Cetuximab və panitumumab kimi hədəf dərmanları klinikada kolorektal xərçəng üçün effektiv terapevtik dərmanlar kimi geniş istifadə edilmişdir. Klinik məlumatlar göstərir ki, KRAS mutasiyaları olan xəstələr bu monoklonal antikor preparatına əhəmiyyətli təsir göstərmir və yalnız vəhşi tip xəstələr bundan faydalana bilər. Buna görə də KRAS gen mutasiyasının statusu klinik olaraq kolorektal xərçəngin proqnozu və müalicə effekti ilə güclü əlaqəsi olan mühüm terapevtik marker kimi qəbul edilir. 2009-cu il Milli Xərçəng Kompleks Şəbəkəsi (NCCN) Kolorektal Xərçəng Kliniki Təcrübə Təlimatları şərtləndirir ki, metastatik kolorektal xərçəngi olan bütün xəstələr KRAS gen mutasiyasının statusunu aşkar etməlidirlər və yalnız KRAS vəhşi tipinə EGFR ünvanlı terapiya almaq tövsiyə olunur. Elə həmin il Amerika Klinik Onkologiya Cəmiyyəti (ASCO) də şişlərə yönəldilmiş terapiya üçün molekulyar marker kimi eyni klinik müalicə tövsiyələrini verdi ki, bu da onun mühüm rəhbər əhəmiyyətini göstərir. Hal-hazırda KRAS genetik testi klinik olaraq geniş şəkildə həyata keçirilir. Biz əsasən klinik seçimdə istinad üçün yerli KRAS gen mutasiyasının aşkarlanması üsullarını qiymətləndiririk.
1. Kolorektal xərçəngdə KRAS gen mutasiyasının müsbət nisbəti
Kolorektal xərçəngdə KRAS geninin mutasiya nisbəti 35% -dən 45% -ə qədər yüksəkdir və yüksək riskli mutasiya yeri ekzon 12-də 13 və 2 kodonlardır və hələ də 61 və 146 kimi nadirlər var. Mutasiyalar Sayt. KRAS gen mutasiyaları üçün bir çox aşkarlama metodları mövcuddur, o cümlədən birbaşa ardıcıllıq, yüksək rezolyusiyada ərimə əyrisi analizi (HRM), pirosekvensiya, kəmiyyət PCR, mutasiya gücləndirmə blok sistemi (amplinc atio)nrefrakter mutasiya sistemi (ARMS), məhdudlaşdırma fraqment uzunluğu polimorfizmi (RFLP), polimeraza zəncirvari reaksiya-təkzəncirli konformasiya polimorfizminin təhlili (PZR-bir zəncirli konfomasiya polimorfizmi (PCR-SSCP), aşağı denaturasiya temperaturunda birgə gücləndirmə PCR (COLD-PCR) və yüksək performanslı maye xromatoqrafiya analizi və s.
