Таргетните лекарства като цетуксимаб и панитумумаб са широко използвани в клиниката като ефективни терапевтични лекарства за колоректален рак. Клиничните данни показват, че пациентите с KRAS мутации нямат значителен ефект върху това лекарство с моноклонални антитела и само пациенти от див тип могат да се възползват от него. Следователно, състоянието на мутация на ген KRAS се разглежда клинично като важен терапевтичен маркер, който има силна корелация с прогнозата и терапевтичния ефект на колоректалния рак. Насоките за клинична практика на колоректалния рак от 2009 г. на Националната всеобхватна мрежа за рак (NCCN) предвиждат, че всички пациенти с метастатичен колоректален рак трябва да открият състоянието на мутация на ген KRAS и се препоръчва само KRAS див тип да получават EGFR насочена терапия. През същата година Американското общество по клинична онкология (ASCO) също издава същите препоръки за клинично лечение като молекулярен маркер за туморно насочена терапия, което показва важното му насочващо значение. В момента генетичните тестове KRAS се провеждат широко клинично. Ние основно оценяваме домашните методи за откриване на генна мутация KRAS за справка в клиничния подбор.
1. Положителният процент на мутация на ген KRAS при колоректален рак
При колоректалния рак степента на мутация на гена KRAS достига до 35% до 45%, а високорисковото място на мутация е кодони 12 и 13 на екзон 2 и все още има редки такива като 61 и 146. Мутация сайт. Има много методи за откриване на KRAS генни мутации, включително директно секвениране, анализ на кривата на топене с висока разделителна способност (HRM), пиросеквениране, количествена PCR, система за усилване на мутацията (amplinc atio) система за нерефракторна мутация (ARMS), полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент (RFLP), полимеразна верижна реакция - едноверижен конформационен полиморфизъм анализ (PCR - едноверижен конфомационен полиморфизъм (PCR-SSCP), коамплификация при по-ниска температура на денатурация PCR (COLD-PCR) и анализ на високоефективна течна хроматография и др.
2. Оценка на методите за откриване на мутация на KRAS
1. Метод на директно секвениране: Това е най-класическият метод за откриване на генни мутации на KRAS и също така е златен стандарт за откриване на генни мутации. Методът на директно секвениране, базиран на принципа на дидеокси секвениране, може най-интуитивно да покаже промяната на генната последователност под формата на основна карта на пика. Типът на откриване е по-изчерпателен и е и най-ранният прилаган метод за откриване на мутация. Въпреки появата на платформи за секвениране от ново поколение, учените у нас и в чужбина все още използват резултатите от директното секвениране като скала за измерване и определяне на надеждността на новия метод. Гао Джинг и др. Приложено директно секвениране за откриване на KRAS и BRAF генни мутации при 966 пациенти с колоректален рак. Това е и анализът на генната мутация KRAS с най-голямата вътрешна проба, докладвана в литературата. Линг Юн и други вярват, че методът на директно секвениране е най-прекият и ефективен метод за откриване за разбиране на мутационния статус на всеки ген, който може да изясни вида мутация, особено за откриване на неизвестни мутации. Въпреки че чувствителността на този метод е относително ниска, той може да бъде подобрен чрез методи като микродисекция за обогатяване на туморни клетки. Методът на директно секвениране се прилага и за откриване на KRAS на по-големи размери на проби в други местни изследователски групи. По-ниската чувствителност обаче е най-големият недостатък на директното секвениране. Съдейки по резултатите, докладвани в Китай, степента на откриване на мутации чрез директно секвениране не е ниска. Liu Xiaojing и сътр. Сравнени директно секвениране и пептидна нуклеинова киселинна клема PCR (PNA-PCR) и установиха, че 43 случая на KRAS генни мутации са открити чрез директно секвениране. В допълнение към тези мутации, PNA-PCR се открива и чрез директно секвениране. Бяха открити десет мутации при див тип и бяха направени предложения за определяне на пациенти от див тип чрез PCR и метода на директно секвениране за определяне на мутиралите пациенти. Qiu Tian и др. Открити са 131 проби от колоректален рак чрез флуоресцентен PCR-оптимизиран метод на олигонуклеотидна сонда и метод на директно секвениране, а положителните нива на KRAS генни мутации са 41.2% (54/131) и 40.5% (53/131)). Бай Донгю също обсъди чувствителността на откриване на различни методи. От 200 пациенти с колоректален рак, 63 са открити чрез мутации RT-qPCR, а степента на откриване на мутации е 31.5%; 169 проби бяха успешно секвенирани чрез директно секвениране 50 случая на мутация, степен на откриване на мутация 29.6%. Въпреки че методът на директно секвениране може точно, обективно и конкретно да открие състоянието на мутация на ген KRAS, неговите недостатъци като високи технически изисквания, сложни експлоатационни процедури, лесни за предизвикване на кръстосано замърсяване и трудоемко и трудоемко тълкуване на резултатите също са много очевидно. Често няма оборудване за секвениране и образецът трябва да бъде изпратен на съответната компания за тестване, което отнема много време и има висока цена, така че има големи ограничения.
