Los fármacos dirigidos como cetuximab y panitumumab se han utilizado ampliamente en la clínica como fármacos terapéuticos eficaces para el cáncer colorrectal. Los datos clínicos muestran que los pacientes con mutaciones de KRAS no tienen ningún efecto significativo sobre este fármaco de anticuerpo monoclonal, y sólo los pacientes de tipo salvaje pueden beneficiarse de él. Por lo tanto, el estado de mutación del gen KRAS se considera clínicamente un marcador terapéutico importante, que tiene una fuerte correlación con el pronóstico y el efecto del tratamiento del cáncer colorrectal. Las Pautas de práctica clínica del cáncer colorrectal de la Red Nacional Integral del Cáncer (NCCN) de 2009 estipulan que todos los pacientes con cáncer colorrectal metastásico deben detectar el estado de mutación del gen KRAS, y solo se recomienda el tipo salvaje KRAS para recibir terapia dirigida a EGFR. Ese mismo año, la Sociedad Estadounidense de Oncología Clínica (ASCO) también emitió las mismas recomendaciones de tratamiento clínico como marcador molecular para la terapia dirigida a tumores, lo que demuestra su importante importancia rectora. En la actualidad, las pruebas genéticas KRAS se han realizado ampliamente en la práctica clínica. Evaluamos principalmente los métodos nacionales de detección de mutaciones del gen KRAS como referencia en la selección clínica.
1. Tasa positiva de mutación del gen KRAS en el cáncer colorrectal
En el cáncer colorrectal, la tasa de mutación del gen KRAS es tan alta como del 35% al 45%, y el sitio de mutación de alto riesgo son los codones 12 y 13 en el exón 2, y todavía hay algunos raros como el 61 y el 146. Mutación sitio. Existen muchos métodos de detección de mutaciones del gen KRAS, que incluyen secuenciación directa, análisis de curva de fusión de alta resolución (HRM), pirosecuenciación, PCR cuantitativa, sistema de bloqueo de amplificación de mutaciones (amplificación), sistema de refractorimutación (ARMS), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), Análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple de reacción en cadena de la polimerasa (PCR-polimorfismo de confomación de cadena única (PCR-SSCP), co-amplificación a temperatura de desnaturalización más baja PCR (COLD-PCR) y análisis de cromatografía líquida de alta resolución, etc.
2. Evaluación de los métodos de detección de mutaciones de KRAS
1. Método de secuenciación directa: es el método más clásico para detectar mutaciones en el gen KRAS y también es el estándar de oro para detectar mutaciones en el gen. El método de secuenciación directa basado en el principio de secuenciación didesoxi puede mostrar de manera más intuitiva el cambio de secuencia de genes en forma de mapa de picos base. El tipo de detección es más completo y también es el método de detección de mutaciones aplicado más temprano. A pesar de la aparición de plataformas de secuenciación de nueva generación, los académicos nacionales y extranjeros todavía utilizan los resultados de la secuenciación directa como una escala para medir y determinar la confiabilidad del nuevo método. Gao Jing y col. Secuenciación directa aplicada a la detección de mutaciones en los genes KRAS y BRAF en 966 pacientes con cáncer colorrectal. Este es también el análisis de la mutación del gen KRAS con la muestra doméstica más grande reportada en la literatura. Ling Yun y otros creen que el método de secuenciación directa es el método de detección más directo y eficaz para comprender el estado de mutación de cada gen, lo que puede aclarar el tipo de mutación, especialmente para la detección de mutaciones desconocidas. Aunque la sensibilidad de este método es relativamente baja, se puede mejorar mediante métodos como la microdisección para enriquecer las células tumorales. El método de secuenciación directa también se ha aplicado a la detección KRAS de tamaños de muestra más grandes en otros grupos de investigación nacionales. Sin embargo, la menor sensibilidad es la mayor desventaja de la secuenciación directa. A juzgar por los resultados informados en China, la tasa de detección de mutaciones por secuenciación directa no es baja. Liu Xiaojing y col. Se comparó la secuenciación directa y la PCR de clamp de ácido nucleico peptídico (PNA-PCR) y se encontró que 43 casos de mutaciones del gen KRAS se detectaron mediante secuenciación directa. Además de estas mutaciones, también se detectó PNA-PCR mediante secuenciación directa. Se encontraron diez mutaciones en el tipo salvaje y se hicieron sugerencias para determinar los pacientes de tipo salvaje mediante PCR y el método de secuenciación directa para determinar los pacientes mutantes. Qiu Tian y col. Se detectaron 131 muestras de cáncer colorrectal mediante el método de sonda de oligonucleótidos optimizada por PCR fluorescente y el método de secuenciación directa, y las tasas positivas de mutaciones del gen KRAS fueron del 41.2% (54/131) y del 40.5% (53/131)). Bai Dongyu también habló sobre la sensibilidad de detección de diferentes métodos. De los 200 pacientes con cáncer colorrectal, 63 fueron detectados por mutaciones RT-qPCR y la tasa de detección de mutaciones fue del 31.5%; Se secuenciaron con éxito 169 muestras mediante secuenciación directa de 50 casos de mutación, tasa de detección de mutaciones del 29.6%. Aunque el método de secuenciación directa puede detectar de manera precisa, objetiva y específica el estado de mutación del gen KRAS, sus deficiencias, como los altos requisitos técnicos, los procedimientos operativos complicados, la fácil contaminación cruzada y la interpretación laboriosa y que requiere mucho tiempo de los resultados, también son muy importantes. obvio. A menudo no hay equipo de secuenciación, y la muestra debe enviarse a la empresa correspondiente para su análisis, lo que lleva mucho tiempo y tiene un alto costo, por lo que tiene grandes limitaciones.
