینی به عنوان یک نشانگر درمانی مهم در نظر گرفته می شود که ارتباط قوی با پیش آگهی و اثر درمانی سرطان کولورکتال دارد. راهنماهای عملکرد بالینی سرطان کولورکتال شبکه ملی جامع سرطان (NCCN) در سال 2009 تصریح می کند که همه بیماران مبتلا به سرطان متاستاتیک کولورکتال باید وضعیت جهش ژن KRAS را تشخیص دهند و فقط نوع وحشی KRAS برای دریافت درمان هدفمند EGFR توصیه می شود. در همان سال، انجمن انکولوژی بالینی آمریکا (ASCO) نیز همان توصیه‌های درمانی بالینی را به عنوان یک نشانگر مولکولی برای درمان هدفمند تومور صادر کرد که نشان‌دهنده اهمیت راهنمای مهم آن است. در حال حاضر، آزمایش ژنتیکی KRAS به طور گسترده به صورت بالینی انجام شده است. ما عمدتاً روشهای تشخیص جهش ژن KRAS داخلی را برای مرجع در انتخاب بالینی ارزیابی می‌کنیم.
1. میزان مثبت جهش ژن KRAS در سرطان روده بزرگ
در سرطان روده بزرگ ، میزان جهش ژن KRAS تا 35٪ تا 45٪ است و محل جهش پر خطر کدون های 12 و 13 روی اگزون 2 است و هنوز موارد نادری مانند 61 و 146 وجود دارد. سایت. روشهای تشخیصی بسیاری برای جهشهای ژنی KRAS وجود دارد ، از جمله تعیین توالی مستقیم ، تجزیه و تحلیل منحنی ذوب با وضوح بالا (HRM) ، پیروسوکینگ ، PCR کمی ، سیستم بلوک تقویت جهش (amplinc atio) سیستم تغییر نانوایی (ARMS) ، چند شکلی طول قطعه محدود (RFLP) تجزیه و تحلیل چندشکلی ترکیب زنجیره ای پلیمراز - تک رشته ای (چند شکلی ترکیب PCR - تک رشته ای (PCR-SSCP) ، تقویت همزمان در درجه حرارت دناتوراسیون پایین تر PCR (COLD-PCR) و تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ، و غیره)
2. ارزیابی روشهای تشخیص جهش KRAS
1. روش تعیین توالی مستقیم: این کلاسیک ترین روش برای تشخیص جهش های ژنی KRAS است و همچنین استاندارد طلایی برای تشخیص جهش های ژنی است. روش تعیین توالی مستقیم بر اساس اصل توالی دیدوکسی می تواند بصورت بصری بیشتر تغییر توالی ژن را به شکل نقشه اوج پایه نشان دهد. نوع تشخیص جامع تر است و همچنین اولین روش تشخیص جهش است. علی رغم ظهور سیستم عامل های تعیین توالی نسل جدید ، هنوز دانشمندان داخلی و خارجی از نتایج توالی مستقیم به عنوان مقیاسی برای اندازه گیری و تعیین قابلیت اطمینان روش جدید استفاده می کنند. گائو جینگ و همکاران توالی مستقیم اعمال شده برای تشخیص جهش های ژنی KRAS و BRAF در 966 بیمار مبتلا به سرطان روده بزرگ. این نیز تجزیه و تحلیل جهش ژنی KRAS با بزرگترین نمونه داخلی گزارش شده در منابع است. لینگ یون و دیگران معتقدند که روش تعیین توالی مستقیم ترین و موثرترین روش تشخیص برای درک وضعیت جهش هر ژن است ، که می تواند نوع جهش ، به ویژه برای کشف جهش های ناشناخته را روشن کند. اگرچه حساسیت این روش نسبتاً کم است ، اما با روشهایی مانند میکرودیسکتاسیون برای غنی سازی سلولهای توموری می توان آن را بهبود بخشید. روش تعیین توالی مستقیم نیز برای تشخیص KRAS اندازه نمونه های بزرگتر در سایر گروه های تحقیقاتی داخلی اعمال شده است. با این حال ، حساسیت کمتر بزرگترین عیب تعیین توالی مستقیم است. با توجه به نتایج گزارش شده در چین ، میزان تشخیص جهش با تعیین توالی مستقیم پایین نیست. لیو شیائوجینگ و همکاران مقایسه توالی مستقیم و گیره اسید نوکلئیک پپتید PCR (PNA-PCR) و دریافت که 43 مورد جهش ژنی KRAS با تعیین توالی مستقیم تشخیص داده شد. علاوه بر این جهش ها ، PNA-PCR با تعیین توالی مستقیم نیز تشخیص داده شد. ده جهش در نوع وحشی پیدا شد و پیشنهاداتی برای تعیین بیماران نوع وحشی با PCR و روش تعیین توالی مستقیم برای تعیین بیماران جهش