Пиросеквенционен метод:
Методът на пиросеквениране също е по-удобен метод за откриване на генна мутация KRAS по отношение на чувствителността на секвениране, разходите за откриване и времето за докладване. Повторяемостта на този метод е по-добра. Според получената карта на пиковете Количественото изследване на честотата на мутация на дадено място и сравнението между честотите на мутации на различни места са ясни с един поглед. През последните години Ogino et al., Hutchins et al. Използвали са технология за пиросеквенция за тестване на KRAS мутации при пациенти с големи проби от рак на дебелото черво. Резултатите показват, че технологията за пиросеквенция е мощен инструмент за скрининг на пациенти за целенасочена терапия. Туморната молекулярна диагностика има широки перспективи за приложение. Домашни учени също са използвали технология за пиросеквенция за клинично откриване на KRAS мутации при колоректален рак с добра точност и надеждност. Този метод има по-добра специфичност и по-висока чувствителност. SundstrÖm и сътр. Сравнено специфично за алелите PCR и пиросеквениране в клинични приложения и установено, че при 314 случая на мутации на KRAS при пациенти с колоректален рак, специфичността на пиросеквенцията е по-добра от тази на алелите. PCR и има добра чувствителност към тъкани с ниско съдържание на туморни клетки. Разредете дела на туморните клетки до 1.25% до 2.5%. Пиросеквенцията все още може да открива мутационни сигнали. Когато минималното съдържание на мутантни алели в пробата трябва да достигне 20%, за да бъде открито чрез секвениране на Sanger, то може да бъде открито чрез HRM метод, когато достигне 10%, а за пиросеквениране само мутации могат да бъдат открити с 5%. Алели. Използвахме пиросеквенция за откриване на KRAS мутации при 717 пациенти с колоректален рак и установихме, че честотата на KRAS мутациите е 40.9%. Скоростта на мутация на кодон 12 е 30.1%, скоростта на мутация на кодон 13 е 9.8% и скоростта на мутация на кодон 61 е 1.0%. Обогатихме тъканите с по-високо съдържание на тумори чрез ръчна микродисекция преди тестване, правейки резултатите по-надеждни. Методът има добра чувствителност и специфичност и е лесен за разработване в клиничната практика. Недостатъкът на пиросеквенирането е високата цена на откриване, а процесът на получаване на едноверижна ДНК за секвениране на проби е тромав. В бъдеще пиросеквенцията може да бъде посветена на разработването на технология за директно откриване на двуверижни PCR продукти, което значително ще опрости операцията. И ефективно намаляване на разходите за секвениране, за да се постигне всеобхватна промоция на клиничните тестове.