Método de pirosecuenciación:
El método de pirosecuenciación también es un método más conveniente para la detección de mutaciones del gen KRAS en términos de sensibilidad de secuenciación, costo de detección y tiempo para informar. La repetibilidad de este método es mejor. Según el mapa de picos obtenido El estudio cuantitativo de la frecuencia de mutación de un determinado sitio y la comparación entre las frecuencias de mutación de diferentes sitios son claros de un vistazo. En los últimos años, Ogino et al., Hutchins et al. Han utilizado tecnología de pirosecuenciación para probar mutaciones de KRAS en pacientes con grandes muestras de cáncer colorrectal. Los resultados indican que la tecnología de pirosecuenciación es una herramienta poderosa para la detección de pacientes para terapia dirigida. El diagnóstico molecular de tumores tiene amplias perspectivas de aplicación. Los académicos nacionales también han utilizado la tecnología de pirosecuenciación para detectar clínicamente mutaciones de KRAS en el cáncer colorrectal, con buena precisión y confiabilidad. Este método tiene mejor especificidad y mayor sensibilidad. SundstrÖm y col. Se comparó la PCR específica alélica y la pirosecuenciación en aplicaciones clínicas y se encontró que en 314 casos de mutaciones de KRAS en pacientes con cáncer colorrectal, la especificidad de la pirosecuenciación fue superior a la de los alelos. PCR, y tiene buena sensibilidad a tejidos con bajo contenido de células tumorales. Diluir la proporción de células tumorales al 1.25% al 2.5%. La pirosecuenciación aún puede detectar señales de mutación. Cuando el contenido mínimo de alelos mutantes en la muestra debe alcanzar el 20% para ser detectado por secuenciación de Sanger, puede detectarse por el método HRM cuando alcanza el 10%, y para la pirosecuenciación solo las mutaciones pueden detectarse en un 5%. Alelos. Utilizamos pirosecuenciación para detectar mutaciones de KRAS en 717 pacientes con cáncer colorrectal y encontramos que la frecuencia de mutaciones de KRAS fue del 40.9%. La tasa de mutación del codón 12 fue del 30.1%, la tasa de mutación del codón 13 fue del 9.8% y la tasa de mutación del codón 61 fue del 1.0%. Enriquecimos los tejidos con mayor contenido tumoral mediante microdisección manual antes de la prueba, lo que hace que los resultados sean más confiables. El método tiene buena sensibilidad y especificidad y es fácil de desarrollar en la práctica clínica. La desventaja de la pirosecuenciación es el alto costo de detección y el proceso de preparación de ADN monocatenario para secuenciar muestras es engorroso. En el futuro, la pirosecuenciación se puede dedicar al desarrollo de tecnología para la detección directa de productos de PCR bicatenarios, lo que simplificará enormemente la operación. Y reduzca eficazmente el costo de la secuenciación para lograr una promoción integral de las pruebas clínicas.