یافته ارائه شد. کیو تیان و همکاران 131 نمونه سرطان روده بزرگ با استفاده از روش پروب اولیگونوکلئوتیدی بهینه شده با PCR و روش تعیین توالی مستقیم شناسایی شد و میزان مثبت جهش های ژنی KRAS 41.2٪ (54/131) و 40.5٪ (53/131) بود. بای دونگیو همچنین درباره حساسیت تشخیص روشهای مختلف بحث کرد. از 200 بیمار مبتلا به سرطان روده بزرگ ، 63 مورد با جهش RT-qPCR تشخیص داده شدند و میزان تشخیص جهش 31.5٪ بود. 169 نمونه با توالی مستقیم 50 مورد جهش ، میزان تشخیص جهش 29.6٪ توالی یابی شد. اگرچه روش تعیین توالی مستقیم می تواند وضعیت جهش ژن KRAS را به طور دقیق ، عینی و مشخص تشخیص دهد ، اما کاستی های آن از جمله نیازهای فنی بالا ، روش های عملیاتی پیچیده ، ایجاد آلودگی متقابل آسان و تفسیر وقت گیر و پر زحمت از نتایج نیز بسیار است واضح. غالباً تجهیزات تعیین توالی وجود ندارد و نمونه باید برای آزمایش به شرکت مربوطه ارسال شود ، که زمان زیادی طول می کشد و هزینه بالایی نیز دارد ، بنابراین محدودیت های زیادی دارد.
روش پیروسکوانسیون:
روش پیروسکوانسی همچنین از نظر حساسیت توالی ، هزینه تشخیص و زمان گزارش ، یک روش راحت تر برای تشخیص جهش ژنی KRAS است. تکرارپذیری این روش بهتر است. با توجه به نقشه اوج به دست آمده ، مطالعه کمی فرکانس جهش یک مکان خاص و مقایسه بین فرکانس های جهش مکان های مختلف در یک نگاه روشن است. در سالهای اخیر ، اوگینو و دیگران ، هاچینز و همکاران. برای آزمایش جهش های KRAS در بیماران با نمونه های بزرگ سرطان روده بزرگ ، از فن آوری پیروسکوانسی استفاده کرده اند. نتایج نشان می دهد که فن آوری پیروسکوانسیون ابزاری قدرتمند برای غربالگری بیماران برای درمان هدفمند است. تشخیص مولکولی تومور چشم انداز کاربرد گسترده ای دارد. دانشمندان داخلی نیز با دقت و اطمینان کافی از فناوری پیروسکوئنسی برای تشخیص بالینی جهش های KRAS در سرطان روده بزرگ استفاده کرده اند. این روش از ویژگی بهتر و حساسیت بالاتری برخوردار است. SundstrÖm و همکاران در مقایسه با PCR آللی و pyrosequening در كاربردهای بالینی و دریافت كه در 314 مورد جهش KRAS در بیماران مبتلا به سرطان روده بزرگ ، ویژگی پیروسكوئنسی نسبت به آلل ها برتر بود. PCR ، و حساسیت خوبی به بافتهایی با محتوای سلول تومور کم دارد. نسبت سلولهای تومور را به 1.25/2.5 تا 20/10 درصد رقیق کنید. توالی پیروز هنوز هم می تواند سیگنال های جهش را تشخیص دهد. وقتی حداقل محتوای آللهای جهش یافته در نمونه نیاز به 5٪ داشته باشد تا با تعیین توالی سنگر تشخیص داده شود ، می توان با رسیدن به 717٪ با روش HRM و برای تعیین توالی پیروز فقط 40.9٪ جهش ها را تشخیص داد. مشخصات. ما برای تعیین جهش KRAS در 12 بیمار مبتلا به سرطان روده بزرگ از پیروسکوانسی استفاده کردیم و دریافتیم که فراوانی جهش KRAS 30.1٪ است. نرخ جهش کدون 13 9.8٪ ، نرخ جهش کدون 61 1.0٪ و نرخ جهش کدون XNUMX XNUMX٪ بود. ما قبل از آزمایش ، با میکرودیسکتاسیون دستی ، بافتها را با محتوای تومور بالاتر غنی کردیم ، و نتایج را قابل اطمینان تر می کند. این روش از حساسیت و ویژگی خوبی برخوردار است و توسعه آن در عمل بالینی آسان است. از معایب پیروسکیوژنینگ هزینه بالای تشخیص است و روند تهیه DNA تک رشته ای برای تعیین توالی نمونه ها دست و پا گیر است. در آینده می توان پیروسکوانسیون را به توسعه فناوری تشخیص مستقیم محصولات PCR دو رشته ای اختصاص داد ، که این امر عملکرد را بسیار ساده می کند. و به طور م reduceثر هزینه توالی را برای دستیابی به ارتقا comprehensive جامع آزمایش بالینی کاهش می دهد.