3. ОРЪЖЕН метод:
Тази технология използва праймери, за да прави разлика между дивия тип и мутантните гени, wh
ich се съобщава още през 1980-те години. Най-голямото предимство на този метод е, че той има чувствителност до 1.0% и може да открие мутантни гени в проби с ниска стойност до 1.0%. При проектирането дължината на целевия продукт може да бъде съкратена в най-голяма степен и проблемът, че не могат да бъдат получени точни резултати от откриването, тъй като по-голямата част от ДНК, извлечена от вградения в парафина тъкан, е фрагментирана. Тази технология комбинира PCR платформата в реално време за постигане на работа в затворена тръба по време на усилване. Операцията е проста и не изисква последваща обработка на продукта, която може да избегне замърсяването на усиления продукт в най-голяма степен. В момента методът на скорпион-ARMS, комбиниращ система за мутация на сонда на скорпион и блок за усилване, е по-често използван в света. Комбинацията от двете технологии може да увеличи максимално чувствителността и специфичността на двете страни. Gao Jie и сътр. Използва този метод за откриване на състоянието на мутация на ген KRAS при 167 пациенти с колоректален рак, което предполага, че този метод е надежден и точен. Wang Hui et al. Използва се също ARMS за откриване на KRAS мутации в 151 случая на фиксирани с формалдехид и вложени в парафин тъкани. В САЩ комплектът COBAS (Roche), одобрен от FDA за клинично тестване на KRAS, и комплектът Therascreen RGQ (Qiagen), сертифициран от Европейския съюз за ин витро диагностика (CE-IVD), използват принципа ARMS. Сред често срещаните методи методът ARMS е най-чувствителен и цената е относително приемлива. Следователно голяма част от клиничното откриване на гени KRAS у нас и в чужбина използват метода ARMS, но тъй като методът се основава на PCR технология, неговият недостатък е, че може да бъде открит само известни мутации на сайтове.
4. Количествен PCR метод в реално време за флуоресценция:
Това е PCR-базиран метод за откриване, за да се определи мутацията по Ct стойност. Той има предимствата на силна специфичност, висока чувствителност, точно количествено определяне, лесна работа и напълно затворена реакция. Много експериментални групи са възприели този метод за откриване на KRAS мутации при колоректален рак. В сравнение с метода на директно секвениране, количествената PCR заема по-голямо предимство в чувствителността. Повечето учени, сравняващи двата метода, смятат, че количествената PCR е по-чувствителна. Liu Wei et al. Използвани са два метода, за да се направи подробен анализ на резултатите от откриването на 280 случая на мутации на гена KRAS на колоректалния рак, 94 случая на мутации на секвенция на гена KRAS, положителният процент е 33.57% (94/280), от които количествена флуоресценция в реално време PCR е положителна 91 случая са имали чувствителност 96.8% (91/94). От 186 случая на генно секвениране от див тип, 184 са отрицателни чрез количествена PCR в реално време, със специфичност от 98.9% (184/186). Скоростта на съвпадение между количествения метод за PCR флуоресценция в реално време и метода на директно секвениране на гени е 98.2%. При двата метода за откриване положителните и отрицателните нива на съвпадение на всяко място на мутация са над 90%, а коефициентът на съвпадение на четирите сайта достига 100%. Резултатите от откриването на двата метода са много последователни, което показва флуоресцентна количествена PCR. Това е по-надежден метод за откриване на мутация. Въпреки това, методите, базирани на PCR, трябва да проектират праймери и сонди въз основа на известни типове мутации, така че всички възможни мутации не могат да бъдат открити и могат да бъдат открити само конкретни места. Ако определен сайт не е включен в обхвата на откриване на комплекта, дори ако действително има мутация, резултатът от комплекта все още е отрицателен. В допълнение, въпреки че чувствителността на количествената PCR е висока, дали има фалшиви положителни резултати, все още трябва да се провери чрез технология за секвениране на ДНК или ретроспективни и проспективни клинични експерименти с големи размери на пробата, за да се потвърди корелацията между състоянието на мутация на KRAS и ефикасността на целевите наркотици. Следователно, високата чувствителност на откриване на мутация не трябва да се преследва сляпо, докато специфичността и точността на откриване трябва да се пренебрегват. При различни лабораторни условия оптималният метод за откриване на мутации в пробите също може да бъде различен. За проби с по-висок дял на мутациите методът на секвениране на Sanger има по-висока точност при откриване на генни мутации, докато за образци с по-нисък дял на мутациите методът на Sanger за секвениране могат да се появят Фалшиви негативи и методът на откриване, използващ флуоресцентен PCR като техническа платформа може да се характеризира с висока чувствителност.