3. Método ARMS:
Esta tecnología utiliza cebadores para distinguir entre genes mutantes y de tipo salvaje, WH
ich se ha informado ya en la década de 1980. La mayor ventaja de este método es que tiene una sensibilidad de hasta el 1.0% y puede detectar genes mutantes en muestras tan bajas como 1.0%. En el diseño, la longitud del producto objetivo se puede acortar en la mayor medida posible y el problema de que no se pueden obtener resultados de detección precisos porque la mayor parte del ADN extraído de la muestra de tejido incluida en parafina está fragmentada. Esta tecnología combina la plataforma de PCR en tiempo real para lograr un funcionamiento de tubo cerrado durante la amplificación. La operación es simple y no requiere post-procesamiento del producto, lo que puede evitar en la mayor medida la contaminación del producto amplificado. En la actualidad, el método scorpion-ARMS que combina la sonda del escorpión y el sistema de mutación por bloques de amplificación se utiliza con mayor frecuencia en el mundo. La combinación de las dos tecnologías puede maximizar la sensibilidad y la especificidad de ambos lados. Gao Jie y col. Usó este método para detectar el estado de mutación del gen KRAS en 167 pacientes con cáncer colorrectal, lo que sugiere que este método es confiable y preciso. Wang Hui y col. También se utilizó ARMS para detectar mutaciones de KRAS en 151 casos de tejidos fijados con formaldehído e incluidos en parafina. En los Estados Unidos, el kit COBAS (Roche) aprobado por la FDA para pruebas clínicas de KRAS y el kit Therascreen RGQ (Qiagen) certificado por el diagnóstico in vitro de la Unión Europea (CE-IVD) utilizan el principio ARMS. Entre los métodos comunes, el método ARMS es el más sensible y el costo es relativamente razonable. Por lo tanto, una gran parte de la detección clínica de genes KRAS en el país y en el extranjero se realiza mediante el método ARMS, pero debido a que el método se basa en la tecnología de PCR, su defecto es que solo se pueden detectar mutaciones de sitios conocidos.
4. Método de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real:
Es un método de detección basado en PCR para determinar la mutación por el valor de Ct. Tiene las ventajas de una fuerte especificidad, alta sensibilidad, cuantificación precisa, fácil operación y reacción completamente cerrada. Muchos grupos experimentales han adoptado este método para la detección de mutaciones de KRAS en el cáncer colorrectal. En comparación con el método de secuenciación directa, la PCR cuantitativa tiene una mayor ventaja en sensibilidad. La mayoría de los estudiosos que comparan los dos métodos creen que la PCR cuantitativa es más sensible. Liu Wei et al. Se utilizaron dos métodos para realizar un análisis detallado de los resultados de detección de 280 casos de mutaciones del gen KRAS de cáncer colorrectal, 94 casos de mutaciones de secuenciación del gen KRAS, la tasa positiva fue del 33.57% (94/280), de los cuales, fluorescencia cuantitativa en tiempo real La PCR fue positiva en 91 casos y tuvo una sensibilidad del 96.8% (91/94). De los 186 casos de secuenciación de genes de tipo salvaje, 184 fueron negativos mediante PCR cuantitativa en tiempo real, con una especificidad del 98.9% (184/186). La tasa de coincidencia entre el método de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real y el método de secuenciación directa de genes fue del 98.2%. En los dos métodos de detección, las tasas de coincidencia positiva y negativa de cada sitio de mutación fueron superiores al 90% y la tasa de coincidencia de cuatro sitios alcanzó el 100%. Los resultados de detección de los dos métodos fueron muy consistentes, lo que indica que la PCR cuantitativa fluorescente es un método más confiable para la detección de mutaciones. Sin embargo, los métodos basados en PCR necesitan diseñar cebadores y sondas basados en tipos de mutaciones conocidos, por lo que no se pueden detectar todas las mutaciones posibles y solo se pueden detectar sitios específicos. Si un determinado sitio no está incluido en el rango de detección del kit, incluso si realmente hay una mutación, el resultado del kit sigue siendo negativo. Además, aunque la sensibilidad de la PCR cuantitativa es alta, aún es necesario verificar si hay falsos positivos mediante tecnología de secuenciación de ADN o experimentos clínicos retrospectivos y prospectivos con muestras de gran tamaño para confirmar la correlación entre el estado de la mutación KRAS y la eficacia de las pruebas dirigidas. drogas. Por lo tanto, no se debe buscar a ciegas la alta sensibilidad de la detección de mutaciones, mientras que se deben ignorar la especificidad y precisión de la detección. En diferentes condiciones de laboratorio, el método óptimo para la detección de mutaciones en muestras también puede ser diferente. Para muestras con una mayor proporción de mutaciones, el método de secuenciación Sanger tiene una mayor precisión en la detección de mutaciones genéticas, mientras que para muestras con una menor proporción de mutaciones, el método de secuenciación Sanger pueden producirse falsos negativos y el método de detección utiliza PCR fluorescente como plataforma técnica. puede caracterizarse por una alta sensibilidad.