2. KRAS mutasiyalarının aşkarlanması üsullarının qiymətləndirilməsi
1. Birbaşa ardıcıllıq metodu: KRAS gen mutasiyalarını aşkar etmək üçün ən klassik üsuldur və eyni zamanda gen mutasiyalarını aşkar etmək üçün qızıl standartdır. Dideoksi ardıcıllığı prinsipinə əsaslanan birbaşa ardıcıllıq üsulu, əsas pik xəritəsi şəklində gen ardıcıllığının dəyişməsini ən intuitiv şəkildə göstərə bilər. Aşkarlama növü daha əhatəlidir və eyni zamanda ən erkən tətbiq olunan mutasiya aşkarlama üsuludur. Yeni nəsil sekvensiya platformalarının yaranmasına baxmayaraq, yerli və xaricdəki alimlər hələ də yeni metodun etibarlılığını ölçmək və müəyyən etmək üçün birbaşa ardıcıllığın nəticələrini miqyas kimi istifadə edirlər. Gao Jing və başqaları. Kolorektal xərçəngi olan 966 xəstədə KRAS və BRAF gen mutasiyalarının aşkarlanması üçün birbaşa ardıcıllıq tətbiq edilmişdir. Bu, həm də ədəbiyyatda bildirilmiş ən böyük yerli nümunə ilə KRAS gen mutasiyasının təhlilidir. Linq Yun və başqaları hesab edirlər ki, birbaşa ardıcıllıq metodu hər bir genin mutasiya vəziyyətini başa düşmək üçün ən birbaşa və effektiv aşkarlama üsuludur ki, bu da mutasiya növünü, xüsusən də naməlum mutasiyaların aşkarlanması üçün aydınlaşdıra bilər. Bu metodun həssaslığı nisbətən aşağı olsa da, şiş hüceyrələrini zənginləşdirmək üçün mikrodisseksiya kimi üsullarla təkmilləşdirilə bilər. Birbaşa ardıcıllıq metodu digər yerli tədqiqat qruplarında daha böyük nümunə ölçülərinin KRAS aşkarlanması üçün də tətbiq edilmişdir. Bununla belə, aşağı həssaslıq birbaşa ardıcıllığın ən böyük çatışmazlığıdır. Çində bildirilən nəticələrə əsasən, birbaşa ardıcıllıqla mutasiyaların aşkarlanması nisbəti aşağı deyil. Liu Xiaojing və başqaları. Birbaşa ardıcıllıq və peptid nuklein turşusu sıxacının PCR (PNA-PCR) ilə müqayisəsi və KRAS gen mutasiyalarının 43 halının birbaşa ardıcıllıqla aşkar edildiyi aşkar edildi. Bu mutasiyalara əlavə olaraq, PNA-PCR birbaşa ardıcıllıqla da aşkar edilmişdir. Vəhşi tipdə on mutasiya aşkar edildi və vəhşi tip xəstələri PCR və mutant xəstələri müəyyən etmək üçün birbaşa ardıcıllıq metodu ilə müəyyən etmək üçün təkliflər verildi. Qiu Tian və başqaları. Floresan PCR-optimallaşdırılmış oliqonukleotid zond üsulu və birbaşa ardıcıllıq metodu ilə 131 kolorektal xərçəng nümunəsi aşkar edildi və KRAS gen mutasiyalarının müsbət nisbətləri 41.2% (54/131) və 40.5% (53/131) idi. Bai Dongyu müxtəlif üsulların aşkarlama həssaslığını da müzakirə etdi. 200 kolorektal xərçəng xəstəsindən 63-ü RT-qPCR mutasiyaları ilə aşkar edilmişdir və mutasiyaların aşkarlanması nisbəti 31.5% təşkil etmişdir; 169 nümunə 50 mutasiya halında birbaşa ardıcıllıqla ardıcıllıqla uğurla ardıcıllaşdırıldı, mutasiyaların aşkarlanma dərəcəsi 29.6%. Birbaşa ardıcıllıq metodu KRAS gen mutasiyasının vəziyyətini dəqiq, obyektiv və spesifik olaraq aşkarlaya bilsə də, onun yüksək texniki tələblər, mürəkkəb əməliyyat prosedurları, çarpaz çirklənməyə səbəb olması, nəticələrin çox vaxt aparan və zəhmət tələb edən şərhi kimi çatışmazlıqları da çox böyükdür. aşkar. Çox vaxt ardıcıllıq avadanlığı yoxdur və nümunə uzun müddət tələb edən və yüksək qiymətə malik olan sınaq üçün müvafiq şirkətə göndərilməlidir, buna görə də böyük məhdudiyyətlərə malikdir.
