Τα στοχευόμενα φάρμακα όπως το cetuximab και το panitumumab έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στην κλινική ως αποτελεσματικά θεραπευτικά φάρμακα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα κλινικά δεδομένα δείχνουν ότι οι ασθενείς με μεταλλάξεις KRAS δεν έχουν σημαντική επίδραση σε αυτό το φάρμακο μονοκλωνικών αντισωμάτων και μόνο ασθενείς άγριου τύπου μπορούν να επωφεληθούν από αυτό. Ως εκ τούτου, η κατάσταση μετάλλαξης του γονιδίου KRAS θεωρείται κλινικά ως ένας σημαντικός θεραπευτικός δείκτης, ο οποίος έχει ισχυρή συσχέτιση με την πρόγνωση και την θεραπευτική επίδραση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Οι κατευθυντήριες οδηγίες κλινικής πρακτικής για τον καρκίνο του παχέος εντέρου του 2009 για το Εθνικό Ολοκληρωμένο Δίκτυο Καρκίνου (NCCN) ορίζουν ότι όλοι οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου πρέπει να ανιχνεύουν την κατάσταση μετάλλαξης γονιδίου KRAS και μόνο ο άγριος τύπος KRAS συνιστάται για τη λήψη στοχευμένης θεραπείας με EGFR. Την ίδια χρονιά, η Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας (ASCO) εξέδωσε επίσης τις ίδιες συστάσεις κλινικής θεραπείας ως μοριακός δείκτης για θεραπεία στοχευμένης όγκου, γεγονός που δείχνει τη σημαντική κατευθυντήρια σημασία της. Επί του παρόντος, ο γενετικός έλεγχος KRAS έχει διεξαχθεί ευρέως κλινικά. Αξιολογούμε κυρίως τις εγχώριες μεθόδους ανίχνευσης μεταλλάξεων γονιδίου KRAS για αναφορά στην κλινική επιλογή.
1. Το θετικό ποσοστό μετάλλαξης γονιδίου KRAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου
Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, το ποσοστό μετάλλαξης του γονιδίου KRAS είναι τόσο υψηλό όσο 35% έως 45%, και η θέση μετάλλαξης υψηλού κινδύνου είναι τα κωδικόνια 12 και 13 στο εξόνιο 2, και εξακολουθούν να υπάρχουν σπάνια, όπως το 61 και το 146. Θέση μετάλλαξης. Υπάρχουν πολλές μέθοδοι ανίχνευσης για μεταλλάξεις γονιδίων KRAS, συμπεριλαμβανομένης της άμεσης αλληλουχίας, της ανάλυσης καμπύλης τήξης υψηλής ανάλυσης (HRM), της πυροαλληλουχίας, της ποσοτικής PCR, του συστήματος μπλοκ ενίσχυσης μετάλλαξης (amplinc atio) nrefractorymutation system (ARMS), του μήκους θραύσματος περιορισμού πολυμορφισμού (RFLP), της ανάλυσης πολυμεράσης και της αλυσιδωτής διαμόρφωσης πολυμορφισμός (PCR-SSCP), συνενίσχυση σε χαμηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης PCR (COLD-PCR) και ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης κ.λπ.
