Teikenmiddels soos cetuximab en panitumumab is wyd in die kliniek gebruik as effektiewe terapeutiese middels vir kolorektale kanker. Kliniese data toon dat pasiënte met KRAS-mutasies geen noemenswaardige effek op hierdie monoklonale teenliggaammiddel het nie, en slegs wildtipe pasiënte kan daarby baat vind. Daarom word die KRAS geen mutasie status klinies beskou as 'n belangrike terapeutiese merker, wat 'n sterk korrelasie het met die prognose en behandeling effek van kolorektale kanker. Die 2009 National Cancer Comprehensive Network (NCCN) Kolorektale Kanker Kliniese Praktykriglyne bepaal dat alle pasiënte met metastatiese kolorektale kanker KRAS-geenmutasiestatus moet opspoor, en slegs KRAS-wildtipe word aanbeveel om EGFR-geteikende terapie te ontvang. In dieselfde jaar het die American Society of Clinical Oncology (ASCO) ook dieselfde kliniese behandelingsaanbevelings uitgereik as 'n molekulêre merker vir tumor-geteikende terapie, wat die belangrike leidende betekenis daarvan toon. Tans word KRAS genetiese toetse wyd klinies uitgevoer. Ons evalueer hoofsaaklik die huishoudelike KRAS geenmutasie opsporing metodes vir verwysing in kliniese seleksie.
1. Die positiewe tempo van KRAS geenmutasie in kolorektale kanker
In kolorektale kanker is die mutasietempo van die KRAS-geen so hoog as 35% tot 45%, en die hoërisiko-mutasieplek is kodons 12 en 13 op ekson 2, en daar is steeds skaars soos 61 en 146. Mutasie werf. Daar is baie opsporingsmetodes vir KRAS-geenmutasies, insluitend direkte volgordebepaling, hoë-resolusie smeltkromme-analise (HRM), pirosequencing, kwantitatiewe PCR, mutasie-amplifikasieblokstelsel (amplinc atio) refraktorymutasiestelsel (ARMS), beperkingsfragmentlengte-polimorfisme (RFLP), polimerase kettingreaksie-enkelstreng-konformasie-polimorfisme-analise (PCR-enkelstreng-konformasie-polimorfisme (PCR-SSCP), ko-amplifikasie by laer denaturasietemperatuur PKR (KOUE-PCR) en hoë-prestasie vloeistofchromatografie-analise, ens.
2. Evaluering van KRAS mutasie opsporing metodes
1. Direkte volgordebepalingmetode: Dit is die mees klassieke metode om KRAS-geenmutasies op te spoor, en dit is ook die goue standaard vir die opsporing van geenmutasies. Die direkte volgordebepalingsmetode gebaseer op die beginsel van dideoksievolgordebepaling kan die verandering van geenvolgorde op die mees intuïtiewe wyse in die vorm van basispiekkaart wys. Die opsporingstipe is meer omvattend, en dit is ook die vroegste toegepaste mutasie-opsporingsmetode. Ten spyte van die opkoms van nuwe generasie volgordebepalingsplatforms, gebruik vakkundiges tuis en in die buiteland steeds die resultate van direkte volgordebepaling as 'n skaal om die betroubaarheid van die nuwe metode te meet en te bepaal. Gao Jing et al. Direkte volgordebepaling toegepas op die opsporing van KRAS- en BRAF-geenmutasies in 966 pasiënte met kolorektale kanker. Dit is ook die ontleding van die KRAS-geenmutasie met die grootste huishoudelike monster wat in die literatuur gerapporteer is. Ling Yun en ander glo dat die direkte volgordebepalingsmetode die mees direkte en doeltreffende opsporingsmetode is om die mutasiestatus van elke geen te verstaan, wat die tipe mutasie kan verduidelik, veral vir die opsporing van onbekende mutasies. Alhoewel die sensitiwiteit van hierdie metode relatief laag is, kan dit verbeter word deur metodes soos mikrodisseksie om tumorselle te verryk. Die direkte volgordebepalingsmetode is ook toegepas op die KRAS-opsporing van groter steekproefgroottes in ander huishoudelike navorsingsgroepe. Laer sensitiwiteit is egter die grootste nadeel van direkte volgordebepaling. Te oordeel aan die resultate wat in China gerapporteer is, is die mutasie-opsporingskoers deur direkte volgordebepaling nie laag nie. Liu Xiaojing et al. Direkte volgordebepaling en peptied nukleïensuurklem PCR (PNA-PCR) vergelyk en gevind dat 43 gevalle van KRAS geenmutasies deur direkte volgordebepaling opgespoor is. Benewens hierdie mutasies, is PNA-PKR ook deur direkte volgordebepaling