5. HRM метод:
Това е един от най-често използваните методи за откриване на гени през последните години. Той има предимствата на простата, бърза, чувствителна и единична тръба, за да се избегне замърсяването. За да проучат възможността за използването му при клинични тестове, Liu Liqin и други използваха метода HRM за откриване на генни мутации на KRAS при 64 пациенти с колоректален рак и след това използваха директно секвениране за проверка на резултатите. Резултатите от HRM и директното секвениране са установени за последователни. В сравнение с директното секвениране, откриването на KRAS генни мутации чрез HRM е просто и точно, което предполага, че това е надежден метод, подходящ за клинично тестване. Chen Zhihong et al. Използва се HRM метод за тестване на поредица от смесени проби, съдържащи различни пропорции на KRAS мутантни плазмиди, за да се оцени тяхната чувствителност. Установено е, че делът на плазмидните мутации в смесените проби е 10%, а чувствителността достига 10%. Впоследствие методът се използва за откриване на KRAS генни мутации в 60 проби от тъкан на колоректален рак. В сравнение с метода на директно секвениране, чувствителността на метода HRM е 100%, а специфичността е 96% (43/45). Недостатъкът на метода HRM е, че е невъзможно да се осигури точно специфичния тип мутация и кой кодон е мутирал. Ако се открие аномалия на кривата на топене, е необходим метод на секвениране за определяне на типа мутация. Изследователската група на Harlé използва 156 случая на колоректална тъкан от рак, за да сравни флуоресцентните PCR, ARMS и HRM методите. Резултатите показват, че въпреки че трите метода са подходящи за клинично изпитване, надеждността на HRM не е толкова добра, колкото другите два метода.
6. Други методи:
В допълнение към гореспоменатите методи, други методи за откриване имат свои собствени предимства и недостатъци в приложението, като PCR-SSCP, високоефективна течна хроматография, флуоресцентен метод за олигонуклеотидна сонда, оптимизиран за PCR, Метод на вложена PCR и ARMS комбинация, COLD-PCR метод и др. Високоефективната течна хроматография има силна специфичност, но търсенето на проби е голямо; PCR-SSCP е евтин и икономичен, но операцията е сложна; технологията за откриване на мутации, базирана на флуоресцентна PCR, има силна специфичност, висока чувствителност и точна количествена, лесна работа, напълно блокирана реакция и други предимства, но всички трябва да проектират праймери и сонди според известния тип мутация, така че могат да бъдат създадени само определени места и всички възможни мутации не могат да бъдат открити.
3. Обобщение
В обобщение, тъй като местата на мутация и методите за откриване в различните лаборатории не са еднакви, размерът на анализираните туморни образци и качеството на екстракция на ДНК също са неравномерни, което води до съществуването на големи или малки експериментални резултати между лабораториите Различия, стандартизацията на откриването на генна мутация KRAS се превърна в проблем за клинично откриване, предизвикващ загриженост в различни страни. В момента има много методи за откриване на мутации в гена KRAS. Чувствителността от висока към ниска е ARMS, пиросеквениране, HRM, количествена PCR в реално време и директно секвениране. От клиничната реалност ниската чувствителност не е благоприятна за клинично лечение, но твърде чувствителните методи ще доведат до намаляване на специфичността на откриване и могат да възникнат ненужни фалшиво положителни резултати и да повлияят на последващия режим на лечение на пациента. Имайки предвид горните аспекти, в комбинация с метода, одобрен от FDA, се препоръчва методът ARMS. Разбира се, от гледна точка на пазара, молекулярната диагностика не трябва да ме подчертава
методи, но се фокусирайте върху крайните правилни резултати. Различните лаборатории могат да приемат подходящи методи за изпитване според действителната ситуация, но само ако имат добра квалификация на оператора и вътрешни системи за контрол на качеството. При настоящите условия на околната среда в местната лаборатория е необходимо да се извършват тестове в стандартизирана PCR лаборатория и да се участва в вътрешни и международни дейности за контрол на качеството, за да се гарантира надеждно качество на лабораторните тестове. Стандартизираното управление е необходимо условие за осигуряване на постоянни резултати. В Китай има спешна необходимост от унифициране и стандартизиране на клиничните тестове на KRAS гена и от генериране на стандартизирана и стандартизирана програма за тестване според различните нужди и тази програма може да бъде разширена до откриването на BRAF, PIK23450_3CA, EGFR и други гени за насърчаване на клинични тестове за молекулярна патология.