2. Αξιολόγηση μεθόδων ανίχνευσης μεταλλάξεων KRAS
1. Μέθοδος άμεσου προσδιορισμού αλληλουχίας: Είναι η πιο κλασική μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίων KRAS, και είναι επίσης το χρυσό πρότυπο για την ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίων. Η μέθοδος άμεσης αλληλουχίας που βασίζεται στην αρχή της διδεοξυ αλληλουχίας μπορεί να δείξει πιο διαισθητικά την αλλαγή της αλληλουχίας γονιδίου με τη μορφή χάρτη κορυφής βάσης. Ο τύπος ανίχνευσης είναι πιο ολοκληρωμένος και είναι επίσης η πιο πρώιμη εφαρμοσμένη μέθοδος ανίχνευσης μεταλλάξεων. Παρά την εμφάνιση των πλατφορμών αλληλουχίας νέας γενιάς, οι μελετητές στο εσωτερικό και στο εξωτερικό εξακολουθούν να χρησιμοποιούν τα αποτελέσματα της άμεσης αλληλουχίας ως κλίμακα για τη μέτρηση και τον προσδιορισμό της αξιοπιστίας της νέας μεθόδου. Οι Gao Jing et al. Εφαρμόστηκε άμεση αλληλούχιση στην ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίων KRAS και BRAF σε 966 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτή είναι και η ανάλυση της μετάλλαξης του γονιδίου KRAS με το μεγαλύτερο εγχώριο δείγμα που αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Ο Ling Yun και άλλοι πιστεύουν ότι η μέθοδος άμεσης αλληλουχίας είναι η πιο άμεση και αποτελεσματική μέθοδος ανίχνευσης για την κατανόηση της κατάστασης μετάλλαξης κάθε γονιδίου, η οποία μπορεί να αποσαφηνίσει τον τύπο της μετάλλαξης, ειδικά για την ανίχνευση άγνωστων μεταλλάξεων. Αν και η ευαισθησία αυτής της μεθόδου είναι σχετικά χαμηλή, μπορεί να βελτιωθεί με μεθόδους όπως η μικροτομή για τον εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων. Η μέθοδος άμεσης αλληλουχίας έχει επίσης εφαρμοστεί στην ανίχνευση KRAS μεγαλύτερων μεγεθών δειγμάτων σε άλλες εγχώριες ερευνητικές ομάδες. Ωστόσο, η χαμηλότερη ευαισθησία είναι το μεγαλύτερο μειονέκτημα της άμεσης αλληλουχίας. Κρίνοντας από τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν στην Κίνα, το ποσοστό ανίχνευσης μεταλλάξεων με άμεση αλληλούχιση δεν είναι χαμηλό. Οι Liu Xiaojing et al. Σύγκρινε την άμεση αλληλούχιση και το πεπτιδικό νουκλεϊκό οξύ clamp PCR (PNA-PCR) και διαπίστωσε ότι 43 περιπτώσεις μεταλλάξεων γονιδίου KRAS ανιχνεύθηκαν με άμεση αλληλούχιση. Εκτός από αυτές τις μεταλλάξεις, η PNA-PCR ανιχνεύθηκε επίσης με άμεση αλληλούχιση. Βρέθηκαν δέκα μεταλλάξεις στον άγριο τύπο και έγιναν προτάσεις για τον προσδιορισμό των ασθενών άγριου τύπου με PCR και την άμεση μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας για τον προσδιορισμό των μεταλλαγμένων ασθενών. Οι Qiu Tian et al. Εντοπίστηκαν 131 δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου με τη μέθοδο ολιγονουκλεοτιδικού ανιχνευτή βελτιστοποιημένη με φθορισμό PCR και τη μέθοδο άμεσης αλληλούχισης και τα θετικά ποσοστά μεταλλάξεων γονιδίου KRAS ήταν 41.2% (54/131) και 40.5% (53/131) . Ο Bai Dongyu συζήτησε επίσης την ευαισθησία ανίχνευσης διαφορετικών μεθόδων. Από τους 200 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, οι 63 εντοπίστηκαν με μεταλλάξεις RT-qPCR και το ποσοστό ανίχνευσης μεταλλάξεων ήταν 31.5%. 169 δείγματα αναλύθηκαν επιτυχώς με άμεση αλληλούχιση 50 περιπτώσεων μετάλλαξης, ποσοστό ανίχνευσης μεταλλάξεων 29.6%. Αν και η μέθοδος άμεσης αλληλουχίας μπορεί να ανιχνεύσει με ακρίβεια, αντικειμενικότητα και συγκεκριμένα την κατάσταση μετάλλαξης γονιδίου KRAS, οι ελλείψεις της όπως οι υψηλές τεχνικές απαιτήσεις, οι περίπλοκες διαδικασίες λειτουργίας, η εύκολη πρόκληση διασταυρούμενης μόλυνσης και η χρονοβόρα και επίπονη ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι επίσης πολύ εμφανείς. Συχνά δεν υπάρχει εξοπλισμός αλληλούχισης και το δείγμα πρέπει να σταλεί στην αντίστοιχη εταιρεία για δοκιμή, κάτι που διαρκεί πολύ και έχει υψηλό κόστος, επομένως έχει μεγάλους περιορισμούς.