5. Método de gestión de recursos humanos:
Es uno de los métodos de detección de genes más utilizados en los últimos años. Tiene las ventajas de un tubo simple, rápido, sensible y único para evitar la contaminación. Para explorar la viabilidad de su uso en pruebas clínicas, Liu Liqin y otros utilizaron el método HRM para detectar mutaciones del gen KRAS en 64 pacientes con cáncer colorrectal y luego utilizaron la secuenciación directa para verificar los resultados. Se encuentra que los resultados de HRM y secuenciación directa son consistentes. En comparación con la secuenciación directa, la detección de mutaciones del gen KRAS por HRM es simple y precisa, lo que sugiere que es un método confiable adecuado para pruebas clínicas. Chen Zhihong y col. Usó el método HRM para probar una serie de muestras mixtas que contenían diferentes proporciones de plásmidos mutantes KRAS para evaluar su sensibilidad. Se encontró que la proporción de mutaciones de plásmido en las muestras mezcladas fue del 10% y la sensibilidad alcanzó el 10%. Posteriormente, el método se utilizó para detectar mutaciones del gen KRAS en 60 muestras de tejido de cáncer colorrectal. En comparación con el método de secuenciación directa, la sensibilidad del método HRM fue del 100% y la especificidad fue del 96% (43/45). La desventaja del método HRM es que es imposible proporcionar con precisión el tipo de mutación específico y qué codón está mutado. Si se encuentra una anomalía en la curva de fusión, se necesita un método de secuenciación para determinar el tipo de mutación. El grupo de investigación de Harlé utilizó 156 casos de tejido de cáncer colorrectal para comparar los métodos de PCR fluorescente, ARMS y HRM. Los resultados sugieren que aunque los tres métodos son adecuados para pruebas clínicas, la confiabilidad de HRM no es tan buena como los otros dos métodos.
6. Otros métodos:
Además de los métodos mencionados anteriormente, otros métodos de detección tienen sus propias ventajas y desventajas en la aplicación, como PCR-SSCP, cromatografía líquida de alta resolución, método de sonda de oligonucleótidos optimizada para PCR fluorescente, método de combinación de PCR anidada y ARMS, COLD-PCR método, etc. La cromatografía líquida de alta resolución tiene una gran especificidad, pero la demanda de muestras es grande; PCR-SSCP es de bajo costo y económico, pero la operación es complicada; La tecnología de detección de mutaciones basada en PCR fluorescente tiene una fuerte especificidad, alta sensibilidad y cuantitativa precisa, fácil operación, reacción completamente bloqueada y otras ventajas, pero todos necesitan diseñar cebadores y sondas de acuerdo con el tipo de mutación conocido, por lo que solo se pueden usar sitios específicos detectadas, y no se pueden detectar todas las posibles mutaciones.
3. Resumen
En resumen, debido a que los sitios de mutación y los métodos de detección en diferentes laboratorios no son uniformes, el tamaño de las muestras tumorales analizadas y la calidad de la extracción de ADN también son desiguales, lo que resulta en la existencia de resultados experimentales grandes o pequeños entre laboratorios Diferencias, la estandarización de la detección de mutaciones del gen KRAS se ha convertido en un tema de detección clínica de preocupación en varios países. En la actualidad, existen muchos métodos para detectar mutaciones en el gen KRAS. La sensibilidad de mayor a menor es ARMS, pirosecuenciación, HRM, PCR cuantitativa en tiempo real y secuenciación directa. A partir de la realidad clínica, una baja sensibilidad no es propicia para el tratamiento clínico, pero los métodos demasiado sensibles harán que la especificidad de detección disminuya y pueden producirse resultados falsos positivos innecesarios y afectar el régimen de medicación posterior del paciente. Considerando los aspectos anteriores, combinado con el método aprobado por la FDA, se recomienda el método ARMS. Por supuesto, desde una perspectiva de mercado, el diagnóstico molecular no debería enfatizarme
métodos, pero concéntrese en los resultados finales correctos. Diferentes laboratorios pueden adoptar métodos de prueba apropiados de acuerdo con la situación real, pero solo si cuentan con buenas calificaciones del operador y sistemas internos de control de calidad. En las condiciones ambientales actuales de los laboratorios domésticos, es necesario realizar pruebas en un laboratorio de PCR estandarizado y participar en actividades de control de calidad entre salas nacionales e internacionales para garantizar una calidad confiable de las pruebas de laboratorio. La gestión estandarizada es una condición necesaria para asegurar resultados constantes. En China existe una urgente necesidad de unificar y estandarizar las pruebas clínicas del gen KRAS, y de generar un programa de pruebas estandarizado y estandarizado de acuerdo a las diferentes necesidades, y este programa puede extenderse a la detección de BRAF, PIK23450_3CA, EGFR y otros genes para promover las pruebas de patología molecular clínica.