Pyrosequencing üsulu:
Pyrosequencing metodu həm də ardıcıllıq həssaslığı, aşkarlama dəyəri və hesabat vermə vaxtı baxımından KRAS gen mutasiyasının aşkarlanması üçün daha əlverişli üsuldur. Bu metodun təkrarlanması daha yaxşıdır. Əldə edilmiş pik xəritəyə görə Müəyyən bir sahənin mutasiya tezliyinin kəmiyyətcə öyrənilməsi və müxtəlif sahələrin mutasiya tezlikləri arasında müqayisə bir baxışda aydın olur. Son illərdə Ogino et al., Hutchins et al. Kolorektal xərçəngin böyük nümunələri olan xəstələrdə KRAS mutasiyalarını sınamaq üçün pirosequencing texnologiyasından istifadə etdilər. Nəticələr göstərir ki, pyrosequencing texnologiyası xəstələrin məqsədyönlü terapiya üçün skrininqi üçün güclü vasitədir. Şişin molekulyar diaqnostikasının geniş tətbiqi perspektivləri var. Yerli alimlər kolorektal xərçəngdə KRAS mutasiyalarını klinik olaraq yaxşı dəqiqlik və etibarlılıqla aşkar etmək üçün pirosekvensiya texnologiyasından da istifadə etmişlər. Bu üsul daha yüksək spesifikliyə və daha yüksək həssaslığa malikdir. SundstrÖm və başqaları. Klinik tətbiqlərdə allel-spesifik PCR və pirosekvensiya müqayisə edildi və kolorektal xərçəng xəstələrində KRAS mutasiyalarının 314 hadisəsində pirosekvensiyanın spesifikliyinin allellərdən daha üstün olduğunu aşkar etdi. PCR və aşağı şiş hüceyrəsi məzmunu olan toxumalara yaxşı həssaslığa malikdir. Şiş hüceyrələrinin nisbətini 1.25% -dən 2.5% -ə qədər seyreltin. Pyrosequencing hələ də mutasiya siqnallarını aşkar edə bilər. Nümunədəki mutant allellərin minimum miqdarının Sanger sekvensiyası ilə aşkarlanması üçün 20%-ə çatması lazım olduqda, 10%-ə çatdıqda HRM metodu ilə, pirosekvensləmə üçün isə yalnız 5% mutasiyalar aşkar edilə bilər. Allellər. Kolorektal xərçəngi olan 717 xəstədə KRAS mutasiyalarını aşkar etmək üçün pirosekvensiyadan istifadə etdik və KRAS mutasiyalarının tezliyinin 40.9% olduğunu aşkar etdik. 12-ci kodonun mutasiya dərəcəsi 30.1%, kodon 13-ün mutasiya dərəcəsi 9.8%, kodon 61-in mutasiya dərəcəsi 1.0% təşkil etmişdir. Sınaqdan əvvəl əllə mikrodisseksiya yolu ilə daha yüksək şiş tərkibli toxumaları zənginləşdirdik və nəticələri daha etibarlı etdik. Metod yaxşı həssaslıq və spesifikliyə malikdir və klinik praktikada inkişaf etdirmək asandır. Pirosekvensiyanın dezavantajı aşkarlamanın yüksək qiymətidir və nümunələrin ardıcıllığı üçün tək zəncirli DNT-nin hazırlanması prosesi çətin olur. Gələcəkdə pirosequencing əməliyyatı xeyli asanlaşdıracaq ikiqat zəncirli PCR məhsullarının birbaşa aşkarlanması texnologiyasının inkişafına həsr oluna bilər. Və klinik testin hərtərəfli təşviqinə nail olmaq üçün ardıcıllığın dəyərini effektiv şəkildə azaldın.