Μέθοδος Pyrosequencing:
Η μέθοδος Pyrosequencing είναι επίσης μια πιο βολική μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίου KRAS όσον αφορά την ευαισθησία αλληλουχίας, το κόστος ανίχνευσης και τον χρόνο αναφοράς. Η επαναληψιμότητα αυτής της μεθόδου είναι καλύτερη. Σύμφωνα με τον ληφθέντα χάρτη αιχμής Η ποσοτική μελέτη της συχνότητας μετάλλαξης μιας συγκεκριμένης θέσης και η σύγκριση μεταξύ των συχνοτήτων μετάλλαξης διαφορετικών θέσεων είναι ξεκάθαρες με μια ματιά. Τα τελευταία χρόνια, οι Ogino et al., Hutchins et al. Χρησιμοποίησαν τεχνολογία πυροσυλληλίας για τη δοκιμή μεταλλάξεων KRAS σε ασθενείς με μεγάλα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τεχνολογία pyrosequencing είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον έλεγχο ασθενών για στοχευμένη θεραπεία. Η μοριακή διάγνωση όγκων έχει ευρείες προοπτικές εφαρμογής. Οι εγχώριοι επιστήμονες έχουν χρησιμοποιήσει επίσης την τεχνολογία πυροαλληλουχίας για την κλινική ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, με καλή ακρίβεια και αξιοπιστία. Αυτή η μέθοδος έχει καλύτερη ειδικότητα και μεγαλύτερη ευαισθησία. SundstrÖm et al. Σύγκρινε την ειδική για αλληλόμορφη PCR και την πυροαλληλουχία σε κλινικές εφαρμογές και διαπίστωσε ότι σε 314 περιπτώσεις μεταλλάξεων KRAS σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, η ειδικότητα της πυροαλληλουχίας ήταν ανώτερη από αυτή των αλληλόμορφων. PCR, και έχει καλή ευαισθησία σε ιστούς με χαμηλή περιεκτικότητα σε καρκινικά κύτταρα. Αραιώστε την αναλογία των καρκινικών κυττάρων σε 1.25% έως 2.5%. Η Pyrosequencing μπορεί ακόμα να ανιχνεύσει σήματα μετάλλαξης. Όταν η ελάχιστη περιεκτικότητα σε μεταλλαγμένα αλληλόμορφα στο δείγμα πρέπει να φτάσει το 20% για να ανιχνευθεί με την αλληλουχία Sanger, μπορεί να ανιχνευθεί με τη μέθοδο HRM όταν φτάσει το 10%, και για την πυροαλληλουχία μόνο οι μεταλλάξεις μπορούν να ανιχνευθούν κατά 5%. Αλληλόμορφα. Χρησιμοποιήσαμε πυροσυλληλουχία για να ανιχνεύσουμε μεταλλάξεις KRAS σε 717 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και βρήκαμε ότι η συχνότητα των μεταλλάξεων KRAS ήταν 40.9%. Ο ρυθμός μετάλλαξης του κωδικονίου 12 ήταν 30.1%, ο ρυθμός μετάλλαξης του κωδικονίου 13 ήταν 9.8%, και ο ρυθμός μετάλλαξης του κωδικονίου 61 ήταν 1.0%. Εμπλουτίσαμε τους ιστούς με υψηλότερη περιεκτικότητα σε όγκο με χειροκίνητη μικροτομή πριν από τη δοκιμή, καθιστώντας τα αποτελέσματα πιο αξιόπιστα. Η μέθοδος έχει καλή ευαισθησία και ειδικότητα και είναι εύκολο να αναπτυχθεί στην κλινική πράξη. Το μειονέκτημα της πυροαλληλουχίας είναι το υψηλό κόστος ανίχνευσης και η διαδικασία παρασκευής μονόκλωνου DNA για τον προσδιορισμό αλληλουχίας δειγμάτων είναι επίπονη. Στο μέλλον, το pyrosequencing μπορεί να αφιερωθεί στην ανάπτυξη τεχνολογίας για την άμεση ανίχνευση δίκλωνων προϊόντων PCR, η οποία θα απλοποιήσει σημαντικά τη λειτουργία. Και μειώστε αποτελεσματικά το κόστος της αλληλουχίας για την επίτευξη ολοκληρωμένης προώθησης των κλινικών δοκιμών.