opgespoor. Tien mutasies is in die wilde tipe gevind, en voorstelle is gemaak om die wilde tipe pasiënte te bepaal deur PCR en die direkte volgordebepaling metode om die mutante pasiënte te bepaal. Qiu Tian et al. Het 131 kolorektale kankermonsters opgespoor deur fluoresserende PCR-geoptimaliseerde oligonukleotied-probemetode en direkte volgordebepalingsmetode, en die positiewe koerse van KRAS-geenmutasies was 41.2% (54/131) en 40.5% (53/131) . Bai Dongyu het ook die opsporingsensitiwiteit van verskillende metodes bespreek. Van die 200 kolorektale kankerpasiënte is 63 deur RT-qPCR-mutasies opgespoor, en die mutasie-opsporingskoers was 31.5%; 169 monsters is suksesvol opgevolg deur direkte volgordebepaling 50 gevalle van mutasie, mutasie opsporing koers 29.6%. Alhoewel die direkte volgordebepaling metode akkuraat, objektief en spesifiek die KRAS geenmutasiestatus kan opspoor, is die tekortkominge daarvan soos hoë tegniese vereistes, ingewikkelde operasieprosedures, maklik om kruisbesmetting te veroorsaak, en tydrowende en moeisame interpretasie van die resultate ook baie voor die hand liggend. Dikwels is daar geen volgordetoerusting nie, en die monster moet na die ooreenstemmende maatskappy gestuur word vir toetsing, wat lank neem en 'n hoë koste het, so dit het groot beperkings.
Pyrosequencing metode:
Pyrosequencing metode is ook 'n meer gerieflike metode vir KRAS geenmutasie opsporing in terme van volgorde sensitiwiteit, opsporing koste en tyd om te rapporteer. Die herhaalbaarheid van hierdie metode is beter. Volgens die verkrygde piekkaart Die kwantitatiewe studie van die mutasiefrekwensie van 'n sekere terrein en die vergelyking tussen die mutasiefrekwensies van verskillende terreine is met 'n oogopslag duidelik. In onlangse jare het Ogino et al., Hutchins et al. Het pyrosequencing-tegnologie gebruik om KRAS-mutasies te toets by pasiënte met groot monsters van kolorektale kanker. Die resultate dui daarop dat pyrosequencing-tegnologie 'n kragtige hulpmiddel is om pasiënte vir geteikende terapie te ondersoek. Tumor molekulêre diagnose het wye toepassingsvooruitsigte. Binnelandse geleerdes het ook pyrosequencing-tegnologie gebruik om KRAS-mutasies in kolorektale kanker klinies op te spoor, met goeie akkuraatheid en betroubaarheid. Hierdie metode het beter spesifisiteit en hoër sensitiwiteit. SundstrÖm et al. Vergelyk alleel-spesifieke PCR en pirosequencing in kliniese toepassings en gevind dat in 314 gevalle van KRAS mutasies in kolorektale kankerpasiënte, die spesifisiteit van pirosequencing beter was as dié van allele. PCR, en het goeie sensitiwiteit vir weefsels met 'n lae tumorsel-inhoud. Verdun die proporsie tumorselle tot 1.25% tot 2.5%. Pyrosequencing kan steeds mutasie seine opspoor. Wanneer die minimum inhoud van mutante allele in die monster 20% moet bereik om deur Sanger-volgordebepaling opgespoor te word, kan dit deur HRM-metode opgespoor word wanneer dit 10% bereik, en vir pirosequentiebepaling kan slegs mutasies met 5% opgespoor word. Allele. Ons het pyrosequencing gebruik om KRAS-mutasies op te spoor in 717 pasiënte met kolorektale kanker en het gevind dat die frekwensie van KRAS-mutasies 40.9% was. Die mutasietempo van kodon 12 was 30.1%, die mutasietempo van kodon 13 was 9.8% en die mutasietempo van kodon 61 was 1.0%. Ons het die weefsels met 'n hoër tumorinhoud verryk deur handmatige mikrodisseksie voor toetsing, wat die resultate meer betroubaar maak. Die metode het goeie sensitiwiteit en spesifisiteit, en is maklik om in die kliniese praktyk te ontwikkel. Die nadeel van pyrosequencing is die hoë koste van opsporing, en die proses van die voorbereiding van enkelstrengs DNA vir volgordebepaling van monsters is omslagtig. In die toekoms kan pyrosequencing gewy word aan die ontwikkeling van tegnologie vir direkte opsporing van dubbelstring PCR-produkte, wat die operasie aansienlik sal vereenvoudig. En effektief verminder die koste van volgordebepaling om omvattende bevordering van kliniese toetse te bereik.