3. ARMS metodu:
Bu texnologiya vəhşi tip və mutant genləri ayırd etmək üçün primerlərdən istifadə edir, wh
iç haqqında hələ 1980-ci illərdə məlumat verilmişdir. Bu metodun ən böyük üstünlüyü onun 1.0%-ə qədər həssaslığa malik olması və 1.0%-ə qədər nümunələrdə mutant genləri aşkarlaya bilməsidir. Dizaynda hədəf məhsulun uzunluğu ən böyük ölçüdə qısaldıla bilər və parafinə daxil edilmiş toxuma nümunəsindən çıxarılan DNT-nin çox hissəsi parçalandığı üçün dəqiq aşkarlama nəticələrinin əldə edilə bilməyəcəyi problemi var. Bu texnologiya gücləndirmə zamanı qapalı boru əməliyyatına nail olmaq üçün real vaxt rejimində PCR platformasını birləşdirir. Əməliyyat sadədir və məhsulun sonrakı emalını tələb etmir, bu da gücləndirilmiş məhsulun çirklənməsinin ən böyük dərəcədə qarşısını ala bilər. Hazırda dünyada əqrəb probu və gücləndirici blok mutasiya sistemini birləşdirən əqrəb-ARMS üsulu daha çox istifadə olunur. İki texnologiyanın birləşməsi hər iki tərəfin həssaslığını və spesifikliyini maksimum dərəcədə artıra bilər. Gao Jie və başqaları. Kolorektal xərçəngi olan 167 xəstədə KRAS gen mutasiyasının vəziyyətini aşkar etmək üçün bu üsuldan istifadə edilmişdir ki, bu metodun etibarlı və dəqiq olduğunu göstərir. Wang Hui et al. Formaldehidlə sabitlənmiş və parafinə daxil edilmiş toxumaların 151 halda KRAS mutasiyalarını aşkar etmək üçün ARMS-dən də istifadə edilmişdir. Amerika Birləşmiş Ştatlarında KRAS-ın klinik sınaqları üçün FDA tərəfindən təsdiq edilmiş COBAS dəsti (Roche) və Avropa Birliyi In Vitro Diaqnostika (CE-IVD) tərəfindən sertifikatlaşdırılmış Therascreen RGQ dəsti (Qiagen) hamısı ARMS prinsipindən istifadə edir. Ümumi üsullar arasında ARMS metodu ən həssasdır və dəyəri nisbətən məqbuldur. Buna görə də, evdə və xaricdə KRAS genlərinin klinik təsbitinin böyük bir hissəsi ARMS metodundan istifadə olunur, lakin metod PZR texnologiyasına əsaslandığı üçün onun çatışmazlığı yalnız bilinən sayt mutasiyalarını aşkar etməkdir.
4. Real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR üsulu:
Ct dəyəri ilə mutasiyanı təyin etmək üçün PCR əsaslı aşkarlama üsuludur. Güclü spesifiklik, yüksək həssaslıq, dəqiq kəmiyyət, asan əməliyyat və tam qapalı reaksiya üstünlüklərinə malikdir. Bir çox eksperimental qrup kolorektal xərçəngdə KRAS mutasiyalarının aşkarlanması üçün bu üsulu qəbul etmişdir. Birbaşa ardıcıllıq metodu ilə müqayisədə, kəmiyyət PCR həssaslıqda daha böyük üstünlük təşkil edir. İki üsulu müqayisə edən əksər alimlər kəmiyyət PCR-nin daha həssas olduğuna inanırlar. Liu Wei və başqaları. Kolorektal xərçəngin 280 KRAS gen mutasiyasının, 94 KRAS gen ardıcıllığı mutasiyasının aşkarlanması nəticələrinin ətraflı təhlilini aparmaq üçün iki üsuldan istifadə edilmişdir, müsbət nisbət 33.57% (94/280) təşkil etmişdir ki, bunlardan real vaxt flüoresansının kəmiyyət göstəricisi. PCR müsbət olub 91 halda həssaslıq 96.8% (91/94) olub. Yabanı tipli 186 gen ardıcıllığı hadisəsindən 184-ü real vaxt kəmiyyət PCR ilə mənfi olub, spesifikliyi 98.9% (184/186). Real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR metodu ilə birbaşa gen ardıcıllığı metodu arasında təsadüf nisbəti 98.2% təşkil etmişdir. İki aşkarlama metodunda hər mutasiya sahəsinin müsbət və mənfi təsadüf nisbətləri 90%-dən yuxarı idi və dörd sahənin