3. Μέθοδος ARMS:
Αυτή η τεχνολογία χρησιμοποιεί εκκινητές για τη διάκριση μεταξύ άγριου τύπου και μεταλλαγμένων γονιδίων, wh
ich έχει αναφερθεί ήδη από τη δεκαετία του 1980. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι έχει ευαισθησία έως και 1.0% και μπορεί να ανιχνεύσει μεταλλαγμένα γονίδια σε δείγματα έως και 1.0%. Στο σχεδιασμό, το μήκος του προϊόντος-στόχου μπορεί να μειωθεί στο μέγιστο βαθμό και το πρόβλημα ότι τα ακριβή αποτελέσματα ανίχνευσης δεν μπορούν να ληφθούν επειδή το μεγαλύτερο μέρος του DNA που εξάγεται από το δείγμα ιστού που έχει ενσωματωθεί σε παραφίνη είναι κατακερματισμένο. Αυτή η τεχνολογία συνδυάζει την πλατφόρμα PCR σε πραγματικό χρόνο για να επιτύχει λειτουργία κλειστού σωλήνα κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. Η λειτουργία είναι απλή και δεν απαιτεί μετεπεξεργασία του προϊόντος, η οποία μπορεί να αποφύγει τη μόλυνση του ενισχυμένου προϊόντος στο μέγιστο βαθμό. Προς το παρόν, η μέθοδος Scorpion-ARMS που συνδυάζει τον ανιχνευτή σκορπιού και το σύστημα μετάλλαξης μπλοκ ενίσχυσης χρησιμοποιείται πιο συχνά στον κόσμο. Ο συνδυασμός των δύο τεχνολογιών μπορεί να μεγιστοποιήσει την ευαισθησία και την ειδικότητα και των δύο πλευρών. Οι Gao Jie et al. Χρησιμοποίησε αυτή τη μέθοδο για να ανιχνεύσει την κατάσταση μετάλλαξης του γονιδίου KRAS σε 167 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, υποδηλώνοντας ότι αυτή η μέθοδος είναι αξιόπιστη και ακριβής. Οι Wang Hui et al. Χρησιμοποιήθηκε επίσης το ARMS για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS σε 151 περιπτώσεις ιστών σταθεροποιημένων με φορμαλδεΰδη και ενσωματωμένων σε παραφίνη. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, το κιτ COBAS (Roche) που έχει εγκριθεί από τον FDA για κλινικές δοκιμές του KRAS και το κιτ Therascreen RGQ (Qiagen) που είναι πιστοποιημένο από την Ευρωπαϊκή Ένωση In Vitro Diagnostics (CE-IVD) χρησιμοποιούν όλα την αρχή ARMS. Μεταξύ των κοινών μεθόδων, η μέθοδος ARMS είναι η πιο ευαίσθητη και το κόστος είναι σχετικά λογικό. Ως εκ τούτου, ένα μεγάλο μέρος της κλινικής ανίχνευσης των γονιδίων KRAS στο εσωτερικό και στο εξωτερικό χρησιμοποιεί τη μέθοδο ARMS, αλλά επειδή η μέθοδος βασίζεται στην τεχνολογία PCR, το μειονέκτημά της είναι ότι μπορεί να ανιχνευθεί μόνο μεταλλάξεις γνωστών θέσεων.