3. روش ARMS:
این فناوری با استفاده از آغازگرها تفاوت بین ژنهای نوع وحشی و جهش یافته را تشخیص می دهد
ich از اوایل دهه 1980 گزارش شده است. بزرگترین مزیت این روش این است که حساسیت آن تا 1.0٪ است و می تواند ژنهای جهش یافته را در نمونه های پایین 1.0٪ تشخیص دهد. در طراحی ، طول محصول هدف را می توان تا حد زیادی کوتاه کرد ، و این مسئله که نتایج دقیق تشخیص را نمی توان بدست آورد ، زیرا بیشتر DNA استخراج شده از نمونه بافتی پارافین ، قطعه قطعه شده است. این فناوری برای دستیابی به عملکرد لوله بسته در حین تقویت ، سیستم عامل PCR را در زمان واقعی ترکیب می کند. این عمل ساده است و نیازی به پردازش پس از محصول ندارد ، که می تواند از آلودگی محصول تقویت شده تا حد زیادی جلوگیری کند. در حال حاضر ، روش عقرب-ARMS با ترکیب پروب عقرب و سیستم جهش بلوک تقویت ، بیشتر در جهان استفاده می شود. ترکیب این دو فناوری می تواند حساسیت و ویژگی هر دو طرف را به حداکثر برساند. گائو جی و همکاران از این روش برای تشخیص وضعیت جهش ژنی KRAS در 167 بیمار مبتلا به سرطان روده بزرگ استفاده شده است ، که نشان می دهد این روش قابل اعتماد و دقیق است. وانگ هوی و همکاران همچنین از ARMS برای شناسایی جهش های KRAS در 151 مورد از بافت های ثابت فرمالدئید و پارافین استفاده شده است. در ایالات متحده ، کیت COBAS (Roche) مورد تأیید FDA برای آزمایش بالینی KRAS و کیت Therascreen RGQ (Qiagen) دارای گواهی اتحادیه اروپا در آزمایشگاهی آزمایشگاهی (CE-IVD) همه از اصل ARMS استفاده می کنند. در میان روش های معمول ، روش ARMS حساس ترین است و هزینه آن نسبتاً مناسب است. بنابراین ، بخش عمده ای از تشخیص بالینی ژن های KRAS در داخل و خارج از کشور با استفاده از روش ARMS انجام می شود ، اما از آنجا که این روش مبتنی بر فناوری PCR است ، نقص آن این است که فقط می توان جهش های شناخته شده در سایت را تشخیص داد.