təsadüf nisbəti 100%-ə çatdı. İki metodun aşkarlama nəticələri yüksək dərəcədə ardıcıl idi və bu, floresan kəmiyyət PCR-nin mutasiyaların aşkarlanması üçün daha etibarlı bir üsul olduğunu göstərir. Bununla belə, PCR-əsaslı üsullar məlum mutasiya növlərinə əsaslanan primerlər və zondlar dizayn etməlidir, buna görə də bütün mümkün mutasiyalar aşkar edilə bilməz və yalnız xüsusi saytlar aşkar edilə bilər. Müəyyən bir sayt kitin aşkarlama diapazonuna daxil deyilsə, əslində mutasiya olsa belə, kitin nəticəsi hələ də mənfi olur. Bundan əlavə, kəmiyyət PCR-nin həssaslığı yüksək olsa da, yalançı pozitivlərin olub-olmaması hələ də DNT sıralama texnologiyası və ya KRAS mutasiyasının vəziyyəti ilə hədəflənmiş tədqiqatların effektivliyi arasındakı əlaqəni təsdiqləmək üçün böyük nümunə ölçüləri ilə retrospektiv və perspektivli klinik təcrübələrlə yoxlanılmalıdır. narkotik . Buna görə də, mutasiya aşkarlanmasının yüksək həssaslığı kor-koranə təqib edilməməli, aşkarlanmanın spesifikliyi və dəqiqliyi isə nəzərə alınmamalıdır. Müxtəlif laboratoriya şəraitində, nümunələrdə mutasiyaların aşkarlanması üçün optimal üsul da fərqli ola bilər. Daha yüksək nisbətdə mutasiya olan nümunələr üçün Sanger sıralama metodu gen mutasiyalarını aşkar etməkdə daha yüksək dəqiqliyə malikdir, daha az mutasiya nisbətinə malik nümunələrdə isə Sanger ardıcıllıq metodu yalançı neqativlər baş verə bilər və texniki platforma kimi flüoresan PCR istifadə edən aşkarlama metodu yüksək həssaslıqla xarakterizə edilə bilər.
5. HRM metodu:
Bu, son illərdə daha çox istifadə edilən gen aşkarlama üsullarından biridir. Çirklənmənin qarşısını almaq üçün sadə, sürətli, həssas və tək boru üstünlüklərinə malikdir. Onun klinik sınaqlarda istifadəsinin məqsədəuyğunluğunu araşdırmaq üçün Liu Liqin və başqaları kolorektal xərçəngi olan 64 xəstədə KRAS gen mutasiyalarını aşkar etmək üçün HRM metodundan istifadə etdilər və sonra nəticələri yoxlamaq üçün birbaşa ardıcıllıqdan istifadə etdilər. HRM və birbaşa ardıcıllığın nəticələrinin ardıcıl olduğu aşkar edilmişdir. Birbaşa ardıcıllıqla müqayisədə, KRAS gen mutasiyalarının HRM ilə aşkarlanması sadə və dəqiqdir və bunun klinik sınaq üçün uyğun etibarlı bir üsul olduğunu göstərir. Chen Zhihong və başqaları. Onların həssaslığını qiymətləndirmək üçün KRAS mutant plazmidlərinin müxtəlif nisbətlərini ehtiva edən bir sıra qarışıq nümunələri sınaqdan keçirmək üçün HRM metodundan istifadə etdi. Məlum olub ki, qarışıq nümunələrdə plazmid mutasiyalarının nisbəti 10%, həssaslıq isə 10%-ə çatıb. Daha sonra üsul 60 kolorektal xərçəng toxuması nümunəsində KRAS gen mutasiyalarını aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir. Birbaşa ardıcıllıq metodu ilə müqayisədə HRM metodunun həssaslığı 100%, spesifikliyi isə 96% (43/45) olmuşdur. HRM metodunun dezavantajı ondan ibarətdir ki, spesifik mutasiya tipini və hansı kodonun mutasiyaya uğradığını dəqiq təmin etmək mümkün deyil. Ərimə əyrisində anormallıq aşkar edilərsə, mutasiya növünü təyin etmək üçün ardıcıllıq metoduna ehtiyac var. Harle tədqiqat qrupu floresan PCR, ARMS və HRM üsullarını müqayisə etmək üçün 156 kolorektal xərçəng toxumasından istifadə etdi. Nəticələr göstərir ki, üç üsul klinik sınaq üçün uyğun olsa da, HRM-nin etibarlılığı digər iki üsul qədər yaxşı deyil.