4. Μέθοδος ποσοτικής PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο:
Είναι μια μέθοδος ανίχνευσης που βασίζεται σε PCR για τον προσδιορισμό της μετάλλαξης με την τιμή Ct. Έχει τα πλεονεκτήματα της ισχυρής ειδικότητας, της υψηλής ευαισθησίας, της ακριβούς ποσοτικοποίησης, της εύκολης λειτουργίας και της πλήρως κλειστής αντίδρασης. Πολλές πειραματικές ομάδες έχουν υιοθετήσει αυτή τη μέθοδο για την ανίχνευση μεταλλάξεων KRAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Σε σύγκριση με τη μέθοδο άμεσης αλληλούχισης, η ποσοτική PCR κατέχει μεγαλύτερο πλεονέκτημα στην ευαισθησία. Οι περισσότεροι μελετητές που συγκρίνουν τις δύο μεθόδους πιστεύουν ότι η ποσοτική PCR είναι πιο ευαίσθητη. Οι Liu Wei et al. Χρησιμοποίησε δύο μεθόδους για να κάνει μια λεπτομερή ανάλυση των αποτελεσμάτων ανίχνευσης 280 περιπτώσεων γονιδιακών μεταλλάξεων KRAS καρκίνου του παχέος εντέρου, 94 περιπτώσεις μεταλλάξεων αλληλουχίας γονιδίου KRAS, το θετικό ποσοστό ήταν 33.57% (94/280), εκ των οποίων, ποσοτικός φθορισμός σε πραγματικό χρόνο Η PCR ήταν θετική 91 περιπτώσεις είχαν ευαισθησία 96.8% (91/94). Από τις 186 περιπτώσεις γονιδιακής αλληλουχίας άγριου τύπου, οι 184 ήταν αρνητικές με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, με ειδικότητα 98.9% (184/186). Το ποσοστό σύμπτωσης μεταξύ της μεθόδου ποσοτικής PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο και της μεθόδου άμεσης γονιδιακής αλληλουχίας ήταν 98.2%. Στις δύο μεθόδους ανίχνευσης, τα ποσοστά θετικής και αρνητικής σύμπτωσης κάθε θέσης μετάλλαξης ήταν πάνω από 90%, και το ποσοστό σύμπτωσης τεσσάρων θέσεων έφτασε το 100%. Τα αποτελέσματα ανίχνευσης των δύο μεθόδων ήταν εξαιρετικά συνεπή, υποδεικνύοντας φθορίζουσα ποσοτική PCR Είναι μια πιο αξιόπιστη μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων. Ωστόσο, οι μέθοδοι που βασίζονται σε PCR πρέπει να σχεδιάζουν εκκινητές και ανιχνευτές με βάση γνωστούς τύπους μεταλλάξεων, έτσι ώστε να μην μπορούν να ανιχνευθούν όλες οι πιθανές μεταλλάξεις και να μπορούν να ανιχνευθούν μόνο συγκεκριμένες θέσεις. Εάν μια συγκεκριμένη τοποθεσία δεν περιλαμβάνεται στο εύρος ανίχνευσης του κιτ, ακόμα κι αν υπάρχει στην πραγματικότητα μια μετάλλαξη, το αποτέλεσμα του κιτ εξακολουθεί να είναι αρνητικό. Επιπλέον, αν και η ευαισθησία της ποσοτικής PCR είναι υψηλή, αν υπάρχουν ψευδώς θετικά πρέπει να επαληθευτεί με τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας DNA ή αναδρομικά και προοπτικά κλινικά πειράματα με μεγάλα μεγέθη δειγμάτων για να επιβεβαιωθεί η συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης μετάλλαξης KRAS και της αποτελεσματικότητας των στοχευμένων φάρμακα . Επομένως, η υψηλή ευαισθησία της ανίχνευσης μεταλλάξεων δεν πρέπει να επιδιώκεται τυφλά, ενώ η ειδικότητα και η ακρίβεια της ανίχνευσης θα πρέπει να αγνοούνται. Κάτω από διαφορετικές εργαστηριακές συνθήκες, η βέλτιστη μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγματα μπορεί επίσης να είναι διαφορετική. Για δείγματα με υψηλότερη αναλογία μεταλλάξεων, η μέθοδος αλληλουχίας Sanger έχει υψηλότερη ακρίβεια στην ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίων, ενώ για δείγματα με μικρότερο ποσοστό μεταλλάξεων, η μέθοδος αλληλουχίας Sanger ενδέχεται να εμφανιστούν ψευδώς αρνητικά και η μέθοδος ανίχνευσης με χρήση φθορισμού PCR ως τεχνική πλατφόρμα μπορεί να χαρακτηριστεί από υψηλή ευαισθησία.