3. ARMS metode:
Hierdie tegnologie gebruik primers om te onderskei tussen wilde-tipe en mutante gene, wh
ich is reeds in die 1980's aangemeld. Die grootste voordeel van hierdie metode is dat dit 'n sensitiwiteit van tot 1.0% het en mutante gene in monsters so laag as 1.0% kan opspoor. In ontwerp kan die lengte van die teikenproduk tot die grootste mate verkort word, en die probleem dat akkurate opsporingsresultate nie verkry kan word nie omdat die meeste van die DNA wat uit die paraffien-ingebedde weefselmonster onttrek word, gefragmenteer is. Hierdie tegnologie kombineer die intydse PCR-platform om geslote buiswerking tydens versterking te bereik. Die operasie is eenvoudig en vereis nie naverwerking van die produk nie, wat die kontaminasie van die versterkte produk tot die grootste mate kan vermy. Tans word die skerpioen-ARMS-metode wat skerpioensonde en amplifikasieblokmutasiestelsel kombineer, meer algemeen in die wêreld gebruik. Die kombinasie van die twee tegnologieë kan die sensitiwiteit en spesifisiteit van beide kante maksimeer. Gao Jie et al. Het hierdie metode gebruik om die KRAS-geenmutasiestatus by 167 pasiënte met kolorektale kanker op te spoor, wat daarop dui dat hierdie metode betroubaar en akkuraat is. Wang Hui et al. Ook ARMS gebruik om KRAS-mutasies op te spoor in 151 gevalle van formaldehied-gefixeerde en paraffien-ingebedde weefsels. In die Verenigde State gebruik die COBAS-stel (Roche) wat deur die FDA goedgekeur is vir kliniese toetsing van KRAS en die Therascreen RGQ-stel (Qiagen) gesertifiseer deur die Europese Unie In Vitro Diagnostics (CE-IVD) almal die ARMS-beginsel. Onder die algemene metodes is die ARMS-metode die sensitiefste en die koste is relatief redelik. Daarom gebruik 'n groot deel van die kliniese opsporing van KRAS-gene by die huis en in die buiteland die ARMS-metode, maar omdat die metode op PCR-tegnologie gebaseer is, is die tekortkoming daarvan dat dit slegs Bekende terreinmutasies opgespoor kan word.