4. روش کمی PCR فلورسانس در زمان واقعی:
این یک روش تشخیص مبتنی بر PCR برای تعیین جهش با مقدار Ct است. این دارای مزایای ویژگی قوی، حساسیت بالا، کمی سازی دقیق، عملیات آسان و واکنش کاملا بسته است. بسیاری از گروه های تجربی این روش را برای تشخیص جهش های KRAS در سرطان کولورکتال اتخاذ کرده اند. در مقایسه با روش توالی یابی مستقیم، PCR کمی مزیت بیشتری در حساسیت دارد. اکثر محققانی که این دو روش را با هم مقایسه می کنند معتقدند که PCR کمی حساس تر است. لیو وی و همکاران از دو روش برای تجزیه و تحلیل دقیق نتایج تشخیص 280 مورد جهش ژن KRAS سرطان کولورکتال، 94 مورد جهش توالی ژن KRAS استفاده کرد که میزان مثبت آن 33.57٪ (94/280) بود که از این میان، فلورسانس در زمان واقعی کمی بود. PCR مثبت بود 91 مورد دارای حساسیت 96.8% (91/94) بودند. از 186 مورد توالی یابی ژن از نوع وحشی، 184 مورد با PCR کمی زمان واقعی منفی بودند، با ویژگی 98.9٪ (184/186). نرخ همزمانی بین روش Real-time فلورسانس کمی PCR و روش توالی یابی مستقیم ژن 98.2٪ بود. در دو روش تشخیص، میزان همزمانی مثبت و منفی هر محل جهش بالای 90 درصد بود و میزان همزمانی چهار محل به 100 درصد رسید. نتایج تشخیص دو روش بسیار سازگار بود، که نشان می‌دهد PCR کمی فلورسنت روش قابل اعتمادتری برای تشخیص جهش است. با این حال، روشهای مبتنی بر PCR نیاز به طراحی پرایمرها و پروب‌ها بر اساس انواع جهشهای شناخته شده دارند، بنابراین تمام جهشهای احتمالی قابل شناسایی نیستند و فقط مکان‌های خاصی قابل شناسایی هستند. اگر سایت خاصی در محدوده تشخیص کیت قرار نگیرد، حتی اگر واقعاً یک جهش وجود داشته باشد، نتیجه کیت همچنان منفی است. بعلاوه، اگرچه حساسیت PCR کمی بالا است، اما هنوز باید با فناوری توالی‌یابی DNA یا آزمایش‌های بالینی گذشته‌نگر و آینده‌نگر با اندازه‌های نمونه بزرگ برای تأیید همبستگی بین وضعیت جهش KRAS و اثربخشی هدف، تأیید شود که آیا مثبت کاذب وجود دارد یا خیر. مواد مخدر . بنابراین، حساسیت بالای تشخیص جهش را نباید کورکورانه دنبال کرد، در حالی که باید ویژگی و دقت تشخیص را نادیده گرفت. در شرایط آزمایشگاهی مختلف، روش بهینه برای تشخیص جهش در نمونه ها نیز ممکن است متفاوت باشد. برای نمونه هایی با نسبت جهش های بالاتر، روش توالی یابی سنگر دقت بالاتری در تشخیص جهش های ژنی دارد، در حالی که برای نمونه هایی با نسبت کمتر جهش، روش توالی یابی سنگر ممکن است منفی کاذب رخ دهد و روش تشخیص با استفاده از PCR فلورسنت به عنوان بستر فنی. را می توان با حساسیت بالا مشخص کرد.
5. روش HRM:
این یکی از متداول ترین روشهای تشخیص ژن در سالهای اخیر است. این دارای مزایای استفاده از لوله ساده ، سریع ، حساس و تک برای جلوگیری از آلودگی است. به منظور بررسی امکان استفاده از آن در آزمایش های بالینی ، لیو Liqin و دیگران از روش HRM برای شناسایی جهش های ژنی KRAS در 64 بیمار مبتلا به سرطان روده بزرگ استفاده کردند و سپس برای تأیید نتایج از توالی مستقیم استفاده کردند. نتایج HRM و توالی مستقیم ثابت شده است. در مقایسه با تعیین توالی مستقیم ، تشخیص جهش های ژنی KRAS توسط HRM ساده و دقیق است ، که نشان می دهد این یک روش قابل اعتماد و مناسب برای آزمایش بالینی است. چن ژیهونگ و همکاران از روش HRM برای آزمایش یک سری نمونه مخلوط حاوی نسبتهای مختلف پلاسمیدهای جهش یافته KRAS برای ارزیابی حساسیت آنها استفاده شده است. مشخص شد که نسبت جهش های پلاسمید در نمونه های مخلوط 10٪ است و حساسیت به 10٪ می رسد. پس از آن ، این روش برای شناسایی جهش های ژنی KRAS در 60 نمونه بافت سرطان روده بزرگ استفاده شد. در مقایسه با روش تعیین توالی مستقیم ، حساسیت روش HRM 100٪ و ویژگی آن 96٪ (43/45) بود. عیب روش HRM این است که تهیه دقیق نوع جهش خاص و کدونی که جهش یافته است غیرممکن است. اگر در منحنی ذوب ناهنجاری مشاهده شود ، برای تعیین نوع جهش به روش تعیین توالی نیاز است. گروه تحقیقاتی هارله از 156 مورد بافت سرطانی روده بزرگ برای مقایسه روشهای PCR ، ARMS و HRM فلورسنت استفاده کردند. نتایج نشان می دهد که اگرچه این سه روش برای آزمایش بالینی مناسب هستند ، اما قابلیت اطمینان HRM به خوبی دو روش دیگر نیست.