5. Μέθοδος HRM:
Είναι μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους ανίχνευσης γονιδίων τα τελευταία χρόνια. Έχει τα πλεονεκτήματα του απλού, γρήγορου, ευαίσθητου και ενιαίου σωλήνα για την αποφυγή της ρύπανσης. Προκειμένου να διερευνήσουν τη σκοπιμότητα της χρήσης του σε κλινικές δοκιμές, ο Liu Liqin και άλλοι χρησιμοποίησαν τη μέθοδο HRM για να ανιχνεύσουν μεταλλάξεις γονιδίου KRAS σε 64 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και στη συνέχεια χρησιμοποίησαν άμεση αλληλούχιση για να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα του HRM και της άμεσης αλληλουχίας βρέθηκαν να είναι συνεπή. Σε σύγκριση με την άμεση αλληλούχιση, η ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίου KRAS με HRM είναι απλή και ακριβής, υποδηλώνοντας ότι είναι μια αξιόπιστη μέθοδος κατάλληλη για κλινικές δοκιμές. Οι Chen Zhihong et al. Χρησιμοποίησε τη μέθοδο HRM για να δοκιμάσει μια σειρά μικτών δειγμάτων που περιέχουν διαφορετικές αναλογίες μεταλλαγμένων πλασμιδίων KRAS για να αξιολογήσει την ευαισθησία τους. Διαπιστώθηκε ότι το ποσοστό των μεταλλάξεων πλασμιδίου στα μικτά δείγματα ήταν 10%, και η ευαισθησία έφτασε το 10%. Στη συνέχεια, η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση μεταλλάξεων γονιδίου KRAS σε 60 δείγματα ιστού καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε σύγκριση με τη μέθοδο άμεσης αλληλούχισης, η ευαισθησία της μεθόδου HRM ήταν 100%, και η ειδικότητα ήταν 96% (43/45). Το μειονέκτημα της μεθόδου HRM είναι ότι είναι αδύνατο να προσδιοριστεί με ακρίβεια ο συγκεκριμένος τύπος μετάλλαξης και ποιο κωδικόνιο είναι μεταλλαγμένο. Εάν εντοπιστεί μια ανωμαλία στην καμπύλη τήξης, απαιτείται μέθοδος αλληλουχίας για τον προσδιορισμό του τύπου μετάλλαξης. Η ερευνητική ομάδα της Harlé χρησιμοποίησε 156 περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου για να συγκρίνει τις μεθόδους PCR φθορισμού, ARMS και HRM. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αν και οι τρεις μέθοδοι είναι κατάλληλες για κλινικές δοκιμές, η αξιοπιστία του HRM δεν είναι τόσο καλή όσο οι άλλες δύο μέθοδοι.