4. Intydse fluoressensie kwantitatiewe PCR metode:
Dit is 'n PKR-gebaseerde opsporingsmetode om die mutasie volgens Ct-waarde te bepaal. Dit het die voordele van sterk spesifisiteit, hoë sensitiwiteit, akkurate kwantifisering, maklike werking en volledig geslote reaksie. Baie eksperimentele groepe het hierdie metode aangeneem vir die opsporing van KRAS-mutasies in kolorektale kanker. In vergelyking met die direkte volgordebepalingsmetode, neem kwantitatiewe PCR 'n groter voordeel in sensitiwiteit in. Die meeste geleerdes wat die twee metodes vergelyk glo dat kwantitatiewe PCR meer sensitief is. Liu Wei et al. Twee metodes gebruik om 'n gedetailleerde ontleding te maak van die opsporingsresultate van 280 gevalle van kolorektale kanker KRAS-geenmutasies, 94 gevalle van KRAS-geenvolgorde-mutasies, die positiewe koers was 33.57% (94/280), waarvan intydse fluoressensie kwantitatief PKR was positief 91 gevalle het 'n sensitiwiteit van 96.8% (91/94) gehad. Van die 186 geenvolgordebepaling wilde-tipe gevalle, was 184 negatief deur intydse kwantitatiewe PKR, met 'n spesifisiteit van 98.9% (184/186). Die saamvalkoers tussen intydse fluoressensie kwantitatiewe PCR-metode en direkte geenvolgordebepalingsmetode was 98.2%. In die twee opsporingsmetodes was die positiewe en negatiewe toevalsyfers van elke mutasieplek bo 90%, en die toevalsyfer van vier terreine het 100% bereik. Die opsporingsresultate van die twee metodes was hoogs konsekwent, wat dui op fluoresserende kwantitatiewe PCR Dit is 'n meer betroubare metode vir mutasie opsporing. PCR-gebaseerde metodes moet egter primers en probes ontwerp op grond van bekende mutasietipes, dus kan alle moontlike mutasies nie opgespoor word nie, en slegs spesifieke plekke kan opgespoor word. As 'n sekere werf nie by die opsporingsreeks van die kit ingesluit is nie, selfs al is daar eintlik 'n mutasie, is die kitresultaat steeds negatief. Daarbenewens, alhoewel die sensitiwiteit van kwantitatiewe PKR hoog is, of daar vals positiewes is, moet nog geverifieer word deur DNA-volgordebepalingstegnologie, of retrospektiewe en voornemende kliniese eksperimente met groot steekproefgroottes om die korrelasie tussen KRAS-mutasiestatus en die doeltreffendheid van geteikende dwelms. Daarom moet die hoë sensitiwiteit van mutasie-opsporing nie blindelings nagestreef word nie, terwyl die spesifisiteit en akkuraatheid van opsporing geïgnoreer moet word. Onder verskillende laboratoriumtoestande kan die optimale metode vir mutasie-opsporing in monsters ook anders wees. Vir monsters met 'n hoër proporsie mutasies, het Sanger-volgordebepalingsmetode 'n hoër akkuraatheid in die opsporing van geenmutasies, terwyl vir monsters met 'n laer proporsie mutasies, Sanger-volgordebepalingsmetode Vals negatiewe kan voorkom, en die opsporingsmetode wat fluoresserende PCR as die tegniese platform gebruik kan gekenmerk word deur hoë sensitiwiteit.
5. HRM-metode:
Dit is een van die meer algemeen gebruikte geen-opsporingsmetodes in onlangse jare. Dit het die voordele van eenvoudige, vinnige, sensitiewe en enkelbuis om besoedeling te vermy. Ten einde die uitvoerbaarheid van die gebruik daarvan in kliniese toetsing te ondersoek, het Liu Liqin en ander die HRM-metode gebruik om KRAS-geenmutasies by 64 pasiënte met kolorektale kanker op te spoor, en dan direkte volgordebepaling gebruik om die resultate te verifieer. Daar word gevind dat die resultate van HRM en direkte volgordebepaling konsekwent is. In vergelyking met direkte volgordebepaling, is die opsporing van KRAS geenmutasies deur HRM eenvoudig en akkuraat, wat daarop dui dat dit 'n betroubare metode is wat geskik is vir kliniese toetsing. Chen Zhihong et al. Het die HRM-metode gebruik om 'n reeks gemengde monsters wat verskillende proporsies van KRAS-mutantplasmiede bevat te toets om hul sensitiwiteit te evalueer. Daar is gevind dat die proporsie plasmiedmutasies in die gemengde monsters 10% was, en die sensitiwiteit het 10% bereik. Vervolgens is die metode gebruik om KRAS-geenmutasies in 60 kolorektale kankerweefselmonsters op te spoor. In vergelyking met die direkte volgordebepalingsmetode was die sensitiwiteit van die HRM-metode 100%, en die spesifisiteit was 96% (43/45). Die nadeel van die HRM-metode is dat dit onmoontlik is om die spesifieke mutasietipe en watter kodon gemuteer is akkuraat te verskaf. As 'n abnormaliteit op die smeltkurwe gevind word, is volgordebepalingsmetode nodig om die mutasietipe te bepaal. Die Harlé-navorsingsgroep het 156 gevalle van kolorektale kankerweefsel gebruik om fluoresserende PCR-, ARMS- en HRM-metodes te vergelyk. Die resultate dui daarop dat alhoewel die drie metodes geskik is vir kliniese toetsing, die betroubaarheid van HRM nie so goed is soos die ander twee metodes nie.