6. روش های دیگر:
علاوه بر روشهای فوق الذکر ، سایر روشهای تشخیص دارای مزایا و معایب خاص خود در کاربرد هستند ، مانند PCR-SSCP ، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ، روش کاوشگر الیگونوکلئوتید بهینه شده با PCR فلورسنت ، روش تو در تو PCR و ARMS ، COLD-PCR روش و غیره کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا دارای ویژگی قوی است ، اما تقاضا برای نمونه ها زیاد است. PCR-SSCP کم هزینه و مقرون به صرفه است ، اما عملیات پیچیده است. فناوری تشخیص جهش مبتنی بر PCR فلورسنت دارای ویژگی قوی ، حساسیت بالا و کمی دقیق ، عملکرد آسان ، واکنش کاملاً مسدود شده و سایر مزایا است ، اما همه نیاز به طراحی آغازگرها و کاوشگرها با توجه به نوع جهش شناخته شده دارند ، بنابراین فقط سایت های خاص می توانند شناسایی شده و کلیه جهش های احتمالی قابل تشخیص نیستند.
3. خلاصه
به طور خلاصه ، از آنجا که سایتهای جهش و روشهای تشخیص در آزمایشگاههای مختلف یکنواخت نیستند ، اندازه نمونه های تومور مورد تجزیه و تحلیل و کیفیت استخراج DNA نیز ناهموار است ، در نتیجه وجود نتایج بزرگ یا کوچک تجربی بین آزمایشگاه ها تفاوت ها ، استاندارد سازی شناسایی جهش ژنی KRAS به یک مسئله تشخیص بالینی در کشورهای مختلف تبدیل شده است. در حال حاضر ، روش های زیادی برای تشخیص جهش در ژن KRAS وجود دارد. حساسیت از بالا به پایین ARMS ، پیروسکوانسیون ، HRM ، PCR کمی در زمان واقعی و توالی مستقیم است. از واقعیت بالینی ، حساسیت کم برای درمان بالینی مناسب نیست ، اما روش های بسیار حساس باعث کاهش ویژگی تشخیص می شود ، و ممکن است نتایج مثبت کاذب غیرضروری روی رژیم دارویی بعدی بیمار تأثیر بگذارد. با توجه به جنبه های فوق ، همراه با روش تأیید شده توسط FDA ، روش ARMS توصیه می شود. البته ، از دیدگاه بازار ، تشخیص مولکولی نباید بر من تأکید کند
روش ها، اما روی نتایج صحیح نهایی تمرکز کنید. آزمایشگاههای مختلف می‌توانند روشهای آزمایش مناسب را با توجه به وضعیت واقعی اتخاذ کنند، اما تنها در صورتی که دارای صلاحیت اپراتور خوب و سیستم‌های کنترل کیفیت داخلی باشند. تحت شرایط محیطی آزمایشگاه داخلی فعلی، انجام آزمایش در یک آزمایشگاه استاندارد PCR و شرکت در فعالیت‌های کنترل کیفیت داخلی و بین‌المللی داخلی برای اطمینان از کیفیت تست آزمایشگاهی قابل اطمینان ضروری است. مدیریت استاندارد شرط لازم برای اطمینان از نتایج ثابت است. در چین نیاز مبرمی به یکسان سازی و استانداردسازی آزمایش بالینی ژن KRAS و ایجاد یک برنامه تست استاندارد و استاندارد شده با توجه به نیازهای مختلف وجود دارد و این برنامه می تواند به تشخیص BRAF، PIK23450_3CA، EGFR و ژن های دیگر برای ترویج تست پاتولوژی مولکولی بالینی.