6. Digər üsullar:
Yuxarıda göstərilən üsullara əlavə olaraq, digər aşkarlama üsullarının tətbiqi öz üstünlükləri və mənfi cəhətləri var, məsələn, PCR-SSCP, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası, flüoresan PCR-optimallaşdırılmış oliqonukleotid zondu metodu, İç içə PCR və ARMS birləşməsi metodu, COLD-PCR metod və s. Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası güclü spesifikliyə malikdir, lakin nümunələrə tələbat böyükdür; PCR-SSCP aşağı qiymətə və qənaətcildir, lakin əməliyyat mürəkkəbdir; floresan PCR əsasında mutasiya aşkarlama texnologiyası güclü spesifikliyə, yüksək həssaslığa və dəqiq kəmiyyətə malikdir, Asan əməliyyat, tam bloklanmış reaksiya və digər üstünlüklərə malikdir, lakin bunların hamısı məlum mutasiya növünə uyğun olaraq primerlər və zondlar dizayn etməlidir, buna görə də yalnız xüsusi saytlar ola bilər. aşkar edilir və bütün mümkün mutasiyalar aşkar edilə bilməz.
3. Xülasə
Xülasə, müxtəlif laboratoriyalarda mutasiya yerləri və aşkarlama üsulları vahid olmadığı üçün analiz edilən şiş nümunələrinin ölçüsü və DNT çıxarılmasının keyfiyyəti də qeyri-bərabərdir, nəticədə laboratoriyalar arasında böyük və ya kiçik eksperimental nəticələrin mövcudluğu fərqlər, standartlaşdırma KRAS gen mutasiyasının aşkarlanması müxtəlif ölkələrdə narahatlıq doğuran klinik aşkarlama məsələsinə çevrilmişdir. Hazırda KRAS genində mutasiyaların aşkarlanması üçün bir çox üsullar mövcuddur. Yüksəkdən aşağıya həssaslıq ARMS, pirosequencing, HRM, real-time kəmiyyət PCR və birbaşa ardıcıllıqdır. Klinik reallıqdan, aşağı həssaslıq kliniki müalicə üçün əlverişli deyil, lakin çox həssas üsullar aşkarlama spesifikliyinin azalmasına səbəb olacaq və lazımsız yanlış müsbət nəticələr yarana bilər və xəstənin sonrakı dərman rejiminə təsir göstərə bilər. Yuxarıdakı aspektləri nəzərə alaraq, FDA tərəfindən təsdiqlənmiş metodla birlikdə ARMS metodu tövsiyə olunur. Təbii ki, bazar nöqteyi-nəzərindən molekulyar diaqnostika məni vurğulamamalıdır
üsullar, lakin son düzgün nəticələrə diqqət yetirin. Fərqli laboratoriyalar faktiki vəziyyətə uyğun olaraq müvafiq sınaq üsullarını qəbul edə bilər, lakin yalnız yaxşı operator ixtisaslarına və daxili keyfiyyətə nəzarət sistemlərinə malik olduqda. Mövcud yerli laboratoriya mühiti şəraitində, standartlaşdırılmış PCR laboratoriyasında sınaq keçirmək və etibarlı laboratoriya sınaq keyfiyyətini təmin etmək üçün yerli və beynəlxalq otaqlararası keyfiyyətə nəzarət fəaliyyətlərində iştirak etmək lazımdır. Standartlaşdırılmış idarəetmə daimi nəticələri təmin etmək üçün zəruri şərtdir. Çində KRAS geninin klinik sınaqlarının birləşdirilməsinə və standartlaşdırılmasına, müxtəlif ehtiyaclara uyğun standartlaşdırılmış və standartlaşdırılmış sınaq proqramının yaradılmasına təcili ehtiyac var və bu proqram BRAF, PIK23450_3CA, EGFR və klinik molekulyar patoloji testini təşviq etmək üçün digər genlər.