6. Ander metodes:
Benewens die bogenoemde metodes, het ander opsporingsmetodes hul eie voordele en nadele in toepassing, soos PCR-SSCP, hoë werkverrigting vloeistofchromatografie, fluoresserende PCR-geoptimaliseerde oligonukleotied probe metode, Metode van geneste PCR en ARMS kombinasie, COLD-PCR metode, ens. Hoëprestasie vloeistofchromatografie het sterk spesifisiteit, maar die vraag na monsters is groot; PCR-SSCP is laag in koste en ekonomies, maar die operasie is ingewikkeld; die mutasie-opsporingstegnologie gebaseer op fluoresserende PCR het 'n sterk spesifisiteit, hoë sensitiwiteit en akkurate kwantitatiewe , Maklike werking, volledig geblokkeerde reaksie en ander voordele, maar almal moet primers en probes ontwerp volgens die bekende mutasietipe, sodat slegs spesifieke plekke kan wees opgespoor, en alle moontlike mutasies kan nie opgespoor word nie.
3. Opsomming
Samevattend, omdat die mutasieterreine en opsporingsmetodes in verskillende laboratoriums nie eenvormig is nie, is die grootte van die gewasmonsters wat ontleed is en die kwaliteit van DNS-ekstraksie ook ongelyk, wat lei tot die bestaan van groot of klein eksperimentele resultate tussen laboratoriums. Verskille, die standaardisering van KRAS geen mutasie opsporing het 'n kliniese opsporing kwessie van kommer in verskeie lande geword. Tans is daar baie metodes om mutasies in die KRAS-geen op te spoor. Die sensitiwiteit van hoog na laag is ARMS, pyrosequencing, HRM, intydse kwantitatiewe PCR, en direkte volgordebepaling. Vanuit die kliniese werklikheid is lae sensitiwiteit nie bevorderlik vir kliniese behandeling nie, maar te sensitiewe metodes sal veroorsaak dat die opsporingspesifisiteit afneem, en onnodige vals positiewe resultate kan voorkom en die pasiënt se daaropvolgende medikasie regimen beïnvloed. Met inagneming van die bogenoemde aspekte, gekombineer met die metode wat deur FDA goedgekeur is, word die ARMS-metode aanbeveel. Natuurlik, vanuit 'n markperspektief, moet molekulêre diagnostiek my nie beklemtoon nie
thods, maar fokus op die finale korrekte resultate. Verskillende laboratoriums kan toepaslike toetsmetodes volgens die werklike situasie aanneem, maar slegs as hulle goeie operateurskwalifikasies en interne kwaliteitbeheerstelsels het. Onder die huidige huishoudelike laboratorium-omgewingstoestande is dit nodig om toetse in 'n gestandaardiseerde PCR-laboratorium uit te voer en deel te neem aan plaaslike en internasionale interkamer-gehaltebeheeraktiwiteite om betroubare laboratoriumtoetskwaliteit te verseker. Gestandaardiseerde bestuur is 'n noodsaaklike voorwaarde om konstante resultate te verseker. In China is daar 'n dringende behoefte om die kliniese toetsing van die KRAS-geen te verenig en te standaardiseer, en om 'n gestandaardiseerde en gestandaardiseerde toetsprogram volgens verskillende behoeftes te genereer, en hierdie program kan uitgebrei word na die opsporing van BRAF, PIK23450_3CA, EGFR en ander gene om kliniese molekulêre patologietoetsing te bevorder.