6. Άλλες μέθοδοι:
Εκτός από τις προαναφερθείσες μεθόδους, άλλες μέθοδοι ανίχνευσης έχουν τα δικά τους πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα στην εφαρμογή τους, όπως PCR-SSCP, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, μέθοδος ολιγονουκλεοτιδικής βελτιστοποιημένης με φθορισμό PCR , Μέθοδος ένθετου συνδυασμού PCR και ARMS, μέθοδος COLD-PCR, κ.λπ. Το PCR-SSCP είναι χαμηλό σε κόστος και οικονομικό, αλλά η λειτουργία είναι περίπλοκη. Η τεχνολογία ανίχνευσης μεταλλάξεων που βασίζεται στη φθορίζουσα PCR έχει ισχυρή ειδικότητα, υψηλή ευαισθησία και ακριβή ποσοτική, εύκολη λειτουργία, πλήρως μπλοκαρισμένη αντίδραση και άλλα πλεονεκτήματα, αλλά όλα πρέπει να σχεδιάζουν εκκινητές και ανιχνευτές σύμφωνα με τον γνωστό τύπο μετάλλαξης, ώστε να μπορούν να ανιχνευθούν μόνο συγκεκριμένες θέσεις και να μην μπορούν να ανιχνευθούν όλες οι πιθανές μεταλλάξεις.
3. Περίληψη
Συνοψίζοντας, επειδή οι θέσεις μετάλλαξης και οι μέθοδοι ανίχνευσης σε διαφορετικά εργαστήρια δεν είναι ομοιόμορφες, το μέγεθος των δειγμάτων όγκου που αναλύθηκαν και η ποιότητα της εξαγωγής DNA είναι επίσης άνιση, με αποτέλεσμα την ύπαρξη μεγάλων ή μικρών πειραματικών αποτελεσμάτων μεταξύ εργαστηρίων Διαφορές, η τυποποίηση της ανίχνευσης μεταλλάξεων γονιδίου KRAS έχει γίνει ένα θέμα κλινικής ανίχνευσης ανησυχητικό σε διάφορες χώρες. Επί του παρόντος, υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο KRAS. Η ευαισθησία από υψηλή σε χαμηλή είναι ARMS, pyrosequencing, HRM, ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο και άμεση αλληλούχιση. Από την κλινική πραγματικότητα, η χαμηλή ευαισθησία δεν ευνοεί την κλινική θεραπεία, αλλά οι πολύ ευαίσθητες μέθοδοι θα προκαλέσουν μείωση της εξειδίκευσης της ανίχνευσης και ενδέχεται να προκύψουν περιττά ψευδώς θετικά αποτελέσματα και να επηρεάσουν το επακόλουθο θεραπευτικό σχήμα του ασθενούς. Λαμβάνοντας υπόψη τις παραπάνω πτυχές, σε συνδυασμό με την εγκεκριμένη από τον FDA μέθοδο, συνιστάται η μέθοδος ARMS. Φυσικά, από πλευράς αγοράς, τα μοριακά διαγνωστικά δεν πρέπει να με τονίζουν
μεθόδων, αλλά επικεντρωθείτε στα τελικά σωστά αποτελέσματα. Διαφορετικά εργαστήρια μπορούν να υιοθετήσουν κατάλληλες μεθόδους δοκιμών σύμφωνα με την πραγματική κατάσταση, αλλά μόνο εάν διαθέτουν καλά προσόντα χειριστή και συστήματα εσωτερικού ελέγχου ποιότητας. Υπό τις τρέχουσες περιβαλλοντικές συνθήκες του οικιακού εργαστηρίου, είναι απαραίτητο να διεξάγονται δοκιμές σε ένα τυποποιημένο εργαστήριο PCR και να συμμετέχουν σε εγχώριες και διεθνείς δραστηριότητες ποιοτικού ελέγχου εντός των αιθουσών για να διασφαλιστεί η αξιόπιστη ποιότητα εργαστηριακών δοκιμών. Η τυποποιημένη διαχείριση είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την εξασφάλιση σταθερών αποτελεσμάτων. Στην Κίνα, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να ενοποιηθούν και να τυποποιηθούν οι κλινικές δοκιμές του γονιδίου KRAS και να δημιουργηθεί ένα τυποποιημένο και τυποποιημένο πρόγραμμα δοκιμών σύμφωνα με διαφορετικές ανάγκες, και αυτό το πρόγραμμα μπορεί να επεκταθεί στην ανίχνευση των BRAF, PIK23450_3CA, EGFR και άλλων γονιδίων για την προώθηση των δοκιμών κλινικής μοριακής παθολογίας.
